獼猴原代腎小球系膜細胞分離提取培養(yǎng)與鑒定

劉瀟一，張春梅，張 磊，許 振，魏 琦，蔣海峰，董婷玉，楊雪枝，嚴尚學，常 艷，魏 偉

作者單位：安徽醫(yī)科大學臨床藥理研究所，抗炎免疫藥物教育部重點實驗室，抗炎免疫藥物安徽省協(xié)同創(chuàng)新中心，安徽醫(yī)科大學類風濕關節(jié)炎研究中心，合肥 230032

有報道[1]認為，大約10.8%的人群會受到腎臟疾病的影響。腎臟疾病主要損害的病理部位是腎小球，腎小球是腎組織中主要起濾過作用的單位[2]。腎小球系膜細胞(glomerular mesangial cells，GMCs)過度增殖是腎小球疾病(如腎小球腎炎、狼瘡性腎炎、糖尿病腎病等)的主要病理特征[3]。

腎小球主要由內(nèi)皮細胞、上皮細胞和GMCs組成。原代腎組織中細胞提取培養(yǎng)中，與內(nèi)皮細胞與上皮細胞相比，GMCs是較易生長的腎小球細胞，因為它們的生長需求最小，增殖能力較強[4]。目前已有對大鼠、小鼠、兔、人及豬的GMCs分離方法的報道[5]，但尚未見對獼猴原代GMCs分離方法的報道。有文獻[6]報道稱，可以利用小鼠腎臟進行GMCs培養(yǎng)，但其操作步驟繁瑣，利用50、100目和200目三道篩網(wǎng)才能篩出純度較高的腎小球組織。腎小球位于腎臟腎皮質(zhì)部位，小鼠腎皮質(zhì)部位小，需要足夠量的小鼠腎組織才能貼出GMCs[6]。人原代GMCs的提取方法也有報道[7]，但是取材較為困難(一般為胎兒的腎)。與其他實驗動物相比，獼猴與人類的遺傳基因、生理病理狀態(tài)以及免疫反應和新陳代謝具有高度的相似性，社會行為也與人類似，是基礎研究和臨床應用之間的一個理想轉化模型[8]。該研究結合已有的文獻報道，以及GMCs的生理特性和生長要求，成功建立了獼猴原代GMCs的分離培養(yǎng)方法，并對其進行鑒定和功能研究，為進一步研究提供實驗材料與工具。

1 材料與方法

1.1 實驗動物選取12只3～5歲普通級雄性實驗獼猴，體質(zhì)量為4～6 kg，飼養(yǎng)于安徽醫(yī)科大學臨床藥理研究所實驗動物中心。溫度:20～26 ℃；日溫差:≤4 ℃；相對濕度:40%～70%。晝夜交替滿足獼猴作息時間，飼料、水不受限制，通過瓜果蔬菜補充營養(yǎng)，定時為獼猴播放音樂及視頻，嚴格遵守動物福利標準。實驗動物購自旌德縣皖南獼猴馴養(yǎng)繁殖基地，生產(chǎn)許可證號：SCXK(皖)2020-001。實驗動物使用許可證號：SYXK(皖)2020-001。該實驗過程經(jīng)安徽醫(yī)科大學臨床藥理研究所動物倫理委員會批準(批準號：PT-2020-001)。

1.2 主要實驗試劑及儀器注射用鹽酸替來他明鹽酸唑拉西泮(舒泰50)購自上海維克有限公司；DMEM基礎培養(yǎng)基和胎牛血清(fatal bovine serum, FBS)購自以色列Biological Industries公司; 0.25%胰蛋白酶(含EDTA)購自上海碧云天生物技術研究所；小鼠腎小球系膜細胞系 SV40 MES 13 購自武漢普諾賽(Procell)生命科技有限公司；DAPI染色液和0.5%結晶紫水溶液購自北京索萊寶生物科技有限公司；CCK-8試劑盒購自合肥Biosharp公司；TNF-α購自美國 PeproTech公司；α-SMA(兔抗單克隆抗體，美國Proteintech公司)、GAPDH(兔抗單克隆抗體，美國Proteintech公司); Nephrin(兔多克隆抗體，美國affinity公司)抗體；Transwell小室均購自美國Corning公司；Ⅵ型膠原酶購自美國Sigma公司。DMi1型倒置生物顯微鏡：徠卡顯微系統(tǒng)(上海)有限公司；BX 53正置顯微鏡：日本OLYMPUS公司；Image Xpress Micro4型高內(nèi)涵細胞成像分析儀：美國Molecular Devcies公司； Infinite M1000 PRO多功能酶標儀：瑞士TECAN公司。

