鹽度對(duì)湛江等鞭金藻生長(zhǎng)、脂肪酸及藻際菌群的影響

葉凌志 張 琳,2,* 田嬌嬌 楊永藝 徐繼林,2

(1 寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江 寧波 315211； 2 浙江省海洋生物工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室(寧波大學(xué))，浙江 寧波 315211)

海洋微藻種類繁多，營(yíng)養(yǎng)豐富，兼具易培養(yǎng)、易攝食等特點(diǎn)，被廣泛用作魚、蝦和雙殼貝類等水產(chǎn)養(yǎng)殖動(dòng)物的開口餌料[1-3]。尤其是海洋微藻富含的多不飽和脂肪酸(polyunsaturated fatty acid，PUFA)有利于提高水產(chǎn)動(dòng)物幼體的生長(zhǎng)速率、成活率和變態(tài)率，是評(píng)價(jià)餌料微藻的重要指標(biāo)之一[4]。湛江等鞭金藻(Isochrysiszhanjiangensis)是一種海洋真核單胞藻，無(wú)細(xì)胞壁，易擴(kuò)繁，其作為優(yōu)質(zhì)餌料微藻之一已得到廣泛應(yīng)用[5]。

海洋微藻生長(zhǎng)和脂肪酸積累受多種環(huán)境因子影響，而鹽度是其中之一[6-7]。Salehipour-Bavarsad等[8]探究了不同鹽度(0.5～2.5 mol·L-1NaCl)培養(yǎng)基對(duì)杜氏藻(Dunaliellapseudosalina)的影響，結(jié)果顯示2.5 mol·L-1NaCl下其生物量最高且棕櫚酸和α-亞麻酸顯著積累。據(jù)Canavate等[9]報(bào)道，巴夫藻(Diacronemavlkianum)在鹽度20時(shí)生物量最高；在鹽度5、20和35時(shí)脂肪酸組成差異不大；在鹽度50時(shí)部分PUFA含量顯著提高，而飽和脂肪酸(saturated fatty acid，SFA)含量顯著下降。類似地，對(duì)舟形藻(Naviculasp.)施以鹽度脅迫(鹽度45)可有效提升其PUFA含量[10]。目前，光照、氮濃度、磷濃度等對(duì)湛江等鞭金藻生長(zhǎng)及脂肪酸組成的影響均有報(bào)道[11]，而鹽度鮮有涉及。

近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)藻際菌群自身的生長(zhǎng)及其胞外分泌物會(huì)影響微藻生長(zhǎng)和代謝活動(dòng)[12]。Koedooder等[13]發(fā)現(xiàn)不同底棲硅藻的藻際菌群組成各異，呈現(xiàn)種屬特異性。Ling等[14]分析了包括2株微擬球藻(Nannochloropsisoceanica)、3株球等鞭金藻(Isochrysisgalbana)和2株假微型海鏈藻(Thalassiosirapseudonana)在內(nèi)的7株常見(jiàn)餌料微藻的藻際菌群組成，發(fā)現(xiàn)不同微藻間藻際菌群組成差異明顯，進(jìn)而將藻液中分離的海桿菌(Marinobactersp.)分別與7株餌料微藻進(jìn)行共培養(yǎng)，結(jié)果表明7株微藻的生長(zhǎng)均得到有效促進(jìn)。Krug等[15]將甲基桿菌(Methylobacteriumsp.)分別與空泡柵藻(Scenedesmusvacuolatus)和湖泊紅球藻(Haematococcuslacustris)共培養(yǎng)，顯著提高了微藻生物量，并促進(jìn)了微藻維生素和植物激素合成相關(guān)基因表達(dá)。Wang等[16]將從廢水中分離出的克雷伯氏菌(Klebsiellasp.)與蛋白核小球藻(Chlorellapyrenoidosa)共培養(yǎng)，顯著提高了蛋白核小球藻的生物量和脂質(zhì)含量。針對(duì)上述現(xiàn)象，有研究者推測(cè)，在藻菌共生系統(tǒng)中，藻類排放到環(huán)境中的天然有機(jī)物可被細(xì)菌分解為可溶性有機(jī)碳供藻類再度利用，同時(shí)細(xì)菌產(chǎn)生的CO2可被藻類吸收利用，提高藻類光合效率，進(jìn)而促進(jìn)其生長(zhǎng)代謝[12]。目前，只有少量研究涉及環(huán)境因子對(duì)藻際菌群的影響[17]，而鹽度對(duì)藻際菌群的影響尚鮮見(jiàn)報(bào)道。

