褐斑病侵染下2,3-丁二醇-凹凸棒石復合制劑對草地早熟禾細胞壁組成物質(zhì)及細胞壁降解酶活性的影響

張露露 劉興菊 馬 源 馬暉玲,*

(1 甘肅農(nóng)業(yè)大學草業(yè)學院/草業(yè)生態(tài)系統(tǒng)教育部重點實驗室，甘肅 蘭州 730070； 2 青海大學畜牧獸醫(yī)科學院，青海 西寧 810016)

草地早熟禾(PoapraterrsisL.)作為全世界草坪建植的主要冷季性草種[1]，其種質(zhì)資源豐富，分布區(qū)域廣泛。草地早熟禾具有適應性強且綠期較長等特點，但其在濕熱適宜條件下極易感染褐斑病，葉片出現(xiàn)黃化、萎蔫現(xiàn)象，特別是修剪過的葉片頂端更容易受到病原菌侵入[2]。草坪草褐斑病是一種土傳真菌病害，主要由立枯絲核菌(Rhizoctoniasolani)侵染引起[3]，該病原菌常以菌絲形式侵入植物體內(nèi)，通過分泌毒素或細胞壁降解酶(cell-wall degrading enzymes, CWDE)來破壞植物細胞壁及中膠層結構，損傷細胞膜、細胞器等，從而引起機體內(nèi)部功能紊亂，導致病害發(fā)生[4]。有研究表明褐斑病在冷季型草坪上普遍發(fā)生，在濕熱的夏季時期，草坪發(fā)病率高達80%以上[5]。

使用傳統(tǒng)的化學藥劑防治，既污染當?shù)氐纳鷳B(tài)環(huán)境，又會增加植物的耐藥性，不符合現(xiàn)代生態(tài)可持續(xù)發(fā)展理念。植物根際益生菌(plant growth promoting rhizobacteria, PGPR)作為現(xiàn)代生態(tài)農(nóng)業(yè)的研究熱點，其作用主要是定殖于植物根系，優(yōu)先占領根際，促進生長素(indole acetic acid, IAA)、抗生素、鐵載體等的產(chǎn)生，促使植物健康生長[6]。PGPR的主導機制為誘導體系抗性(induced systemic resistance, ISR)，主要體現(xiàn)在應對病原菌入侵時，改變植物細胞壁結構，調(diào)整生理生化反應，合成防御病原菌的次生代謝物質(zhì)[7]，以抵御或減輕病原菌分泌產(chǎn)生的毒素和細胞壁降解酶對植物細胞壁、細胞膜的破壞程度。有研究表明揮發(fā)性化合物2,3-丁二醇(2,3-butanediol, 2,3-BD)及其同分異構體在PGPR誘導植物抗病性能提高方面發(fā)揮重要作用[8]。有研究發(fā)現(xiàn)2,3-BD誘導處理的匍匐剪股穎對褐斑病的防治效果優(yōu)于苯并噻二唑(benzothiadiazole, BTH)[9]。當2,3-BD濃度為250 μmol·L-1時，對試驗苗的誘抗作用最佳，而2,3-BD濃度為550 μmol·L-1時，對田間成熟草坪的防治效果最好，可顯著降低褐斑病的發(fā)生率[10]。因此，2,3-BD在提高植物抗病的廣譜性和實用性方面具有重要科學研究價值。

凹凸棒石(palygorsk, PAL)是一種富含鎂鋁硅酸鹽的粘土礦物，具有2∶1型的層狀結構，其內(nèi)部豐富的納米微型孔道使得PAL的內(nèi)比表面積達到600 m2·g-1，為吸附和容納物質(zhì)提供了充足空間[11]。研究表明，PAL不僅可以吸附重金屬離子和水分子，還能有效吸附醇、醛、烷烴類等大分子有機物質(zhì)，其中PAL對醇類物質(zhì)的吸附能力較強[12]。目前，在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)方面PAL主要被用作農(nóng)藥載體、肥料添加劑、包衣緩釋劑等[11,13]，但是化肥和農(nóng)藥對環(huán)境的污染極大，已不符合生態(tài)農(nóng)業(yè)可持續(xù)發(fā)展理念。