1.3 獼猴腎小球系膜細胞分離及培養(yǎng)方法

1.3.1動物麻醉與提取腎小球 獼猴在肌肉注射舒泰50(6 mg/kg)深度麻醉后，采取股動脈放血處死。獼猴處死后解剖，在超凈臺中沿腹部中線打開腹腔，無菌取出獼猴腎臟。利用預冷的無菌生理鹽水沖洗腎臟，去除腎組織中的血塊和血紅細胞，之后轉移至另一個空的無菌大皿中。利用無菌眼科剪、眼科鑷去除多余腎組織(如：腎盂和腎包膜)，利用無菌手術刀剖開腎臟，取一小塊腎皮質(zhì)。將腎皮質(zhì)放入無菌1.5 ml離心管中，利用無菌眼科剪剪碎腎皮質(zhì)，組織塊大小≤1 mm3；加入少量混有高糖DMEM的無菌生理鹽水混勻，利用巴氏吸管分次吸取剪碎的腎組織懸液放到重疊的2層紗網(wǎng)上(上100目，下200目)，利用5 ml注射器輕碾組織塊，同時利用無菌生理鹽水沖洗，直至組織塊發(fā)白；將200目紗網(wǎng)轉移到無菌大皿中，巴氏吸管吸取無菌生理鹽水反復反向沖洗200目紗網(wǎng)上碾碎的組織塊，收集沖下的組織塊，轉移至無菌15 ml離心管中。離心管低速離心5 min ，轉速1 000 r/min，之后棄去上清液，加入適量的無菌生理鹽水構成腎小球懸液，整個過程盡量控制在2～3 h之內(nèi)且保持無菌操作。

1.3.2腎小球活性鑒定及計數(shù) 取上述腎小球組織懸液90 μl，加入定量10 μl的0.4%臺盼藍溶液充分混勻，5 min后立即取10 μl滴于覆以蓋玻片的細胞計數(shù)板上，5×物鏡下觀察提取腎小球的數(shù)量、染色情況及有無脫去布曼囊，并進行腎小球計數(shù)。腎小球活性及濃度的計算公式[9]如下

1.3.3獼猴腎小球消化與接種腎小球 在腎小球懸液中分別加入不同濃度的Ⅵ型膠原酶(0.1 mg/ml 及0.2 mg/ml)和0.02 mg/ml Dnasel，分別放入37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中震蕩充分消化不同時間(10 min和15 min)，之后加入2 ml 20%FBS-DMEM培養(yǎng)液終止消化，充分混勻。再迅速以1 000 r/min轉速，離心5 min。盡量完全去除上清液，加入500 μl 20%FBS-DMEM培養(yǎng)液進行重懸。利用移液槍吸取適量重懸液至培養(yǎng)瓶中(盡量鋪滿瓶底)，同時輕輕晃動培養(yǎng)瓶使上述腎小球懸液均勻鋪在瓶底后，將培養(yǎng)瓶的培養(yǎng)面朝上放入37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中，使腎小球組織塊貼壁，4～5 h后再緩慢將細胞瓶翻面培養(yǎng)，并加入3 ml 20%FBS-DMEM培養(yǎng)液，使完全培養(yǎng)液浸潤，培養(yǎng)細胞。注意3 d內(nèi)勿晃動培養(yǎng)瓶，4 d采用半定量換液，目的是給貼壁腎小球組織適應環(huán)境；8 d首次全量換液并觀察腎小球細胞生長情況，之后每隔3 d全量換液1次，直至細胞鋪滿瓶底進行首次消化傳代。

1.3.4原代系膜細胞的傳代培養(yǎng) 往培養(yǎng)瓶內(nèi)加入適量0.25%胰蛋白酶(含EDTA)消化腎小球細胞(細胞以鋪滿瓶底為度，同時消化液應提前在室溫條件下進行復溫)，置于37 ℃、5% CO2恒溫培養(yǎng)箱中1 min后拿出，在倒置顯微鏡下觀察細胞形態(tài)變化(細胞回縮變圓)時加入完全培養(yǎng)液終止其消化。用移液槍吸取培養(yǎng)液，輕輕反復吹打培養(yǎng)瓶壁上的細胞，收集細胞懸液于15 ml離心管中，以 1 000 r/min 的轉速，離心5 min，棄去上清液，使用適量20%FBS-DMEM培養(yǎng)液重懸細胞。細胞計數(shù)板計數(shù)后，稀釋成適當密度接種于新的培養(yǎng)瓶中繼續(xù)培養(yǎng)。