鑒于此，本研究選取湛江等鞭金藻為研究對(duì)象，分析不同鹽度(12、18、24和30)下其生長(zhǎng)、脂肪酸組成及藻際菌群的差異，旨在解析鹽度與脂肪酸及藻際菌群之間的關(guān)系，為湛江等鞭金藻的培養(yǎng)方案優(yōu)化提供數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 藻種及培養(yǎng)條件

試驗(yàn)所用藻株為湛江等鞭金藻(編號(hào)FACHB-1750)，由中國(guó)科學(xué)院水生生物物種種質(zhì)庫(kù)提供。采用新鮮滅菌的大三號(hào)(NMB3#)培養(yǎng)基[18]，培養(yǎng)條件為溫度25℃、鹽度20、光照強(qiáng)度60 μmol·m-2·s-1、光暗比12 h:12 h。每日搖藻數(shù)次以防藻細(xì)胞貼附于瓶壁。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

培養(yǎng)湛江等鞭金藻至指數(shù)生長(zhǎng)中期，收集藻細(xì)胞，并分別轉(zhuǎn)移至4個(gè)不同鹽度(12、18、24和30)的新鮮NMB3#培養(yǎng)基中(編號(hào)IZ12S、IZ18S、IZ24S和IZ30S，開始半連續(xù)培養(yǎng)，即隔天更換體積新鮮NMB3#培養(yǎng)基(稀釋率50%)，且鹽度與更換前一致。每天測(cè)定藻液的細(xì)胞密度(OD750)和葉綠素?zé)晒鈪?shù)，以判斷藻液是否達(dá)到穩(wěn)定生長(zhǎng)狀態(tài)。達(dá)到穩(wěn)定狀態(tài)后，分別離心收集各組藻細(xì)胞進(jìn)行脂肪酸組成和藻際菌群分析。除鹽度外，溫度、光照和光暗比等均與原藻液一致。每組設(shè)置3個(gè)平行。培養(yǎng)基鹽度調(diào)節(jié)通過(guò)添加不同比例海水晶(保嘉X號(hào)，上海保嘉工貿(mào)有限公司)實(shí)現(xiàn)。

1.3 細(xì)胞密度測(cè)定

藻細(xì)胞密度測(cè)定采用分光光度法，使用UV-5200型紫外分光光度計(jì)(上海元析儀器有限公司)，以750 nm波長(zhǎng)下的吸光度值(OD750)反映藻細(xì)胞密度情況。

1.4 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測(cè)定

使用AquaPen-C AP 110-C手持式葉綠素?zé)晒鈨x(Photon Systems Instruments公司，捷克)測(cè)定葉綠素?zé)晒鈪?shù)。取一定量藻液置于儀器配套的樣品杯中，使用強(qiáng)飽和脈沖光(4 000 μmol·m-2·s-1)激發(fā)測(cè)定光系統(tǒng)II最大光化學(xué)效率(maximal photochemical efficiency,Fv/Fm)、有效光化學(xué)效率(effective photochemical efficiency,F′v/F′m)和非光化學(xué)淬滅系數(shù)(non-photochemical quenching,NPQ)[19]。測(cè)定Fv/Fm前，藻液樣品需暗處理15 min。測(cè)定F′v/F′m前，藻液樣品需光適應(yīng)處理15 min。

由儀器自動(dòng)測(cè)算得出

NPQ = (Fm-F′m)/F′m

(1)

式中，F(xiàn)m表示藻液樣品暗適應(yīng)15 min后的最大熒光產(chǎn)率，F(xiàn)′m表示光照下瞬時(shí)最大熒光。詳情遵照儀器說(shuō)明書。

