一個(gè)MYO15A基因新的復(fù)合雜合位點(diǎn)突變導(dǎo)致先天性聾病例分析亓文晶1，2

王雅寧 于萌萌 張楠 張巍 古林濤

1 山東第一醫(yī)科大學(xué)(山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院)(濟(jì)南 250000)；

2 山東第一醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院(山東省千佛山醫(yī)院)耳鼻喉科；

3 山東省濟(jì)寧市鄒城市兗礦新里程總醫(yī)院； 4 廣州嘉檢醫(yī)學(xué)檢測(cè)有限公司

先天性聾是人類最常見(jiàn)的出生缺陷之一，在新生兒中的發(fā)病率可達(dá)1‰～3‰[1]。遺傳因素是引起先天性聾的最主要原因，根據(jù)我國(guó)聾病分子流行病學(xué)調(diào)查顯示，常見(jiàn)的耳聾相關(guān)基因主要有GJB2、SLC26A4、mtDNA12SrRNA及GJB3[2-4]。常染色體隱性非綜合征型聾(autosomal recessive nonsyndromic hearing loss, ARNSHL)在非綜合征型聾中約占80%，常見(jiàn)基因?yàn)椋篏JB2、SLC26A4、MYO15A、OTOF及CDH23[5]。

MYO15A基因自1995年發(fā)現(xiàn)至今已有200多個(gè)突變位點(diǎn)被報(bào)道并已證實(shí)與耳聾有關(guān)。本研究通過(guò)應(yīng)用高通量測(cè)序(高精度臨床外顯測(cè)序)對(duì)一個(gè)耳聾家系樣本進(jìn)行測(cè)序和分析，發(fā)現(xiàn)該家系的致聾突變?yōu)镸YO15A基因上C.3756+1G>A和C.4519C>T(p.R1507)構(gòu)成的復(fù)合雜合突變，其中C.4519C>T(p.R1507)突變?yōu)閲?guó)內(nèi)首次報(bào)道的MYO15A基因新的致病位點(diǎn)，報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1研究對(duì)象 研究對(duì)象為山東省千佛山醫(yī)院耳鼻咽喉科確診的1個(gè)常染色體隱性遺傳性聾核心小家系，包括1名子代雙側(cè)極重度聾患者(2歲，女)，2名表型正常雙親(母親24歲，父親26歲)。子代患者基本信息和體格檢查信息完整，聽(tīng)力檢測(cè)、前庭功能檢查、智力檢查、顳骨CT及顱腦、內(nèi)聽(tīng)道MRI及耳蝸水成像等影像學(xué)檢查結(jié)果完整，且都已簽署倫理知情同意書。

1.2研究方法

1.2.1高通量測(cè)序(高精度臨床外顯PLUS，由廣州嘉檢醫(yī)學(xué)檢測(cè)有限公司完成) 抽取該家系3人的外周靜脈血3～5 ml，以鹽析法提取基因組DNA，在Sim-100測(cè)定DNA濃度，經(jīng)質(zhì)檢合格后，進(jìn)行上機(jī)測(cè)序。使用高精度醫(yī)學(xué)外顯檢測(cè)試劑盒，結(jié)合Illumuna Nextseq 500(Illumuna，加利福尼亞，美國(guó))的高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)3份家系DNA樣本進(jìn)行5 177個(gè)OMIM上已知明確的致病基因的編碼區(qū)和已知致病的內(nèi)含子進(jìn)行捕獲測(cè)序，詳細(xì)步驟如下：①文庫(kù)構(gòu)建：經(jīng)Pre-Capture LM-PCR對(duì)純化后文庫(kù)進(jìn)行擴(kuò)增。等量混合文庫(kù)后，加入人類外顯子文庫(kù)進(jìn)行雜交，捕獲外顯子區(qū)域，再通過(guò) PCR擴(kuò)增富集捕獲后產(chǎn)物。擴(kuò)增后進(jìn)行上機(jī)測(cè)序，測(cè)序平臺(tái)為Illumuna Nextseq 500，讀長(zhǎng)模式為單端測(cè)序150 bp，每個(gè)樣本的平均測(cè)序深度至少為224 x。②測(cè)序后獲得的原始數(shù)據(jù)由Illumina basecalling Software 1.7進(jìn)行處理。③有效數(shù)據(jù)通過(guò)BWA (version 0.7.5, http://bio-bwa.sourceforge.net/bwa.shtml)在線軟件與人類參考基因組(genome GRCh37/hg19)對(duì)比得到目標(biāo)基因組序列，得到BAM格式的最初對(duì)比結(jié)果。BAM 文件再利用在線軟件Picard (version 1.96, https://sourceforge.net/projects/picard/files/picard-tools/1.96/)、GATK (version3.1-1, https://wiki.rc.usf.edu/index.php/Genome_Analysis_ToolKit_(GATK))與SAMtoolS (version0.1.18)進(jìn)行去重復(fù)、局部重對(duì)比和堿基質(zhì)量校正等處理。④使用GATK Haplotype Caller程序在目標(biāo)區(qū)域找出位點(diǎn)的基因型。使用GATK Variant Filtration過(guò)濾突變。