1.4 獼猴原代系膜細胞的鑒定

1.4.1形態(tài)學觀察 倒置光學顯微鏡觀察并拍照記錄獼猴原代GMCs形態(tài)特征和生長狀況。

1.4.2免疫熒光鑒定 選擇狀態(tài)良好的GMCs(3～4代)種在鋪有無菌蓋玻片的24孔板中培養(yǎng)24 h，利用SV40 MES 13(小鼠系膜細胞系)做陽性對照，細胞密度約為50%～60%。加入PBS輕輕晃動洗滌3 min×2 次；加入預冷的4%多聚甲醛固定20 min，棄去，加入PBS輕輕晃動洗滌3 min×3 次；加入含0.5%BSA的PBS，室溫封閉30 min，棄去封閉液；分別在加入抗兔的Nephrin和α-SMA一抗(一抗?jié)舛葹? ∶100)，4 ℃過夜，加入PBS輕輕晃動洗滌3 min×3 次；加入594標記的山羊抗兔二抗(1 ∶1 000)37 ℃搖床賦予2 h，PBS輕輕晃動洗滌5 min ×3次；加入DAPI染細胞核，室溫搖床賦予8 min，PBS輕輕晃動洗滌5 min×3 次；摳片加入抗熒光淬滅劑，封片；熒光顯微鏡下觀察。

1.4.3Western blot法檢測蛋白表達 利用配置好的細胞裂解液提取本方法獲得的GMCs以及SV40 MES 13的蛋白，配制10%的SDS-PAGE凝膠，上樣電泳，轉移至PVDF膜上，利用TBST配制的5%脫脂牛奶37 ℃搖床封閉2 h，洗去牛奶后，用1 ∶1 000的兔抗Nephrin和α-SMA多克隆抗體或1 ∶1 000兔抗GAPDH抗體4 ℃ 條件下孵育過夜，1 ∶10 000兔二抗 37 ℃搖床孵育2 h，洗去二抗后，加入提前配置好的顯影液曝光，采用 Image J圖像分析軟件進行條帶灰度值分析，比較各組之間的差異。

1.5 獼猴腎小球原代系膜細胞功能實驗

1.5.1高內(nèi)涵檢測細胞增殖能力 0.25%胰蛋白酶消化細胞，20%FBS-DMEM培養(yǎng)液終止消化，并制備細胞懸液。細胞計數(shù)，以0.4×104個細胞均勻鋪入96孔板，利用10 ng/ml TNF-α刺激24 h[10]。96孔板用生理鹽水洗3次，每次3 min。 4%多聚甲醛固定30 min，并用生理鹽水清洗。加DAPI染核5～8 min，生理鹽水洗3次，加入適量生理鹽水，并用高內(nèi)涵成像系統(tǒng)拍照。

1.5.2CCK-8法檢測細胞生長活力 細胞制成懸液后，以0.4×104個/孔鋪入96孔板，饑餓處理之后24 h加10 ng/ml TNF-α。37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h，生理鹽水洗滌細胞。每孔加100 μl 20%FBS-DMEM完全培養(yǎng)液、10 μl CCK-8試劑繼續(xù)培養(yǎng)1～2 h后，利用酶標儀檢測其吸光度(λ=450 nm)。

1.5.3Transwell法檢測獼猴腎小球系膜細胞遷移能力 細胞制成懸液后，接種于24孔板，10 ng/ml TNF-α刺激24 h。消化細胞并將Transwell小室放入24孔板，上室加細胞懸液，下室加20%FBS-DMEM培養(yǎng)液。37 ℃、5%CO2恒溫培養(yǎng)箱中遷移24 h；將小室放入4%多聚甲醛固定30 min；并用生理鹽水清洗；含0.1%結晶紫的生理鹽水，染色20 min；顯微鏡下觀察拍照，每組隨機選取9個視野，統(tǒng)計遷移細胞數(shù)目。