1.5 脂肪酸提取與測(cè)定

脂肪酸提取依照Lepage等[20]的方法并適當(dāng)優(yōu)化。首先，將各組藻液離心(8 000 ×g5 min)收集各組藻細(xì)胞，冷凍干燥后得到藻粉。稱取10 mg藻粉，加入3 mL 2 mol·L-1KOH-CH3OH，渦旋震蕩后75℃溫育30 min。再加入1.5 mL 3 mol·L-1HCl-CH3OH，75℃溫育30 min。最后，將脂肪酸甲酯溶于色譜級(jí)正己烷中，低溫保存。脂肪酸組成測(cè)定使用7890B/7000C三重四極桿氣相色譜-質(zhì)譜分析儀(美國(guó)安捷倫科技公司)[21]。采用面積歸一法計(jì)算每種脂肪酸的相對(duì)百分含量。氣相色譜條件：進(jìn)樣口溫度250℃，載氣為高純氦，恒定流量0.80 mL·min-1，柱起始溫度140℃，保持5 min，以4℃·min-1升至240℃，保持20 min；采用分流進(jìn)樣，分流比1∶5，進(jìn)樣量1 μL，接口溫度250℃。質(zhì)譜條件：用電子轟擊電離源分析，電子能量70 eV，離子源溫度230℃，四極桿溫度150℃，選取SCAN模式，質(zhì)量掃描范圍40～600 m/z，溶劑延遲13.7 min。

1.6 16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序及數(shù)據(jù)分析

采用0.22 μm聚碳酸酯膜(Millipore，美國(guó))在無(wú)菌環(huán)境中對(duì)各組藻液依次進(jìn)行過(guò)濾，獲得藻際細(xì)菌，進(jìn)而將濾膜置于無(wú)菌離心管中，液氮速凍保存。采用CTAB法提取每組樣品的基因組DNA，并檢驗(yàn)其濃度和純度。后續(xù)的16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序由北京諾禾致源科技股份有限公司完成。采用帶有Barcode的特異引物341F：5′-C C T A Y G G G R B G C A S C AG-3′和806R：5′-G G A C T A C N N G G G T A T C T A AT-3′，對(duì)16S rDNA基因的V3～V4區(qū)域進(jìn)行PCR擴(kuò)增。對(duì)檢測(cè)合格的PCR產(chǎn)物，使用TruSeq? DNA PCR-Free Sample Preparation Kit建庫(kù)試劑盒(Illumina，美國(guó))構(gòu)建小片段文庫(kù)，進(jìn)而使用Illumina NovaSeq測(cè)序平臺(tái)對(duì)該文庫(kù)進(jìn)行雙末端測(cè)序。原始數(shù)據(jù)經(jīng)過(guò)Qiime軟件[22]拼接過(guò)濾后，利用Uparse軟件進(jìn)行操作分類單元(operational taxonomic units，OTU)聚類分析并注釋物種分類水平[23]。使用Qiime軟件和R軟件進(jìn)行Alpha多樣性指數(shù)組間差異分析和Beta多樣性指數(shù)組間差異分析。

1.7 統(tǒng)計(jì)分析

所有數(shù)據(jù)均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。采用SPSS 20軟件進(jìn)行單因素方差分析及差異顯著性分析(One-Way ANOVA，Tukey檢驗(yàn))，以P<0.05表示差異顯著。采用GraphPad Prism 7軟件制圖。

注: 不同小寫字母表示組間有顯著性差異(P<0.05)。下同。Note: Different lowercase letters represent the significant difference at 0.05 level. The same as following.圖1 不同鹽度組湛江等鞭金藻生長(zhǎng)狀況Fig.1 Growth of Isochrysis zhanjiangensis in different salinity groups

