Johanson-Blizzard 綜合征的基因診斷及聽力語言康復(fù)△

曲春燕 王鋒 騰白玉 趙敏 葉紅 史泱 尹夢雅 梁鳳和 王曉力

1 國家兒童醫(yī)學(xué)中心，首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京兒童醫(yī)院保健中心(北京 100045)； 2 中國聽力語言康復(fù)研究中心； 3 山東省康復(fù)研究中心； 4 首都醫(yī)科大學(xué)附屬北京同仁醫(yī)院耳鼻喉科頭頸外科

根據(jù)耳聾是否伴隨其它臨床癥狀,分為非綜合征型聾和綜合征型聾,前者耳聾是唯一的臨床表現(xiàn),后者還伴有其他系統(tǒng)的異常,例如：Waardenburg綜合征、Usher 綜合征、Crouzon綜合征等。綜合征型聾約占耳聾的30%，常常伴有面部特征表型。由于綜合征型聾病種多、病例罕見、臨床表現(xiàn)復(fù)雜且表型重疊、遺傳異質(zhì)性高等特點(diǎn)，僅通過臨床特征性的表現(xiàn)進(jìn)行診斷，極易出現(xiàn)漏診或誤診。高通量測序技術(shù)(二代測序)因其高通量、高敏感性等優(yōu)勢成為鑒定綜合征型聾致病基因的主要研究手段，近幾年來全外顯子組測序和靶向目標(biāo)基因測序正逐步被應(yīng)用于臨床分子診斷領(lǐng)域。Johanson-Blizzard綜合征 (JBS) 是一種涉及多個系統(tǒng)結(jié)構(gòu)和功能異常的罕見癥候群，主要表現(xiàn)為胰腺外分泌功能不全、鼻翼發(fā)育不全、頭皮真皮發(fā)育不全、發(fā)育遲緩、耳聾、智力低下、牙齒發(fā)育異常、心臟和泌尿生殖器發(fā)育異常等，遺傳方式為常染色體隱性遺傳。相關(guān)文獻(xiàn)比較少，全世界只有不到100個病例報道[1]。本研究確診了一例Johanson-Blizzard綜合征患兒，通過患兒家系進(jìn)行全外顯子組測序，明確患兒的致病突變?yōu)閁BR1基因復(fù)合雜合突變c.3055C>T(p.Arg1019*)/ EX47 Del，并對患兒進(jìn)行了聽力語言康復(fù)訓(xùn)練，報告如下。

1 資料和方法

1.1研究對象 2019年12月就診于中國聽力語言康復(fù)研究中心的一例6歲聽力障礙男童及其聽力正常父母組成的核心小家系。對患兒體檢和家長進(jìn)行問診，填寫《耳聾病人信息登記表》，包括一般信息、出生史、耳聾發(fā)病年齡、家族史、個人史、體格檢查等，簽署基因檢測知情同意書。

1.2方法

1.2.1聽力測試 在本底噪聲≤30 dB A的標(biāo)準(zhǔn)隔聲室，測試對象雙耳純音聽閾和助聽聽閾。參考WHO(1997年)聽力損失分級標(biāo)準(zhǔn)(0.5、1、2、4 kHz四個頻率的平均聽閾)進(jìn)行分級。助聽后效果的評估根據(jù)言語香蕉圖法，將聽力補(bǔ)償效果按常規(guī)分為最適、適合、較適、看話[2]。

1.2.2耳聾基因檢測和分析方法 提取該家系成員外周靜脈血的基因組DNA，通過BJI V4芯片捕獲高通量測序，對人類基因組中約2萬個基因的外顯子區(qū)及臨近剪切區(qū)的DNA進(jìn)行捕獲和富集，使用MGISEQ-2000測序平臺進(jìn)行變異檢測。測序后獲得的原始數(shù)據(jù)經(jīng)過去接頭、去污染、去低質(zhì)量等步驟后，與人類參考基因組進(jìn)行比較，與OMIM數(shù)據(jù)庫收錄的明確致病相關(guān)基因進(jìn)行分析，同時對數(shù)據(jù)庫中無記載的突變使用SIFT、Polyphen等軟件對變異致病性進(jìn)行預(yù)測分析。

