基于轉(zhuǎn)錄組的褐軟蠟蚧微衛(wèi)星分子標記開發(fā)

李冬芝，張美霞，單伊曼，王 芳

(河北師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 石家莊 050024)

微衛(wèi)星(microsatellite)DNA由核心序列和側(cè)翼序列組成，其核心序列是由2～6個核苷酸經(jīng)多次串聯(lián)形成的序列，側(cè)翼序列通常是相對保守的單拷貝序列，位于核心序列的兩側(cè)[1].微衛(wèi)星由于數(shù)量多、分布廣、重復(fù)性好、簡便易行、省時高效，且具有豐富的多態(tài)性并符合孟德爾遺傳定律和共顯性遺傳等特點[2-4]，被廣泛應(yīng)用于昆蟲的種群遺傳多樣性研究、物種的起源、擴散及進化等研究領(lǐng)域[5].傳統(tǒng)上，采用文庫法進行微衛(wèi)星多態(tài)性位點的開發(fā)，但隨著高通量測序技術(shù)的迅猛發(fā)展及測序成本的下降，通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選微衛(wèi)星多態(tài)性位點的方法更成熟、更高效、更經(jīng)濟[6-8].轉(zhuǎn)錄組是特定組織或細胞在某一發(fā)育階段或功能狀態(tài)下所有RNA的總和，主要包括 rRNA，mRNA，tRNA，非編碼RNA和少量未知調(diào)控功能的內(nèi)含子[9-11]，對于無參考基因組的非模式生物在遺傳進化等方面有重要的應(yīng)用價值[12].目前，通過轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫已成功開發(fā)出扶桑綿粉蚧Phenacoccussolenopsis[13]、齒緣刺獵蝽Sclominaerinacea[14]、意大利蝗Calliptamusitalicus[15]等多種昆蟲的微衛(wèi)星分子標記.

褐軟蠟蚧CoccushesperidumLinnaeus,1758，隸屬于昆蟲綱Insecta、半翅目Hemiptera、蚧次目Coccomorpha、蠟蚧科Coccidae，是一類比較古老的昆蟲，在蚧次目占據(jù)著重要的分類地位[16].褐軟蠟蚧在全球各大動物地理區(qū)均有分布，通過刺吸式口器汲取植物汁液，引起植物枝葉枯黃萎蔫，分泌的蜜露可誘發(fā)植物產(chǎn)生霉污病，當蟲害大發(fā)生時，影響植物的光合作用，致使植物長勢衰退，嚴重時可致整株死亡[17-18].目前已知褐軟蠟蚧可為害49科170多種寄主植物，其中包含多種經(jīng)濟作物和觀賞性植物，如該種取食內(nèi)蒙古地區(qū)的米蘭Aglaiaodorata幼嫩樹梢的汁液，造成米蘭枯萎凋謝[19].微衛(wèi)星分子標記在入侵蚧蟲扶桑綿粉蚧的遺傳分化研究中得到廣泛應(yīng)用.李慧等[20]通過5′錨定對扶桑綿粉蚧進行微衛(wèi)星DNA的篩選，并分析了扶桑綿粉蚧的微衛(wèi)星特征；羅梅等[13]通過扶桑綿粉蚧的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，篩選出1 781個SSR位點；馬玲[21]利用扶桑綿粉蚧基因組數(shù)據(jù)成功開發(fā)出42對微衛(wèi)星引物，并基于此進行了該物種的種群遺傳學(xué)研究；王玉生[22]基于微衛(wèi)星探討了扶桑綿粉蚧在中國的種群遺傳結(jié)構(gòu)特點和地理分布格局.然而，其他蚧蟲基于微衛(wèi)星的種群分化研究比較匱乏，因此本研究以全球分布且為害嚴重的褐軟蠟蚧為研究對象，利用高通量測序技術(shù)，基于轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)對褐軟蠟蚧進行微衛(wèi)星分子標記的開發(fā)，以期為今后褐軟蠟蚧的種群遺傳學(xué)、功能基因等研究奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 樣本來源

褐軟蠟蚧采集于河北石家莊(37 °59 ′58 ″ N，114 °30 ′59 ″ E；寄主為幸福樹Radermacherasinica)、湖北恩施(30 °16 ′19 ″ N，109 °29 ′17 ″ E；寄主為幸福樹)及遼寧錦州(41 °07 ′02 ″ N，121 °07 ′42 ″ E；寄主為鵝掌柴Scheffleraarboricola).所采集的試蟲均為雌成蟲，蟲體置于100 %酒精,于-20 ℃冰箱保存.