2 結(jié)果與分析

2.1 不同鹽度組生長(zhǎng)差異分析

圖1顯示了培養(yǎng)終點(diǎn)時(shí)不同鹽度組湛江等鞭金藻的細(xì)胞密度和葉綠素?zé)晒鈪?shù)。在本試驗(yàn)所設(shè)4個(gè)鹽度下，IZ18S組藻細(xì)胞密度最大，生長(zhǎng)速率最塊，顯著高于其他組；IZ12S和IZ24S組藻細(xì)胞密度無(wú)顯著性差異；IZ30S組藻細(xì)胞密度最小，生長(zhǎng)速率最慢，顯著低于其他組(圖1-A)。Fv/Fm和F′v/F′m2個(gè)參數(shù)的變化趨勢(shì)近似(圖1-B、C)，中低鹽度(12、18和24)下湛江等鞭金藻的Fv/Fm和F′v/F′m無(wú)顯著差異。鹽度30下，F(xiàn)v/Fm和F′v/F′m都處于最低值，顯著低于其他組。說(shuō)明鹽度30下湛江等鞭金藻光合效率受到了顯著抑制。由圖1-D可知，隨鹽度增加，湛江等鞭金藻中NPQ逐漸降低，且各鹽度組間差異顯著。NPQ值可反映植物將過(guò)剩光能耗散為熱能的能力，因此推測(cè)隨鹽度降低，湛江等鞭金藻中熱耗散增多。IZ12S組中NPQ最高，說(shuō)明鹽度12不利于湛江等鞭金藻光合作用，且該鹽度下采用熱耗散方式以保護(hù)藻細(xì)胞光合結(jié)構(gòu)的作用最明顯。

2.2 不同鹽度組脂肪酸組成分析

在培養(yǎng)終點(diǎn)，收集各組藻細(xì)胞測(cè)定脂肪酸組成，共鑒定出9種脂肪酸，其中飽和脂肪酸(SFA)3種，包括C14：0、C16：0和C18：0；單不飽和脂肪酸(monounsaturated fatty acid，MUFA)2種，包括C16：1和C18：1；多不飽和脂肪酸(PUFA)4種，包括C18：2、C18：3、C18：4和C22：6。C14：0、C16：0和C18：0均在IZ30S組中含量最高，顯著高于其他組(P<0.05)。C16：1在IZ30S組含量最低，顯著低于其他三組(P<0.05)。此外，C18：1、C18：2和C22：6在4個(gè)鹽度組間均無(wú)顯著差異。C18：3在IZ12S組中含量最高，與IZ18S組無(wú)顯著性差異，與IZ24S組和IZ30S組有顯著性差異。C18：4在IZ18S組中含量最高，與IZ24S組無(wú)顯著差異，與IZ12S組和IZ30S組差異顯著?？傮w而言，IZ12S、IZ18S和IZ24S組中SFA、MUFA和PUFA含量無(wú)顯著差異，而IZ30S組SFA含量顯著提高，MUFA和PUFA含量顯著降低。說(shuō)明鹽度30有利于飽和脂肪酸的積累，而不利于不飽和脂肪酸的積累。

表1 不同鹽度下湛江等鞭金藻脂肪酸組成Table 1 The fatty acid composition of Isochrysis zhanjiangensis treated with different salinities /%

2.3 不同鹽度組藻際菌群分析

2.3.1 OTU聚類分析 四組樣品的16S rDNA擴(kuò)增子測(cè)序結(jié)果經(jīng)拼接過(guò)濾處理后，平均每個(gè)樣品得到 65 866 條有效數(shù)據(jù)(effective tags)，平均有效數(shù)據(jù)占比為74%(表2)。OTU聚類分析結(jié)果采用花瓣圖展示(圖2)，結(jié)果顯示四組共有的OTU為106個(gè)，IZ12S組特有的OTU數(shù)量最多達(dá)163個(gè)，IZ18S、IZ24S和IZ30S組特有的OTU數(shù)量較少，分別為32、54和34個(gè)?？梢?jiàn)低鹽(12)下湛江等鞭金藻藻際菌群豐富度較高，中高鹽度(18、24和30)下湛江等鞭金藻藻際菌群豐富度較低。

圖2 各組樣品獲得的OTU數(shù)量花瓣圖Fig.2 Flower diagram of OTU amount obtained in each group

2.3.2 Alpha多樣性分析 Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)反映了各組組內(nèi)菌群的豐富度。如表2所示，IZ12S組Chao1指數(shù)和ACE指數(shù)均顯著高于其他三組，即菌群豐富度最高；而IZ18S、IZ24S和IZ30S之間無(wú)顯著差異，且菌群豐富度較低。Shannon指數(shù)不僅反映菌群豐富度，還可表征菌群均勻度，用于綜合分析各組內(nèi)菌群多樣性。由Shannon指數(shù)可知，IZ12S組內(nèi)菌群多樣性最高，顯著高于其他組；IZ18S、IZ24S和IZ30S組之間無(wú)顯著差異，且多樣性低。綜上，由Alpha多樣性分析可知，四組樣品在組內(nèi)菌群多樣性比較上可分為2個(gè)水平。IZ12S組中菌群的多樣性顯著高于其他組；IZ18S、IZ24S和IZ30S之間無(wú)顯著差異，且菌群多樣性低。