1.5.4細胞劃痕實驗檢測獼猴腎小球原代系膜細胞遷移能力 取原代GMCs，24 h后融合率達100%后，用200 μl無菌槍頭垂直于孔板底部中央劃痕，棄去培養(yǎng)基，無菌PBS沖洗脫落細胞，10 ng/ml TNF-α刺激24 h，分別于0、24 h進行拍照，觀察劃痕愈合情況，計算劃痕愈合率。劃痕愈合率(%)=(0 h劃痕距離-24 h劃痕距離)/0 h劃痕距離×100%。

2 結果

2.1 腎小球提取條件的比較Ⅳ型膠原酶不同濃度和消化的時間，細胞最開始爬出的速度及狀態(tài)不同。3 d觀察0.1 mg/ml Ⅳ型膠原酶消化10 min的腎小球貼壁較多，0.2 mg/ml Ⅳ型膠原酶消化15 min的腎小球貼壁較少。7 d后0.2 mg/ml Ⅳ型膠原酶消化10 min，15 min和0.1 mg/ml Ⅳ型膠原酶消化15 min的腎小球細胞呈星形或紡錘形細胞數(shù)量較少，生長緩慢(圖1A～D)；0.1 mg/ml Ⅳ型膠原酶消化10 min的腎小球細胞生長狀態(tài)較好(圖1A)。21 d后0.2 mg/ml Ⅳ型膠原酶消化15 min的腎小球已無細胞生長，0.1 mg/ml Ⅳ型膠原酶消化15 min的腎小球細胞有較少的細胞生長；0.1 mg/ml Ⅳ型膠原酶消化10 min的腎小球細胞生長旺盛。

2.2 腎小球系膜細胞的形態(tài)學鑒定經(jīng)2種不同目數(shù)的紗網(wǎng)提取的腎小球用0.4%臺盼藍染色后于倒置顯微鏡下觀察顯示: 大部分腎小球均脫去布曼囊(腎小球中有細胞散出，但又不破碎)且不著色(圖2A)。原代培養(yǎng)的腎小球3 d后開始貼壁。應用倒置顯微鏡觀察顯示:培養(yǎng)7 d后腎小球周圍已有細胞移出，腎小球組織周圍出現(xiàn)梭形及星形或不規(guī)則形狀的細胞，細胞胞體中央有一清晰的卵圓形核，胞質(zhì)向外伸出數(shù)個長短不一的突起，處于指數(shù)增生期的細胞常呈放射狀(圖1A，圖2B)。21～28 d原代GMCs生長進入旺盛時期，不少地方的細胞匯合，且呈堆疊狀生長狀態(tài)(圖2C～D)。

2.3 原代腎小球系膜細胞Nephrin和α-SMA蛋白表達提取原代GMCs、SV40 MES 13蛋白，免疫熒光和Western blot法檢測細胞中Nephrin(相對分子量為 135 ku)和α-SMA(相對分子量為 42 ku)蛋白表達。結果顯示，分離培養(yǎng)得到的原代GMCs α-SMA表達水平與對照組SV40 MES 13 α-SMA蛋白表達相似；SV40 MES 13和原代GMCs均不表達Nephrin蛋白(圖3、4) 。

圖1 D7原代腎小球細胞生長情況 ×50

圖2 原代GMCs形態(tài)學

圖3 免疫熒光鑒定原代GMCs Nephrin；α-SMA蛋白表達 ×50

2.4 獼猴腎小球原代系膜細胞功能實驗

2.4.1TNF-α對獼猴原代腎小球系膜細胞活力以及增殖的影響 傳代后的GMCs均勻鋪在到96孔板中，10 ng/ml TNF-α刺激24 h后加CCK-8檢測λ =450 nm處的吸光度，與Control組相比,10 ng/ml TNF-α刺激組GMCs活力提高(圖5B)。圖5C和5D顯示高內(nèi)涵成像系統(tǒng)法檢測原代GMCs的增殖能力。根據(jù)細胞直徑最小到最大范圍和細胞熒光最弱到最強范圍設定軟件參數(shù)，減去背景熒光強度，統(tǒng)計分析所有細胞。導出的Excel表格，統(tǒng)計每組細胞的細胞總數(shù)，分析細胞的增殖能力。與Control組相比，原代GMCs經(jīng)TNF-α刺激后增殖能力增強(圖5A)。