1.2.3多重qPCR和Sanger測序驗(yàn)證致病性變異位點(diǎn) 采用Sanger測序法對NGS檢測出的致病性點(diǎn)突變及微小缺失進(jìn)行驗(yàn)證，先證者及家屬均選擇 PCR 擴(kuò)增 Sanger 測序驗(yàn)證。通過多重qPCR分析方法對UBR1基因外顯子水平缺失與重復(fù)進(jìn)行驗(yàn)證。

1.2.4語言能力評估 本研究采用《聽障兒童語言能力評估標(biāo)準(zhǔn)及方法》(孫喜斌著)于聽力語言能力訓(xùn)練前及訓(xùn)練一年后對患兒進(jìn)行語言能力評估，包括：語法能力、理解能力、表達(dá)能力和交往能力，每項(xiàng)分四級，四項(xiàng)平均值對應(yīng)相應(yīng)的語言年齡。

2 結(jié)果

2.1臨床表現(xiàn) 出生史：該患兒系其母親29歲時自然受孕，孕40周催產(chǎn)后因?qū)m口打開進(jìn)程緩慢而進(jìn)行剖腹產(chǎn)，出生體重2 kg，身長47 cm。

消化系統(tǒng)異常：患兒因肛門閉鎖于出生后第二天進(jìn)行一次性肛門成型術(shù)，未造瘺，之后擴(kuò)肛訓(xùn)練1年。母乳喂養(yǎng)50天時因全身浮腫、臉色蒼白、低蛋白血癥診斷為胰腺功能不全，經(jīng)口服胰酶膠囊，完全水解蛋白奶粉替代母乳后癥狀緩解；目前大便每天一次或者兩天一次，陶土色，成條，偶爾有漏便情況；腹部CT和B超顯示胰腺組織被脂肪組織代替。

面容異常：雙側(cè)鼻翼對稱性缺失，鼻尖突出。雙眼內(nèi)眥贅皮，眼睫毛長。雙側(cè)耳廓大耳垂小，招風(fēng)耳。倒三角形臉型(圖1a和1b)。

皮膚毛發(fā)異常：患兒出生時頭頂有兩處皮膚沒有頭發(fā)，面積分別為(2.5 cm×4 cm，0.5 cm×0.5 cm)(圖1c)。頭發(fā)生長方向不同，朝不同方向生長，頭發(fā)顏色黑、濃密但是方向混亂;眼睫毛長;身體皮膚顏色白皙，左側(cè)大腿上部外側(cè)有一處淺棕色不均勻色素斑，大小約1 cm×2 cm。后頸部有一處色素斑，淺棕色，約0.3 cm×0.3 cm。雙手掌都有貫掌紋。

牙齒異常：乳牙畸形，恒牙缺失(圖 1a)。

圖1 患兒頭面部特征性表現(xiàn) a. 正面照,可見牙齒畸形,鼻翼發(fā)育不良,鼻尖突出,倒三角臉型;b. 側(cè)面照,可見鼻翼發(fā)育不良,耳廓大位置低,睫毛長;c. 頭頂中線上毛發(fā)缺失(邊界不規(guī)則,大小約2.5 cm×4 cm)

內(nèi)耳發(fā)育異常、聽力障礙和言語障礙：患兒出生時新生兒聽力篩查未通過，9月齡時外院檢測右耳氣導(dǎo)ABR閾值90 dB nHL,左耳100 dB nHL；根據(jù)視覺強(qiáng)化測聽、ABR測試結(jié)果患兒1歲半開始雙耳配戴助聽器；6歲時裸耳純音聽閾和助聽聽閾評估結(jié)果(圖2)顯示，雙側(cè)極重度感音神經(jīng)性聽力損失，右耳0.25～4 kHz助聽聽閾均在香蕉圖內(nèi)，助聽補(bǔ)償效果為最適；左耳0.25～2 kHz助聽聽閾在香蕉圖內(nèi)，助聽補(bǔ)償效果為較適；鼓室導(dǎo)抗圖均為A型；顳骨CT提示內(nèi)耳結(jié)構(gòu)發(fā)育異常，雙側(cè)內(nèi)聽道前后徑狹窄，雙側(cè)耳蝸頂中回融合，蝸軸可能缺如, 雙側(cè)前庭擴(kuò)大，雙側(cè)前后半規(guī)管發(fā)育不良，外側(cè)半規(guī)管變短(圖3)；語言年齡為3歲，落后于生理年齡。