2.3.3 Beta多樣性分析 基于Weighted Unifrac距離對(duì)四組樣品進(jìn)行主坐標(biāo)分析(principal ca-ordinates analysis, PCoA)，如圖3所示。不同形狀的點(diǎn)代表不同組，點(diǎn)與點(diǎn)之間距離越近，表明菌群組成越相似。IZ18S、IZ24S和IZ30S三組樣品的代表點(diǎn)相對(duì)集中于坐標(biāo)軸1的正半軸，遠(yuǎn)離IZ12S組樣品的代表點(diǎn)，說(shuō)明中高鹽度(18、24和30)下湛江等鞭金藻的藻際菌群組成較為相似，與低鹽(12)條件下藻際菌群組成差異明顯。

2.3.4 藻際菌群組成分布情況分析 在門水平上(圖4-A)，菌群總體主要集中在變形菌門(Proteobacteria)和藍(lán)菌門(Cyanobacteria)。各組中優(yōu)勢(shì)菌不同，IZ12S組以變形菌門為優(yōu)勢(shì)菌,相對(duì)豐度占92.70%；其他三組以藍(lán)菌門為優(yōu)勢(shì)菌，其中IZ18S和IZ24S組中以藍(lán)菌門最多，占比近97%，IZ30S組次之，占比93.51%?？梢?jiàn)，對(duì)湛江等鞭金藻而言，鹽度12和鹽度≥18是差異明顯的生長(zhǎng)環(huán)境，可使其藻際菌群中的優(yōu)勢(shì)菌發(fā)生劇烈變化，與Alpha和Beta多樣性分析結(jié)果吻合。

表2 各組樣品獲得的有效數(shù)據(jù)及Alpha多樣性指數(shù)Table 2 Effective tags and Alpha diversity index obtained from each group of samples

圖3 基于Weighted Unifrac距離PCoA分析結(jié)果Fig.3 Analysis of PCoA based on Weighted UniFrac distance

在屬水平上(圖4-B)，IZ12S組中相對(duì)豐度占比最多的優(yōu)勢(shì)菌為短波單胞菌(Brevundimonas)，占比54.13%，其次是嗜鹽單胞菌(Halomonas)，占比36.98%。而IZ18S、IZ24S和IZ30S組因鑒定出來(lái)的是未分類的藍(lán)細(xì)菌，所以無(wú)法進(jìn)一步確認(rèn)具體屬水平的藍(lán)細(xì)菌種類。

3 討論

適宜的鹽度是保證微藻正常生長(zhǎng)代謝的前提，鹽度過(guò)高或過(guò)低都會(huì)影響其生長(zhǎng)[24-26]。同時(shí)，在微藻培養(yǎng)過(guò)程中，藻細(xì)胞本身代謝活動(dòng)亦會(huì)造成水體鹽度波動(dòng)[27]。因此，本試驗(yàn)采用半連續(xù)培養(yǎng)方式以維持藻液鹽度穩(wěn)定，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在鹽度12～24環(huán)境下，湛江等鞭金藻細(xì)胞密度和光合效率高于鹽度30組。而從NPQ結(jié)果看，鹽度12環(huán)境下湛江等鞭金藻通過(guò)熱耗散形式消耗更多光能。綜合來(lái)看，在鹽度18～24環(huán)境下湛江等鞭金藻生長(zhǎng)優(yōu)于鹽度12和鹽度30。藺紅蘋等[28]通過(guò)批次培養(yǎng)方式探究了湛江等鞭金藻的鹽度范圍，發(fā)現(xiàn)該藻可適應(yīng)鹽度范圍為10～30，且最適鹽度為23，與本試驗(yàn)結(jié)果稍有差異，推測(cè)是由藻株不同及培養(yǎng)方式不同導(dǎo)致的。

圖4 樣本在門水平(A)、屬水平(B)上的細(xì)菌類群相對(duì)豐度柱形圖Fig.4 The relative abundance of bacterial community in each sample at phylum (A) and genus (B)