目前國內(nèi)外通用的植物免疫誘導劑普遍存在持效期短、誘導效果不佳、需要多次誘導等問題[14-15]，使得誘導劑在農(nóng)業(yè)產(chǎn)生中的使用效率明顯降低。結合PLA性質(zhì)推測，利用PAL的吸附性和黏結性將植物誘導劑與其作用形成復合型緩釋制劑，能夠提高對植物的誘導效果，從而彌補誘導劑的實用缺陷，但此類研究鮮有報道。鑒于此，本試驗通過2,3-BD誘導、2,3-BD-PAL復合誘導的方式，探究草地早熟禾葉片中細胞壁組成物質(zhì)及細胞壁降解酶活性在病原菌脅迫條件下的變化，旨在明確2,3-BD誘導、2,3-BD-PAL復合誘導對植物抗病能力的提升效果，以及PAL對2,3-BD的誘導效果影響，為2,3-BD與PAL復合誘導草坪草抗褐斑病的研究提供理論基礎，同時為其他誘導劑與PAL復合應用的有效開發(fā)利用提供新的研究方向。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

草地早熟禾品種：納蘇(Nassau)，購自北京克勞沃草業(yè)技術開發(fā)中心。

褐斑病病原菌：立枯絲核菌，購自中國科學院菌種保存中心。

植物誘抗劑：2,3-BD，購自西亞試劑(臨沂)。

凹凸棒石，購自蘭州沃迪受損土地修復與環(huán)境工程研究院，產(chǎn)地甘肅省臨澤縣，細度1 000目。

1.2 試驗方法

1.2.1 病原菌菌種制備 立枯絲核菌-馬鈴薯葡萄糖瓊脂(potato dextrose agar, PDA)培養(yǎng)基：1 000 mL自來水+200 g馬鈴薯，煮沸20 min，過濾，加自來水定容至1 000 mL，再加入20 g葡萄糖+15 g瓊脂粉，攪拌均勻，待完全溶解后，將液體分裝在500 mL錐形瓶中，在121℃滅菌鍋中滅菌26 min。滅菌完成后，在超凈工作臺中將培養(yǎng)基分倒在培養(yǎng)皿中。冷卻后，在培養(yǎng)基上接入立枯絲核菌，用石蠟封口膜封口。將其倒置培養(yǎng)于光照14 h·d-1、25℃，黑暗10 h·d-1、20℃的恒溫培養(yǎng)箱中，培養(yǎng)7 d。

病原菌菌種制備：參考Cortes-Barco等[16]的接菌物制備方法并改進。用無菌水完全浸泡500 g麥粒，隔夜，晾干水分后放置于240 mL組培瓶中，約占瓶體積1/2，加蓋封口膜，連續(xù)滅菌3次，冷卻后用打孔器打取立枯絲核菌-PDA生長物，接入麥粒組培瓶中，混勻后于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d。每天搖晃使麥粒充分被病原菌侵染，待麥粒充分長滿菌絲后，顏色呈現(xiàn)深褐色時，將其置于托盤中在通風處陰干，完全干燥后粉碎制成菌粉，放置在4℃冰箱備用。

1.2.2 育苗種植及試驗處理 種子清洗：將供試種子棄去雜質(zhì)和有蟲蝕及成熟度較低的種子，用無菌水侵泡5 h，乙醇(70%)浸泡1 min，次氯酸鈉(20%)浸泡15～20 min，用蒸餾水沖洗6～7次，至刺鼻酸味消失為止，將其放置于室內(nèi)，自然陰干。

育苗種植：將土壤、細沙、蛭石混合(1∶1∶1)在180℃烘箱中滅菌3 h，以充分殺菌，冷卻后裝入直徑為9 cm，高度為12 cm的豆?jié){杯中，約占1/2體積。將草地早熟禾種子均勻播散在豆?jié){杯中，每個杯中大約0.2 g種子，附沙浸水，蓋上保溫罩，置于恒溫培養(yǎng)室，培養(yǎng)條件為光照16 h 23℃黑暗8 h 20℃。