圖2 患兒6歲時裸耳純音閾及助聽聽閾

智力水平中等偏下：使用專門針對聽障兒童的希-內(nèi)學(xué)習(xí)能力評估對患兒進(jìn)行智力評價，結(jié)果顯示：該患兒生理年齡6歲3個月，發(fā)育商80，離差智商83，智齡5歲，智力在同齡聽障兒童群體中處于中等偏下水平;其中,單項(xiàng)結(jié)果：穿珠子和折紙相當(dāng)于聽障兒童3歲6個月水平，搭積木相當(dāng)于4歲水平，在涉及手眼協(xié)調(diào)能力的項(xiàng)目上存在明顯落后；短期記憶力和完成圖畫相當(dāng)于6歲水平，略低于同齡聽障兒童平均水平；記顏色和看圖聯(lián)想能力較好，能夠達(dá)到同齡聽障兒童平均水平。

生殖系統(tǒng)異常：雙側(cè)睪丸下降到陰囊，陰莖短小。

生長發(fā)育遲緩： 出生之后體重一直增長緩慢，運(yùn)動發(fā)育遲緩，1歲會坐，兩歲會走;6歲時體重10.5 kg。隨訪至7歲體重11 kg，身高98 cm；7歲6個月體重12 kg，身高98 cm。

其他檢查結(jié)果：甲狀腺功能正常，染色體核型分析結(jié)果正常。

2.2遺傳學(xué)分析 先證者為一例男性6歲綜合癥型聾患兒，父母非近親結(jié)婚，聽力均正常 (圖4a)。全外顯子測序發(fā)現(xiàn)UBR1基因復(fù)合雜合突變c.3055C>T(p.Arg1019*)/ EX47 Del，通過多重qPCR和Sanger測序?qū)純汉透改溉齻€樣本進(jìn)行了驗(yàn)證，父母分別為兩個突變的攜帶者,母親攜帶雜合錯義突變c.3055C>T(p.Arg1019*)，父親攜帶雜合缺失突變EX47E Del，遺傳方式符合常染色體隱性遺傳，測序峰圖和qPCR結(jié)果見圖4b。

圖4 家系圖及基因檢測結(jié)果 a. 家系圖; b. c.3055C>T(p.Arg1019*)突變Sanger測序峰圖和EX47 Del突變qPCR結(jié)果

2.3語言能力評估 患兒6歲時會說“媽媽、爸爸、爺爺、奶奶、吃飯”雙音節(jié)詞和“小朋友、電視機(jī)”三音節(jié)詞。7歲時能說8～9字短句，為重復(fù)老師教過的內(nèi)容，自發(fā)語句字?jǐn)?shù)也有進(jìn)步，為4～5字。6歲到7歲一年間進(jìn)行了聽力語言康復(fù)訓(xùn)練，訓(xùn)練后語言能力評估提示：語法能力(模仿句長)由1歲提高到3歲，表達(dá)能力(看圖說話)由1歲提高到2歲，理解能力(聽話識圖)和交往能力(主題對話)無明顯變化，分別是4歲和2歲；語言發(fā)展的各個方面進(jìn)步不均衡，語言的理解好于語言的表達(dá)；語言年齡由2歲提高到3歲。