一定范圍內(nèi)鹽度的改變不僅影響微藻生長(zhǎng)，還會(huì)影響其多種營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的積累。Haris等[29]研究表明，在鹽度10～40范圍內(nèi)，鹽度改變會(huì)造成球等鞭金藻蛋白質(zhì)、脂肪酸和碳水化合物含量發(fā)生顯著變化。在眾多營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)中，脂肪酸尤其是PUFA可提高水產(chǎn)動(dòng)物存活率、抗氧化能力和免疫功能等，是衡量餌料微藻營(yíng)養(yǎng)價(jià)值的主要指標(biāo)[30-31]。本試驗(yàn)表明，中低鹽度(12、18和24)下湛江等鞭金藻脂肪酸組成無(wú)顯著差異，鹽度30下SFA增加而PUFA降低。據(jù)Cepak等[32]報(bào)道，在0.2%～0.6% NaCl鹽度范圍內(nèi)，隨鹽度增加，小粗盤藻(Trachydiscusminutus)中SFA增加而PUFA降低，與本研究結(jié)果相近。Anitha等[33]研究表明，在高于正常海水鹽度下培養(yǎng)杜氏藻(Dunaliellasp.)會(huì)顯著提高其PUFA含量，與本研究結(jié)果相悖。推測(cè)是由于不同種類微藻在各自相對(duì)高鹽的環(huán)境下有著不同的脂肪酸積累方式。值得注意的是，總體上，本試驗(yàn)中低鹽度(12、18和24)下湛江等鞭金藻細(xì)胞密度、葉綠素?zé)晒鈪?shù)和脂肪酸組成均較為接近，而鹽度30下與其他三組差異顯著，可見(jiàn)脂肪酸組成的變化是湛江等鞭金藻響應(yīng)不適環(huán)境變化的方式之一。類似現(xiàn)象在前人研究中已有多次報(bào)道，如Pugkaew等[34]研究發(fā)現(xiàn)，鹽度30和60下瑞典四爿藻(Tetraselmissuecica)脂肪酸組成無(wú)顯著差異，且細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)均保持良好；Arora等[35]也發(fā)現(xiàn)，在試驗(yàn)設(shè)定的3種鹽度(8.75、17.5和35 g·L-1NaCl)下，柵藻(Scenedesmussp.)保持了相近的生長(zhǎng)狀態(tài)和脂肪酸組成；而鹽生杜氏藻(Dunaliellasalina)和普通小球藻(Chlorellavulgaris)在受到鹽度脅迫后，其脂肪酸組成顯著改變[36]。此外，除繁殖速度快以外，優(yōu)質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)組成也是衡量微藻餌料價(jià)值的重要標(biāo)準(zhǔn)之一。眾所周知，PUFA是餌料微藻重要營(yíng)養(yǎng)組成之一。本研究中，綜合生長(zhǎng)和脂肪酸組成，鹽度18和24組是湛江等鞭金藻生長(zhǎng)較好且PUFA占比最高的兩組，故鹽度18～24是該藻較為理想的培養(yǎng)鹽度選擇。

近年來(lái)，藻際菌群對(duì)微藻的影響逐漸引起研究者們的關(guān)注，但相關(guān)研究多集中在藻際菌群對(duì)微藻生長(zhǎng)[37]、特定代謝產(chǎn)物生產(chǎn)[38]及藻菌共生體凈化環(huán)境的潛力[39]等方面。而環(huán)境因子對(duì)微藻藻際菌群組成影響的研究相對(duì)較少，僅涉及溫度和氮磷濃度等[17,40]。鹽度對(duì)微藻藻際菌群組成影響的研究報(bào)道較少。本試驗(yàn)首次探索了不同鹽度下湛江等鞭金藻的藻際菌群，發(fā)現(xiàn)鹽度12下湛江等鞭金藻藻際菌群中優(yōu)勢(shì)菌為變形菌門，而其他三組中藻際優(yōu)勢(shì)菌為藍(lán)菌門，即鹽度變化會(huì)造成其藻際菌群中優(yōu)勢(shì)菌的劇烈變化。