試驗處理：設置4組處理，分別為對照組(CK)：未誘導未接菌。處理組：(1)未誘導接菌。(2)2,3-BD誘導接菌：待幼苗生長30 d后，在每個重復中依次加入濃度為0.3 mmol·L-1的2,3-BD誘導劑30 mL，誘導培養(yǎng)7 d。(3)2,3-BD-PAL復合誘導接菌：在育苗種植時對每個重復施加2.63 g·kg-1PAL，將其均勻撒入混合土中攪拌，充分浸水，待幼苗生長30 d后，進行2,3-BD誘導處理。之后對3組處理的每個重復中都接入立枯絲核菌菌粉0.3 g，接菌時先噴濕葉片再將菌粉均勻撒播，保溫罩遮蓋，置于恒溫培養(yǎng)室。

1.2.3 生理指標測定 對接菌后不同處理的草地早熟禾葉片(對照正常生長)，按照0、3、7、15 d的時間點分別采樣。每個樣0.2 g，每個指標3個重復。用錫箔紙裝袋，封口，經(jīng)液氮冷凍后放置在-80℃下冷藏備用。用于測定纖維素、果膠、木質(zhì)素含量[17]。

1.2.4 細胞壁降解酶制備 參照李寶聚等[18]的研究方法，取草樣0.2 g于研缽中，加入2 mL 1 mol·L-1NaCl提取液(0.02 mol·L-1Tris-Hcl緩沖液，pH值7.4)，冰浴下研磨，勻漿在4℃、12 000 r·min-1條件下離心15 min，上清液即為酶液，于-20℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.5 酶活性測定 羧甲基纖維素酶(carboxymethyl cellulase, Cx)、β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase, β-Glu)、濾紙酶(filter paper enzyme, FPA)、多聚半乳糖醛酸酶(polygalacturonase, PG)和果膠甲基半乳糖醛酸酶(pectin methyl-galacturonase, PMG)活性采用3,5-二硝基水楊酸(3,5-Dinitrosalicylic acid, DNS)比色法測定[19-20]。果膠甲基反式消除酶(pectin methyl transeliminase, PMTE)和多聚半乳糖醛酸反式消除酶(polygalacturonic acid transeliminase, PGTE)活性測定參考李寶聚等[18]的方法。

酶蛋白濃度按照Bradford[21]的方法，以牛血清白蛋白為標準蛋白質(zhì)，用考馬斯亮蘭G-250顯色，在595 nm下比色測定，以牛血清白蛋白濃度為橫坐標，吸光度為縱坐標制作標準曲線，將測定樣品吸光度值帶入標準曲線計算酶液蛋白濃度。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用SPSS 19.0系統(tǒng)軟件分析數(shù)據(jù)，采用單因素ANOVA對多組樣本進行分析處理，Duncan’s新復極差法進行顯著性方差分析；采用Microsoft Excel 2010繪制圖表。

2 結果與分析

2.1 病原菌脅迫7 d時各處理組草地早熟禾葉片形態(tài)

如圖1所示，當接入病原菌7 d時，對兩組2,3-BD誘導處理的草地早熟禾葉片和未誘導處理進行比較觀察，能夠明顯看出未誘導處理的植株莖基部和葉基部存在大量白色的病原菌絲。而使用2,3-BD誘導和2,3-BD-PAL復合誘導處理的植株葉片上附著的菌絲數(shù)量相對較少，與未誘導處理相比植株發(fā)病率明顯降低。其中2,3-BD-PAL復合誘導處理的草株葉片，僅在莖基部存在少量枯葉，地上部葉片色澤保持嫩綠并生長旺盛，其誘導效果優(yōu)于2,3-BD單獨誘導處理。

2.2 病原菌脅迫下草地早熟禾葉片中細胞壁組成物質(zhì)變化

2.2.1 病原菌脅迫下草地早熟禾葉片中纖維素含量變化 如圖2所示，隨病原菌脅迫時間的延長，各處理組葉片中纖維素含量均先下降后上升。在脅迫3 d時，未誘導處理葉片中纖維素含量快速下降，相比CK低29.49%，之后隨脅迫時間的延長，其纖維素含量與CK之間保持顯著差異(P<0.05)。而兩組誘導處理的纖維素含量在整個病原菌脅迫期間均低于CK，但差異不顯著(P>0.05)。同時，在脅迫期間未誘導處理葉片纖維素含量低于兩組誘導處理，且與2,3-BD-PAL復合誘導處理之間存在較大差異。