圖4 Western blot法鑒定原代GMCs Nephrin、α-SMA蛋白表達

2.5 TNF-α對獼猴原代腎小球系膜細胞遷移的影響Transwell小室檢測原代GMCs遷移功能，利用結晶紫染色后，利用顯微鏡進行拍照觀察記錄。與Control組相比，TNF-α刺激后原代GMCs遷移數(shù)量顯著增多(圖6A)。對細胞進行計數(shù)統(tǒng)計分析可知，TNF-α刺激后原代GMCs遷移能力增強(圖6A)。劃痕實驗檢測結果顯示，與Control組相比，TNF-α刺激組劃痕愈合率增加(圖6B)，且差異有統(tǒng)計學意義。

3 討論

圖5 TNF-α對原代GMCs活力以及增殖的影響 ×50

圖6 TNF-α對獼猴原代腎小球系膜細胞遷移的影響 ×50

膠原酶法和組織黏附法是目前培養(yǎng)原代GMCs常用的方法。膠原酶消化法適用于大部分的實驗動物，然而組織黏附法只適用于幼年時期的動物，這對實驗動物的年齡有限制。本實驗利用組織黏附法貼獼猴原代GMCs，但是未見原代GMCs移出，所以結合以上原因，采取了膠原酶消化法獲取原代GMCs。由于不同動物適用的消化條件不同，所以課題組對比了幾種不同的消化濃度和時間，根據(jù)腎小球活性、貼壁數(shù)量、GMCs貼出的時間和GMCs傳代后的狀態(tài)，選出最適合獼猴原代GMCs的消化條件(0.1 mg/ml Ⅳ型膠原酶消化10 min)。根據(jù)以上結果可知Ⅳ型膠原酶消化濃度過大或者消化時間過長會導致腎小球活性降低，不容易貼出細胞，貼出的細胞生長速度緩慢。0.1 mg/ml Ⅳ型膠原酶消化10 min細胞生長旺盛，這與已有文獻報道的消化濃度相比較低，保持腎小球活性。之前小鼠提取腎小球過程中，需要利用三層篩網(wǎng)才能提取出較純的腎小球，但是本實驗采用了兩層篩網(wǎng)便提取出較純腎小球。在培養(yǎng)過程中，翻轉培養(yǎng)瓶的時間很重要，一般為4～5 h，若時間過短腎小球則未貼壁；過長則導致腎小球組織活性喪失。首次換液時間一般為3～4 d且為半定量換液，之后每天觀察GMCs的移出情況。由于適宜上皮細胞生長的血清濃度為5%，培養(yǎng)內(nèi)皮細胞通常需要額外加生長因子，體外培養(yǎng)要求條件與GMCs不同，且原代上皮細胞和內(nèi)皮細胞培養(yǎng)一般需要5～7 d傳代，而GMCs則需要21～30 d[11]。經(jīng)過以上條件篩選和形態(tài)學觀察，以及利用免疫熒光和Western blot法檢測特異性蛋白表達鑒定提取的GMCs符合實驗要求。本次實驗顯示，系膜細胞傳5～6代形態(tài)和功能便開始變化，不能支持后續(xù)實驗。

TNF-α是一種促炎細胞因子，主要由多種免疫細胞(如活化的巨噬細胞、T淋巴細胞和自然殺傷細胞)產(chǎn)生[12]，生理條件下，它具有顯著的抗病毒效應，維持機體穩(wěn)態(tài)的作用[13]。炎癥狀態(tài)下，TNF-α可以通過NF-κB通路導致GMCs功能發(fā)生改變[14]。所以本實驗選用TNF-α為刺激劑，檢測獼猴原代GMCs功能的變化，經(jīng)刺激后原代GMCs的增殖和遷移能力顯著增強，這提示獼猴原代GMCs提取成功。

GMCs是體外研究腎小球疾病的一個很好的實驗模型，它存在于腎小球毛細血管袢中，能維持腎小球濾過屏障功能。人類疾病的動物模型對于了解疾病的發(fā)生發(fā)展機制和治療干預方式至關重要。人類與非人類靈長類動物各個系統(tǒng)發(fā)育具有密切的聯(lián)系，并且與它們的生理有許多相似之處，例如高度相似的免疫系統(tǒng)以及相似的組織結構等[15]。之前無論是小鼠、大鼠、兔等動物原代GMCs，都難以完整體現(xiàn)人原代GMCs的生理病理功能。本研究以獼猴為實驗動物成功探索出非人靈長類動物GMCs的分離方法，并對GMCs的功能進行了鑒定，為研究腎臟相關疾病提供了一個體外細胞模型。