前人研究已知，變形菌門是金藻中常見(jiàn)的藻際細(xì)菌[17,41]。本研究發(fā)現(xiàn)，鹽度12組中的變形菌門具體到屬水平上主要為短波單胞菌，而關(guān)于短波單胞菌對(duì)微藻影響的研究已有較多報(bào)道。Park等[42]從橢圓小球藻(Chlorellaellipsoidea)中分離得到短波單胞菌，兩者共培養(yǎng)后藻和菌的生長(zhǎng)都得到了促進(jìn)。Lakatos等[43]也報(bào)道從衣藻(Chlamydomonassp.)中分離出了短波單胞菌，且共培后可促進(jìn)衣藻產(chǎn)氫，說(shuō)明短波單胞菌有益于微藻生長(zhǎng)。另外，Kang等[44]研究表明短波單胞菌適于低鹽乃至淡水環(huán)境。由此推測(cè)，在本試驗(yàn)所設(shè)4個(gè)鹽度組中，鹽度12更利于短波單胞菌生存，故該鹽度下湛江等鞭金藻藻際細(xì)菌中短波單胞菌占比最大，而在另外三組中占比較少。而湛江等鞭金藻作為一種海水藻在鹽度12下取得了與鹽度24下相近的細(xì)胞密度，推測(cè)部分原因是短波單胞菌對(duì)該藻生長(zhǎng)的促進(jìn)作用。

藍(lán)細(xì)菌種類繁多，有淡水菌、中度耐鹽菌和嗜鹽菌等[45]。湛江等鞭金藻是海水藻，長(zhǎng)期以來(lái)與之共存的藍(lán)細(xì)菌所偏好的鹽度應(yīng)接近海水鹽度，而鹽度12不利于這些種類的藍(lán)細(xì)菌生存，故IZ12S組中藍(lán)細(xì)菌最少。藍(lán)細(xì)菌具有葉綠素a，能進(jìn)行光合作用，同時(shí)存在相當(dāng)一部分固氮藍(lán)細(xì)菌能通過(guò)固氮作用將分子氮轉(zhuǎn)化為植物能利用的氮素，進(jìn)而促進(jìn)植物生長(zhǎng)[46]。充足的氮源同樣是藻類生長(zhǎng)的必需要素之一[11]。本研究中湛江等鞭金藻在IZ18S和IZ24S組中藍(lán)細(xì)菌占比最高，可能是這兩組藻細(xì)胞生長(zhǎng)狀況良好的原因之一。另外，有研究表明，藍(lán)細(xì)菌在高鹽環(huán)境下可產(chǎn)生一系列胞內(nèi)相容性物質(zhì)(蔗糖、海藻糖、脯氨酸等)和胞外多糖(葡萄糖、甘露糖、半乳糖等)以應(yīng)對(duì)高鹽環(huán)境[47-49]。因此，本試驗(yàn)鹽度30下湛江等鞭金藻藻際菌群中藍(lán)細(xì)菌仍有很大占比。但是IZ30S組生長(zhǎng)狀況仍不及IZ18S和IZ24S組，可見(jiàn)藍(lán)細(xì)菌對(duì)藻細(xì)胞產(chǎn)生的積極作用尚不能抵消鹽度本身給湛江等鞭金藻帶來(lái)的傷害。此外，在屬水平上鑒定出的藍(lán)細(xì)菌都處于未分類狀態(tài)，故本試驗(yàn)暫不能明確上述藍(lán)細(xì)菌的種名，可在后續(xù)研究中進(jìn)一步探索。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)探索了不同鹽度對(duì)湛江等鞭金藻生長(zhǎng)、脂肪酸組成和藻際菌群組成的影響。結(jié)果表明，在試驗(yàn)所設(shè)4個(gè)鹽度組中，最利于湛江等鞭金藻生長(zhǎng)和PUFA積累的鹽度范圍為18～24。中低鹽度(12、18和24)下湛江等鞭金藻的脂肪酸組成無(wú)顯著變化，鹽度30下細(xì)胞密度顯著降低，且SFA含量升高，PUFA含量降低。鹽度12下湛江等鞭金藻藻際菌群的優(yōu)勢(shì)菌為變形菌門短波單胞菌屬，鹽度18、24和30下則為藍(lán)菌門，即鹽度12和≥18對(duì)其是差異較大的生活環(huán)境，會(huì)造成藻際菌群中優(yōu)勢(shì)菌的劇烈變化。