2.2.2 病原菌脅迫下草地早熟禾葉片中果膠含量變化 如圖3所示，在無病原脅迫時，CK和各處理組葉片果膠含量之間無顯著差異(P>0.05)。當受到菌絲脅迫3 d時，兩組誘導處理的果膠含量快速上升，與CK相比分別顯著高19.68%和32.57%，之后保持穩(wěn)定。而未誘導處理的果膠含量隨脅迫時間的延長呈先上升后下降趨勢，但與CK相比無顯著差異(P>0.05)。在病原菌脅迫期間，兩組誘導處理葉片中果膠含量均高于未誘導處理，其中2,3-BD-PAL復合誘導處理與未誘導處理之間差異顯著(P<0.05)。

注：不同大寫字母表示同一處理不同接菌天數(shù)間差異顯著(P<0.05)；不同小寫字母表示同一接菌天數(shù)不同處理之間差異顯著(P<0.05)。下同。Note:Different capital letters indicate that the same treatment has significant differences in different time periods at 0.05 level. Different lowercase letters indicate significant differences between different treatments in the same time period at 0.05 level. The same as following.圖2 病原菌脅迫下草地早熟禾葉片中纖維素含量變化Fig.2 Changes of cellulose content in the leaves of Poa pratensis under pathogenic stress

圖3 病原菌脅迫下草地早熟禾葉片中果膠含量變化Fig.3 Changes of pectin content in the leaves of Poa pratensis under pathogenic stress

圖4 病原菌脅迫下草地早熟禾葉片中木質(zhì)素含量變化Fig.4 Changes of lignin content in the leaves of Poa pratensis under pathogenic stress

2.2.3 病原菌脅迫下草地早熟禾葉片中木質(zhì)素含量變化 如圖4所示，在病原菌脅迫初期，各處理組的草地早熟禾葉片中木質(zhì)素含量保持穩(wěn)定，無顯著差異(P>0.05)。脅迫7 d時，兩組誘導處理的木質(zhì)素含量上升較為明顯，其中2,3-BD-PAL復合誘導處理的木質(zhì)素含量積累最快，與CK相比顯著高17.08%，之后保持穩(wěn)定。而未誘導處理的木質(zhì)素含量與CK之間無顯著差異(P>0.05)。在脅迫15 d時，未誘導處理的木質(zhì)素含量低于CK，并與2,3-BD-PAL復合誘導處理、2,3-BD誘導處理之間存在顯著差異(P<0.05)。

2.3 病原菌脅迫下草地早熟禾葉片中纖維素酶活性變化

2.3.1 病原菌脅迫下草地早熟禾葉片中Cx活性變化 如圖5所示，在沒有病原菌入侵時，CK和各處理組的草地早熟禾葉片中Cx活性保持在一致水平。在接入病原菌后，各處理組葉片Cx活性均快速上升，并遠高于0 d，具有顯著差異(P<0.05)。在脅迫3 d時，各處理組Cx活性與CK相比依次高76.7%、65.5%和52.6%，差異顯著(P<0.05)。在脅迫7和15 d時，未誘導處理的Cx活性雖有降低，但均顯著高于兩組誘導處理。在脅迫后期，2,3-BD-PAL復合誘導處理的葉片中Cx活性與未誘導處理和2,3-BD誘導處理之間均存在顯著差異(P<0.05)。

圖5 病原菌脅迫下草地早熟禾葉片中Cx活性變化Fig.5 Changes of Cx activity in the leaves of Poa pratensis under pathogenic stress

2.3.2 病原菌脅迫下草地早熟禾葉片中β-Glu活性變化 如圖6所示，隨脅迫天數(shù)的延長，各處理組的草地早熟禾葉片中β-Glu活性均顯著高于CK(P<0.05)。在脅迫3 d時，各處理組的β-Glu活性與CK相比依次高83.1%、73.1%和64.3%，差異顯著(P<0.05)。在脅迫7 d時，未誘導處理的β-Glu活性下降，與2,3-BD誘導處理接近一致，在脅迫后期又升高，與兩組誘導處理之間差異顯著(P<0.05)。在脅迫7和15 d時，2,3-BD-PAL復合誘導處理的β-Glu活性顯著低于2,3-BD誘導處理(P<0.05)。

圖6 病原菌脅迫下草地早熟禾葉片中β-Glu活性變化Fig.6 Changes of β-Glu activity in the leaves of Poa pratensis under pathogenic stress