3 討論

JBS在1971年被Johanson和Blizzard正式發(fā)表并命名，特征表現(xiàn)為鼻翼發(fā)育不全、胰腺外分泌功能不全導(dǎo)致的營養(yǎng)不良、中線部分頭皮缺失、恒牙缺失、肛門閉鎖、個頭矮小、甲狀腺功能低下和耳聾等。這些癥狀首先被Morris和Fisher在1967年報道，患者有典型的鼻翼缺失，但未命名。Townes在1969年也報道了類似病例，主要表現(xiàn)為胰腺功能不全，鼻翼發(fā)育不全。這些臨床表現(xiàn)在不同患兒身上表型有差異，包括程度差異，例如智力水平范圍為正常-重度障礙，鼻部的異常程度可以是鼻尖突出鼻翼發(fā)育不全，也可以是鼻翼缺失。劉志峰等[3]對29例病例的文獻(xiàn)回顧分析顯示,胰腺外分泌功能不全和鼻翼發(fā)育不全最為常見,分別為21例(72.4%)和27例(93%)；18例(62%)伴有生長發(fā)育異常；17例(59%)伴有感音神經(jīng)性聾；頭皮缺損和頭發(fā)稀疏或異常卷曲分別有20例(69%)和13例(44.8%)；甲狀腺功能低下13例(44.8%)；牙齒畸形13例(44.8%)；肛門閉鎖6例(21%)。

文中患兒除了甲狀腺功能未見異常外，符合JBS的主要表現(xiàn)，甲狀腺功能低下在JBS患兒中約占1/3(Jones等，1988；Moeschler等,1995)，是智力發(fā)育落后的危險因素。本文患兒的新生兒代謝病篩查陰性，后期住院時甲狀腺激素檢測結(jié)果正常，排除了甲狀腺功能低下；患兒有相對比較少見的雙手貫掌紋和雙眼內(nèi)眥贅皮，沒有少見的腰椎后突伴脫位和淚道發(fā)育異常[4]。

UBR1基因是目前明確的唯一JBS相關(guān)致病基因，該基因位于染色體15q15.2，含有47個外顯子，編碼1 749個氨基酸序列，蛋白產(chǎn)物是調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)代謝的一種E3泛素連接酶[5]，在人體各個組織均有廣泛表達(dá)。目前，JBS的臨床異常表現(xiàn)與蛋白質(zhì)降解的病理生理關(guān)系還不明確，遺傳方式為常染色體隱性遺傳，純合突變或者復(fù)合雜合突變導(dǎo)致疾病。JBS的致病突變多數(shù)為無義突變、移位突變或者剪切位點(diǎn)突變，引起蛋白編碼序列提前終止而生成無生物活性的肽鏈[5，6]。根據(jù)基因型和表型相關(guān)研究，錯義突變分子水平研究提示其活性降低[6]，往往引起的臨床癥狀比較輕，不容易辨識[6，7]。文中患者全外顯子測序發(fā)現(xiàn)攜帶UBR1基因(NM_174916.3)復(fù)合雜合突變c.3055C>T(p.Arg1019*)/ EX47 Del；錯義突變c.3055C>T(p.Arg1019*)是文獻(xiàn)[8]報道過的致病突變，導(dǎo)致肽鏈的第1 019個氨基酸由天冬氨酸(堿基序列CGA)變成了終止密碼子序列TGA，合成的肽鏈提前終止；而EX47 Del突變在gnomAD和EXAC數(shù)據(jù)庫均未報道(PM2)，為首次報道。由于最后一個外顯子即47號外顯子整體缺失，造成142個蛋白編碼序列堿基缺失，合成的肽鏈也提前終止。根據(jù)ACMG遺傳變異分類標(biāo)準(zhǔn)和指南，EX47 Del突變屬于無功能變異(PVS1)，患兒的父母分別是這兩個突變的攜帶者，母親攜帶雜合錯義突變c.3055C>T(p.Arg1019*)，屬于已知的致病性變異；父親攜帶雜合缺失突變EX47E Del，符合PM3證據(jù)，綜合判斷，該變異屬于致病性變異(pathogenic)。因此，認(rèn)為這兩個突變都是致病突變，導(dǎo)致了患兒的JBS臨床表現(xiàn)。