1.2.2高通量測(cè)序結(jié)果分析 測(cè)序結(jié)果經(jīng)生物信息學(xué)方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，對(duì)變異數(shù)據(jù)進(jìn)行質(zhì)控分析，檢索嘉檢內(nèi)部數(shù)據(jù)庫(kù)(http://opengk.com/)、dbSNP(單核苷酸多態(tài)性數(shù)據(jù)庫(kù))、ESP6500和ExAC(外顯子組整合數(shù)據(jù)庫(kù))等人群數(shù)據(jù)庫(kù)，標(biāo)注單核苷酸多態(tài)性和低頻良性變異。應(yīng)用預(yù)測(cè)軟件對(duì)變異的保守性、致病性和危害性進(jìn)行預(yù)測(cè)。檢索HGMD(人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù))、PubMed(美國(guó)國(guó)家生物信息中心開(kāi)發(fā)的基于WEB的生物醫(yī)學(xué)信息檢索系統(tǒng))、ClinVar(NCBI主辦的與疾病相關(guān)的人類基因組變異數(shù)據(jù)庫(kù))等數(shù)據(jù)庫(kù)，檢索變異相關(guān)文獻(xiàn)，分析文獻(xiàn)內(nèi)容，參考美國(guó)醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)和基因組學(xué)學(xué)會(huì)(ACMG)變異分類指南，對(duì)變異進(jìn)行分類，變異類型包括：錯(cuò)義、無(wú)義、同義、移碼、整碼、剪切等，篩選出最為可能的致病基因和突變進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.3Sanger測(cè)序驗(yàn)證 通過(guò)UCSC網(wǎng)站查找上述候選陽(yáng)性基因突變位點(diǎn)上下游序列，使用primer5設(shè)計(jì)特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，再通過(guò)瓊脂糖凝膠電泳法進(jìn)行分析，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行Sanger測(cè)序得到基因片段序列，最后將測(cè)序結(jié)果與參考基因組序列進(jìn)行比對(duì)，判斷該位點(diǎn)的具體突變情況。

2 結(jié)果

2.1家系臨床表現(xiàn)和遺傳特征分析 該家系為一個(gè)兩代常染色體隱性遺傳性聾的3人核心小家系，即兩名正常聽(tīng)力的父母及1名2歲患兒?；純撼錾鷷r(shí)聽(tīng)力篩查未通過(guò)，6月齡時(shí)復(fù)篩仍未通過(guò)，體格檢查及智力發(fā)育正常。影像學(xué)檢查示：顳骨CT、顱腦及內(nèi)聽(tīng)道MRI及耳蝸水成像無(wú)明顯異常，聽(tīng)力學(xué)檢查示：鼓室導(dǎo)抗圖為A型，聽(tīng)性腦干反應(yīng)(ABR)、聽(tīng)覺(jué)穩(wěn)態(tài)反應(yīng)(ASSR)顯示為雙側(cè)極重度感音神經(jīng)性聾，雙耳畸變產(chǎn)物耳聲發(fā)射(DPOAE)各頻率未引出。復(fù)習(xí)患兒病史及進(jìn)行體格檢查后排除了環(huán)境因素致聾的原因。

2.2高通量測(cè)序結(jié)果分析及突變基因變異位點(diǎn)驗(yàn)證 對(duì)患者樣本進(jìn)行高精度臨床外顯測(cè)序，綜合測(cè)序質(zhì)量和生物學(xué)信息分析，結(jié)合臨床癥狀發(fā)現(xiàn)MYO15A基因上發(fā)生2個(gè)復(fù)合雜合突變。為驗(yàn)證測(cè)序結(jié)果，對(duì)家系中3個(gè)樣本進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證(圖1)，發(fā)現(xiàn)患者攜帶MYO15A的復(fù)合雜合突變C.3756+1G>A和C.4519C>T (p.R1507*)；C.3756+1G>A這個(gè)剪切變異來(lái)源于父親，位于mRNA剪接區(qū)域，序列高度保守，并且多種計(jì)算輔助算法預(yù)測(cè)這個(gè)變異可能會(huì)影響蛋白功能。C.4519C>T(p.R1507*)無(wú)義變異來(lái)源于母親，該突變位于蛋白質(zhì)高度保守的區(qū)域，可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)合成提前出現(xiàn)氨基酸的終止密碼。母親攜帶雜合無(wú)義突變C.4519C>T(p.R1507*)，父親攜帶雜合剪切突變 3756+1G>A，這兩個(gè)變異在參考人群基因數(shù)據(jù)庫(kù)中頻率較低。結(jié)合送檢者的臨床表現(xiàn)和家系分析，依據(jù)美國(guó)ACMG變異分類指南[6,7]，這兩個(gè)變異為1類-致病突變，證據(jù)分別都為1個(gè)非常強(qiáng)證據(jù)PVS1(pathogenic very strong )，2個(gè)中等證據(jù)PM2(pathogenic moderate )和PM3。結(jié)合患兒極重度聾的臨床表現(xiàn)，推斷MYO15A基因上罕見(jiàn)變異C.3756+1G>A和C.4519C>T (p.R1507*)構(gòu)成的復(fù)合雜合突變?yōu)樵摶颊咧旅@原因，故該患兒可確診為常染色體隱性遺傳性聾。