圖7 病原菌脅迫下草地早熟禾葉片中FPA活性變化Fig.7 Changes of FPA activity in the leaves of Poa pratensis under pathogenic stress

2.3.3 病原菌脅迫下草地早熟禾葉片中FPA活性變化 如圖7所示，在病原菌脅迫下，各處理組的草地早熟禾葉片中的FPA活性變化趨勢與Cx和β-Glu活性變化趨勢相似。在脅迫3 d時，各處理組的FPA活性與CK相比均差異顯著(P<0.05)，分別高64.7%、42.9%和36.3%。其中未誘導處理的FPA增加速度最快、含量最高，并顯著高于兩組2,3-BD誘導處理。在脅迫7 d時，2,3-BD誘導處理的FPA活性上升，并顯著高于未誘導處理(P<0.05)。在脅迫15 d時，未誘導處理的FPA活性與2,3-BD-PAL復合誘導處理相比具有顯著差異(P<0.05)。

2.4 病原菌脅迫下草地早熟禾葉片中果膠酶活性變化

2.4.1 病原菌脅迫下草地早熟禾葉片中PMG活性變化 如圖8所示，在病原菌脅迫3 d時，各處理組的草地早熟禾葉片中PMG活性均有顯著上升，與CK相比依次高39.23%、27.06%和20.13%。其中，未誘導處理的PMG活性增加量大。之后隨病原菌脅迫天數(shù)的延長，兩組誘導處理的PMG活性恢復降低，與CK一致，無顯著差異(P>0.05)。而未誘導處理的PMG活性在脅迫后期有小幅上升，與兩組誘導處理相比差異顯著(P<0.05)。

圖8 病原菌脅迫下草地早熟禾葉片中PMG活性變化Fig.8 Changes of PMG activity in the leaves of Poa pratensis under pathogenic stress

2.4.2 病原菌脅迫下草地早熟禾葉片中PG活性變化 如圖9所示，草地早熟禾葉片在沒有受到外界脅迫時，其體內(nèi)的PG活性維持在低水平條件下。在病原菌入侵3 d時，處理組的葉片中PG活性突增，與CK相比依次高89.1%、84.0%和75.5%，差異顯著(P<0.05)。在脅迫7和15 d時，未誘導處理的PG活性先降低再升高，與CK差異顯著(P<0.05)。同時2,3-BD-PAL復合誘導處理的PG活性顯著低于2,3-BD誘導處理。在脅迫15 d時，兩組誘導處理的PG活性與未誘導處理相比存在顯著差異(P<0.05)。

圖9 病原菌脅迫下草地早熟禾葉片中PG活性變化Fig.9 Changes of PG activity in the leaves of Poa pratensis under pathogenic stress

圖10 病原菌脅迫下草地早熟禾葉片中PGTE和PMTE活性變化Fig.10 Changes of PGTE and PMTE activities in the leaves of Poa pratensis under pathogenic stress

2.4.3 病原菌脅迫下草地早熟禾葉片中PGTE和PMTE活性變化 如圖10所示，在沒有病原脅迫時，CK和各處理組的草地早熟禾葉片中PGTE與PMTE的活性水平基本一致，均處于極低活性條件下。當接入病原菌后，各處理組的葉片中PGTE和PMTE活性變化與CK相比均無顯著差異(P>0.05)。在脅迫3 d時，處理組PGTE活性均低于CK，而PMTE活性與CK一致。在脅迫7和15 d時，未誘導處理的PGTE和PMTE活性均有所上升，并高于CK和兩組誘導處理，但差異不顯著(P>0.05)。在病原脅迫期間，兩組2,3-BD誘導處理的葉片中PGTE活性均低于CK，而PMTE活性與CK保持一致。

2.5 病原菌脅迫下草地早熟禾葉片中細胞壁降解酶活性比較

在病原菌脅迫期間，通過對草地早熟禾葉片中細胞壁降解酶活性的平均差值進行比較(圖11)，發(fā)現(xiàn)各處理組的草地早熟禾葉片在受到病原菌脅迫時，其體內(nèi)的Cx、β-Glu、PG、PMG和FPA活性均有升高，而PGTE和PMTE活性極低，變化不明顯。其中Cx活性增加量最大，β-Glu和PG活性相近，這3種酶活變化量均高于其他4種酶。因此，7種細胞壁降解酶的活性大小依次為Cx>β-Glu>PG>PMG>FPA>PGTE=PMTE。同時未誘導處理的葉片中Cx、β-Glu、PG、PMG和FPA活性均高于兩組誘導處理，并與2,3-BD-PAL復合誘導處理的酶活之間保持較大差異。在病害脅迫期間，2,3-BD-PAL復合誘導處理的葉片中酶活性整體低于2,3-BD誘導處理。