JBS的治療包括長期的胰酶替代治療、聽力語言康復(fù)訓(xùn)練、運(yùn)動物理治療和根據(jù)智力水平采取相應(yīng)的康復(fù)教育。胰酶缺乏或低蛋白血癥是該病嬰幼兒期主要的致死原因，如果能夠及時確診并給以替代治療，可以提高患者生命質(zhì)量，延長壽命，很多患者都能活到成年，但平均壽命的相關(guān)數(shù)據(jù)還沒有文獻(xiàn)報道。文獻(xiàn)報道病例多數(shù)是出生后幾個月的嬰兒，少數(shù)為兒童期患兒，個別成人患者。Townes等(1981)報道一例JBS患兒，雖然從4歲開始每餐服用胰酶，但接近13歲時，她的身高和體重低于25%生長發(fā)育曲線，并伴有輕度的智障。Alkhouri等[7]報道一例JBS女孩，在18個月確診時身高和體重低于25%生長發(fā)育曲線，體重9.3 kg (7%生長曲線)，身高77.6 cm (< 5%生長曲線)，給予胰酶替代治療后身高和體重有所增長，位于5%～10%生長曲線范圍，其他方面基本正常；5歲入園體檢聽力篩查未通過后確診為雙側(cè)輕度-中度非對稱性感音神經(jīng)性聾。Civelek等[9]報道一例男性JBS患兒，生后1個月確診給予胰酶替代治療，6歲時體重13 kg，身高99 cm，均低于25%生長發(fā)育曲線。Aubrey等[10]報道了一例19歲長期胰酶替代治療伴維生素B12嚴(yán)重缺乏的JBS男性患者。因?yàn)橐认俚南倥萁M織逐漸被脂肪組織替代，部分患兒隨年齡增長會出現(xiàn)糖尿病病癥(Hurst等，1989；Steinbach等,2000)。

感音神經(jīng)性聾是JBS常見癥狀，多數(shù)患者顳骨影像學(xué)無異常，也有患者是由于耳蝸發(fā)育畸形導(dǎo)致，部分病例伴有外耳道狹窄和耳廓畸形[11]，主要康復(fù)手段為配戴助聽器和人工耳蝸植入。文中患兒顳骨CT提示內(nèi)耳結(jié)構(gòu)發(fā)育異常，包括雙側(cè)內(nèi)聽道前后徑狹窄，雙側(cè)耳蝸頂中回融合，雙側(cè)前庭擴(kuò)大，雙側(cè)前后半規(guī)管發(fā)育不良，外側(cè)半規(guī)管變短；雙側(cè)耳廓大，耳垂小，招風(fēng)耳?；純阂粴q半開始配戴助聽器，但沒有堅(jiān)持配戴和規(guī)律調(diào)試，6歲就診時只會說“爸爸、媽媽”等疊字雙音節(jié)詞和“電視機(jī)、小朋友”等個別三音節(jié)詞，平均語言年齡2歲,通過助聽器調(diào)試和聽力語言康復(fù)訓(xùn)練一年后，7歲時能自發(fā)說4～5字長的短句，能重復(fù)6～7個字長的短句，平均語言年齡提高到3歲，進(jìn)步明顯，證實(shí)聽力語言康復(fù)訓(xùn)練對此患兒的語言表達(dá)和語法能力有促進(jìn)作用。但總體來說，患兒的語言理解能力好于表達(dá)能力。該患兒雖然純音測聽結(jié)果符合人工耳蝸植入標(biāo)準(zhǔn)，但是助聽器助聽聽閾和語言康復(fù)訓(xùn)練效果顯示該患兒助聽效果明顯，家長認(rèn)可其言語進(jìn)步的速度；另外由于患兒病情特殊，內(nèi)耳結(jié)構(gòu)發(fā)育異常，不可預(yù)期人工耳蝸植入效果是否能比使用助聽器效果好，患兒家長對現(xiàn)在的康復(fù)效果和言語發(fā)育水平滿意，所以不愿行人工耳蝸植入手術(shù)。

由于JBS患兒的新生兒聽力篩查未通過，常常會就診于耳鼻喉科，患兒的特殊面容有助于臨床診斷，而基因檢測可以進(jìn)一步明確病因診斷，并對家庭內(nèi)部基因突變攜帶者的情況進(jìn)行分析，為未來患兒父母再生育的產(chǎn)前診斷提供依據(jù)。針對患者的感音神經(jīng)性聾，建議早發(fā)現(xiàn)、早診斷和早康復(fù)治療，特別是聽力語言康復(fù)訓(xùn)練有助于提高其語言能力。