圖1 MYO15A變異位點(diǎn)進(jìn)行Sanger測(cè)序驗(yàn)證

3 討論

MYO15A基因突變被認(rèn)為是常染色體隱性非綜合征型聾(ARNSHL)最常見(jiàn)的遺傳原因之一，至今已有700多個(gè)基因突變被報(bào)道，并已證實(shí)有200多個(gè)變異與疾病有關(guān)，并且變異涉及多種突變類型，其中包括無(wú)義突變、剪接、缺失、插入等(http://www.hgmd.cf.ac.uk/)。

MYO15A基因包含66個(gè)外顯子[8]，該基因?qū)е露@的臨床表現(xiàn)為學(xué)語(yǔ)前非進(jìn)行性重度-極重度全頻聽(tīng)力損失，無(wú)前庭癥狀。MYO15A 基因編碼的肌球蛋白XVa是一個(gè)含有3 530個(gè)氨基酸的大蛋白，是肌球蛋白(myosin)超家族中的一員。肌球蛋白超家族能夠與細(xì)胞骨架機(jī)動(dòng)蛋白絲結(jié)合，通過(guò)水解ATP生成能量從而產(chǎn)生運(yùn)動(dòng)。肌球蛋白XVa存在于人耳中，位于耳蝸及前庭毛細(xì)胞靜纖毛的頂端，負(fù)責(zé)機(jī)械-電信號(hào)的轉(zhuǎn)換[9]，能夠維持耳蝸毛細(xì)胞內(nèi)肌球蛋白組織結(jié)構(gòu)及毛細(xì)胞靜纖毛的伸長(zhǎng)，對(duì)維持人耳的正常聽(tīng)覺(jué)具有重要意義。

本研究對(duì)該家系進(jìn)行了高精度臨床外顯PLUS的檢測(cè)和分析，檢測(cè)到MYO15A基因的兩個(gè)雜合變異C.3756+1G>A和C.4519C>T(p.R1507*),測(cè)序結(jié)果顯示這個(gè)兩個(gè)變異分別遺傳自患者的父親和母親(均為雜合狀態(tài))，從而證實(shí)了該家庭中存在常染色體隱性遺傳性聾基因突變，考慮該家系生育耳聾后代的概率為25%。本研究中發(fā)現(xiàn)的C.4519C>T(p.R1507*)位點(diǎn)是MYO15A基因的新致病位點(diǎn)，目前僅2020年伊朗人群中有一例報(bào)道[10]，在我國(guó)尚屬首次報(bào)道。本結(jié)果豐富了我國(guó)遺傳性聾基因突變譜，對(duì)遺傳性聾的診斷提供了新靶點(diǎn)。

該患者為雙耳極重度感音性聾，為避免出現(xiàn)因聾致啞的情況，已進(jìn)行了雙側(cè)人工耳蝸植入術(shù)，術(shù)中監(jiān)測(cè)顯示雙耳神經(jīng)反應(yīng)遙測(cè)技術(shù)(NRT)反應(yīng)良好，術(shù)后開(kāi)機(jī)調(diào)試患兒適應(yīng)性較好，正常進(jìn)行聽(tīng)力及言語(yǔ)康復(fù)訓(xùn)練。目前認(rèn)為盡早進(jìn)行人工耳蝸植入是此類耳聾患者最有效的治療方式，尤其是對(duì)于小于3歲的學(xué)齡前重度及極重度聾兒童，人工耳蝸植入可有效地促進(jìn)其聽(tīng)力及言語(yǔ)能力的康復(fù)，幫助他們重返主流社會(huì)。此外，耳聾基因檢測(cè)技術(shù)的發(fā)展及普及，可有效避免耳聾家庭再次生育聽(tīng)障兒童，對(duì)優(yōu)生優(yōu)育工作有著不可替代的指導(dǎo)作用。