圖11 病原菌脅迫下草地早熟禾葉片中細胞壁降解酶活性比較Fig.11 Comparison of CWDE activity in the leaves of Poa pratensis under pathogenic stress

3 討論

3.1 病原菌脅迫下草地早熟禾葉片中細胞壁降解酶活性變化

病原菌在入侵寄主過程中，會分泌纖維素酶、果膠酶和蛋白酶等降解酶類以消解植物細胞壁結構，使其更好地定植于寄主細胞內(nèi)，進行侵染和擴展[4]。其中，Cx和β-Glu是纖維素酶的構成組分，其主要作用是將細胞壁中天然纖維素連續(xù)水解成小分子葡萄糖。果膠酶是一種多組分復合酶，其含量上升可使植物體果膠含量降解，組織解離并腐軟，促使植物衰老或死亡[22]。本研究中，隨病原菌脅迫時間的延長，各處理組的草地早熟禾葉片中3種纖維素酶活性變化趨勢基本相似，其中在病原脅迫3 d時，未誘導處理葉片的Cx、β-Glu和FPA活性快速上升到最大值，顯著高于兩組誘導處理，且2,3-BD-PAL復合誘導處理的酶活抑制效果優(yōu)于2,3-BD單獨誘導處理。各處理組的3種酶活變化幅度為Cx>β-Glu>FPA，說明Cx起主要降解作用。董國強等[23]報道立枯絲核菌產(chǎn)生的纖維素酶是一種典型的復合酶，能夠快速分解天然纖維素，且Cx活力最高，這與本研究結果相符。同時，本研究各處理組的4種果膠酶活性變化中，PG活性上升明顯，與3種纖維素酶活性變化趨勢相一致；PMG活性在病原脅迫3 d時增加顯著，之后有所恢復；PMET和PGET活性極低，對細胞壁降解作用不明顯。陳夕軍等[24]對水稻紋枯病研究中果膠酶活性變化的研究結果表明，立枯絲核菌分泌的果膠酶中PG活性最高，其次是PMG，而PGTE和PMTE活性很低，這與本研究結果一致。各處理組草株葉片中7種細胞壁降解酶的活性比較結果為Cx>β-Glu>PG>PMG>FPA>PGTE=PMTE。這表明菌絲在入侵草地早熟禾葉片期間會分泌出大量的Cx、β-Glu和PG，用于分解植物纖維素和果膠，使其快速侵入寄生細胞內(nèi)。

本試驗中，草株經(jīng)2,3-BD誘導處理后，其葉片中Cx、β-Glu和PG等酶的活性被有效抑制，延緩了組織病變過程。李燦嬰等[25]、劉晨霞等[264]分別使用茉莉酸甲酯(methyl jasmonate, MeJA)、酸性硫酸鈣(acidic calcium sulfate, ACS)預處理桃果后，發(fā)現(xiàn)青霉(Penicilliumexpansum)、匍枝根霉(Rhizopusstolonifer)菌絲生長被明顯抑制，β-Glu、Cx、PG、PMG、PGTE和PMTE等酶活性有效降低，病原菌致病力大大減弱，從而阻止了病斑的形成。這與本研究中2,3-BD的誘導效果相似，但其作用方式有所差異，2,3-BD并未通過直接抑制菌絲生長發(fā)揮作用，而是通過提高植物自身抗性來抵御病原菌的入侵[10]。但不同之處是，2,3-BD對立枯絲核菌生長無直接抑制作用，而是通過誘導提高植物自身抗性來抑制病原菌入侵[10]。與2,3-BD誘導相比，2,3-BD-PAL復合誘導進一步抑制了細胞壁降解酶活性升高，而2,3-BD誘導具有增強植株自身免疫力、構建細胞壁壘的作用[27]。由此推測，PAL能夠利用強勁吸附力將2,3-BD固定于根系土壤周圍，從而不斷構建堅固的細胞防御屏障。當外界病原物侵入機體時，其產(chǎn)生的抗性水平強于2,3-BD單獨誘導，從而更大幅度降低Cx、β-Glu和PG等酶對細胞壁的破壞程度。此外，本研究結果表明，纖維素酶Cx、β-Glu和果膠酶PG的活性變化趨勢一致，均在病害初期時快速上升，其中纖維素酶Cx活性變化幅度最大，在病原侵入和最初擴展過程中，起到主要的降解破壞作用。也有研究指出，立枯絲核菌產(chǎn)生的眾多細胞壁降解酶中，果膠酶最先產(chǎn)生，并大量分泌以助菌絲入侵寄主，纖維素酶后產(chǎn)生，參與病害擴展[28-29]，與本研究結果不一致，這可能與立枯絲核菌的不同融合群對寄主的侵染方式、寄主類型及菌絲侵染時期、侵染過程有關。

3.2 病原菌脅迫下草地早熟禾葉片中細胞壁組成物質(zhì)變化

纖維素作為植物細胞壁的骨架構成，通常由白色結晶態(tài)微纖絲聚集而成，其含量可達40%～70%[30-31]。果膠是細胞壁多糖組分，在控制細胞壁的多孔性、細胞間的黏連、細胞膨脹和病菌抗御等方面發(fā)揮重要作用[32]。本研究中，在病原菌入侵初期，未誘導處理葉片的Cx和β-Glu活性升高使得葉片中纖維素被快速降解，并在脅迫期間與CK保持顯著差異，而兩組誘導處理的纖維素含量下降范圍小，與CK間差異不顯著，其中2,3-BD-PAL復合誘導處理葉片的纖維素含量顯著高于未誘導處理。陳夢茵[33]研究發(fā)現(xiàn)三磷酸腺苷(adenosine triphosphate, ATP)處理能有效降低果膠甲基酯酶(pectin methylesterase, PE)、PG和Cx、β-半乳糖苷酶活性，抑制纖維素和半纖維素等細胞壁組分的降解，從而保護細胞壁結構。本試驗中，植株經(jīng)誘導后，有效降低了葉片中Cx和β-Glu活性，抑制纖維素的降解，這與前人研究結果一致。同時，兩組誘導處理的草地早熟禾葉片在受到病原菌刺激后，其體內(nèi)果膠含量快速升高，并與CK相比差異顯著，之后保持穩(wěn)定；而未誘導處理的葉片果膠含量變化范圍小，均低于兩組誘導處理，與2,3-BD-PAL復合誘導處理之間存在顯著差異。劉佩佩等[34]研究指出，果膠降解后會形成寡聚半乳糖醛酸(oligogalacturonides, OGs)，OGs能被受體快速識別，進而激活植物應激反應，促使果膠多糖合成以增強細胞壁的硬度和剛度。由此推測，本研究中葉片果膠含量升高的原因是，菌絲分泌的果膠降解酶使部分果膠降解為OGs，激發(fā)了機體應答反應，從而開啟代償過程，合成更多果膠，鞏固細胞結構?？傊?，草株經(jīng)2,3-BD-PAL復合誘導處理后，根系周圍中2,3-BD保持在高水平，當菌絲侵染時，2,3-BD誘導機體強烈反應，迅速激活防御體系，阻止纖維素降解，促進果膠生成，以加固細胞壁屏障，有效抵御菌絲入侵。同樣，劉興菊[17]研究發(fā)現(xiàn)，2,3-BD能使匍匐翦股穎葉片纖維素和果膠含量顯著增加，并能通過其相互作用增強細胞壁結構，降低病害發(fā)生率。這進一步證實了2,3-BD誘導能夠有效提高草坪草細胞壁的防御機能，阻止病原菌入侵。

木質(zhì)素是一種復雜的酚類聚合物，是植物次生細胞壁的構成物質(zhì)，賦予植物強度、硬度，是植物抵抗逆境和自我保護的重要結構屏障[35]。植物組織木質(zhì)化不僅構成纖維素降解酶的物理屏障，而且可以通過疏水、靜電和氫鍵作用與其形成無效吸附[36]，降低病原酶解效應。本研究中，在菌絲入侵前期，由于缺乏木質(zhì)素降解酶，使得各處理的草地早熟禾葉片中木質(zhì)素含量保持不變。在脅迫中后期，兩組誘導處理的木質(zhì)素含量上升明顯，而未誘導處理的木質(zhì)素含量與CK之間無明顯差異，并在脅迫后期顯著低于兩組誘導處理。鄒麗[37]研究表明，病原菌侵入后，植物體內(nèi)抗病信號分子SA、JA含量增加，并通過調(diào)控木質(zhì)素合成，增加機體對病原菌的抗性。本研究中，2,3-BD誘導后，植株木質(zhì)素含量明顯積累，增加了細胞壁木質(zhì)化程度，結合上述前人研究表明，外源誘導能夠更快增加抗病信號分子的表達量，合成木質(zhì)素以提高植物抗性。同時，PAL將2,3-BD在土壤中儲蓄固定，對植物體進行最大限度地誘導供給，高效積累木質(zhì)素，抵御菌絲入侵。此外，本研究中2,3-BD產(chǎn)生的ISR不同于水楊酸(salicylic acid, SA)介導的系統(tǒng)獲得抗性(systemic acquired resistance, SAR)，ISR誘抗過程中不產(chǎn)生病程相關蛋白(pathogenesisrelated genes, PR)，通過依賴于NPR1上調(diào)次生代謝產(chǎn)物合成相關酶基因表達，使機體免疫反應處于防御啟動狀態(tài)[38]。當2,3-BD-PAL復合誘導的植物，在面對病蟲害攻擊時能夠更快更精準地激活防御反應鏈，產(chǎn)生更強的抗性水平，對抗逆境傷害。同時2,3-BD誘導、2,3-BD-PAL復合誘導與病原菌刺激可能對植物產(chǎn)生雙重誘抗機制，既產(chǎn)生SAR又產(chǎn)生ISR，使機體中SA途徑和JA/ET途徑之間可能存在協(xié)同表達，共同增強植物抗病性[23]。

綜上，本研究結果表明在整個病害脅迫期間，未誘導處理的葉片中纖維素結構被病原分泌的Cx和β-Glu快速降解，果膠含量雖有增加，但木質(zhì)化程度低下，其葉片抵抗力明顯不及兩組誘導處理。而植物經(jīng)2,3-BD-PAL復合誘導處理后，可能利用PAL本身強大吸附性和黏結性，將2,3-BD進行吸附釋放，使之能夠持續(xù)性誘導植物抗性水平的不斷提升，更大程度上抑制菌絲的入侵，降低葉片中降解酶的活性，減輕病害發(fā)生率。尚千涵[39]通過對油菜經(jīng)濟性狀的研究發(fā)現(xiàn)，質(zhì)量分數(shù)15%的PAL包衣的磷酸二銨的緩釋效果好于單施磷酸二銨的處理，抗衰老及抗逆性能力顯著提升。王桂苓等[40]指出PAL能有效吸附肥料中部分N、P、K等，以延長并提高肥料利用率，促進植物營養(yǎng)生長，增強抗逆性。這些研究都表明PAL能夠利用其多孔性的晶體結構特點，將吸附的農(nóng)藥和肥料以S型曲線緩釋，既降低了農(nóng)藥化肥的用量和次數(shù)，又延緩了病害的發(fā)生。PAL與農(nóng)藥化肥配施與本試驗中PAL和2,3-BD復合誘導可能存在相似機理，均為緩釋增強作用，進一步驗證了PAL廣泛的應用價值。

4 結論

本研究中，草地早熟禾經(jīng)2,3-BD誘導處理后，其葉片中Cx、β-Glu和PG等酶的活性被有效抑制，延緩了組織病變過程。而2,3-BD-PAL復合誘導的植株在受到菌絲入侵時，能快速高效地促進果膠和木質(zhì)素積累，并減弱Cx和β-Glu酶對葉纖維素的降解作用，從而保障細胞壁結構的完整性，極大程度地提高植物對病害的防御能力。本研究僅在實驗室條件下驗證了2,3-BD與PAL對草地早熟禾的復合誘導效果，缺乏田間的理論研究。后期可在大田基礎上開展2,3-BD-PAL復合制劑對草坪草抗病性的誘導作用研究，為促進生態(tài)環(huán)境可持續(xù)發(fā)展提供理論依據(jù)。