1.2 轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的組裝分析

褐軟蠟蚧的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)委托北京諾禾致源科技股份有限公司進行測序，測序平臺為Illumina，獲得的轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)量評估和過濾后得到測序數(shù)據(jù)的總條目數(shù)(clean reads)，再經(jīng)過Trinity[23]拼接和Corset[24]層次聚類，得到最長群集(cluster)序列，最后將組裝得到的褐軟蠟蚧轉(zhuǎn)錄本數(shù)據(jù)與7大公共數(shù)據(jù)庫Swiss-prot(swiss prot protein database)，Nr(non-redundant protein sequences)，Nt(NCBI nucleotide sequences)，KEGG(kyoto encyclopedia of genes and genomes)，KOG(eukaryotic ortholog groups)，Pfam(protein families database)和GO(gene ontology)進行Blast比對；選擇閾值條件為E<0.01，采用序列相似性進行功能注釋.

1.3 SSR位點的鑒定

使用在線軟件MISA(http:∥pgrc.ipk-gatersleben.de/misa/misa.html)對褐軟蠟蚧轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)的unigenes進行搜索，查找SSR.查找標準如下：單核苷酸重復(fù)≥10次，二核苷酸重復(fù)≥6次，三核苷酸重復(fù)≥5次，四核苷酸重復(fù)≥5次，五核苷酸重復(fù)≥5次，六核苷酸重復(fù)≥5次.

1.4 SSR引物設(shè)計與驗證

使用Primer Premier 3軟件[25]批量設(shè)計SSR引物，從中隨機挑選50對引物用以驗證其穩(wěn)定性(表1，引物由大基因合成).樣品總基因組DNA通過組織提取試劑盒(中國，全式金EasyPure Genomic DNA Kit)提取，于-20 ℃冰箱保存?zhèn)溆?以樣品總DNA為模板，以超純水代替DNA模板為陰性對照進行PCR擴增，PCR反應(yīng)體系：DNA模板1 μL，2×Es Taq PCR Master Mix 5 μL，上下游引物各0.25 μL，ddH2O 3.5 μL.PCR反應(yīng)程序：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，54～60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min，4 ℃保存.PCR產(chǎn)物經(jīng)1 %瓊脂糖凝膠電泳檢測.

表1 隨機選擇用于PCR驗證的褐軟蠟蚧微衛(wèi)星引物Tab.1 Randomly Selected Coccus hesperidum Microsatellite Primers for PCR Validation

續(xù)表

續(xù)表

2 結(jié) 果

2.1 褐軟蠟蚧轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析

2.1.1 褐軟蠟蚧轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)組裝分析結(jié)果

Illumina平臺測序得到的轉(zhuǎn)錄組原始數(shù)據(jù)經(jīng)過質(zhì)量評估和過濾后，得到48 708 348 clean reads，經(jīng)Trinity拼接后獲得145 727條轉(zhuǎn)錄本(transcripts)，堿基序列為196 655 017 bp，序列平均長度為1 349 bp，N50的片段長度為2 590 bp，G+C含量為40.01 %.所得轉(zhuǎn)錄本經(jīng)過Corset層次聚類后得到最長Cluster序列，最終獲得111 073 條unigenes，所得unigenes的總堿基序列為187 403 274 bp，unigenes序列長短不一，長度為201～23 463 bp，平均長度為1 687 bp，其N50為2 702 bp.

表2 褐軟蠟蚧轉(zhuǎn)錄組功能注釋Tab.2 Functional Annotation of Transcriptome in Coccus hesperidum

2.1.2 褐軟蠟蚧的基因功能注釋

本研究成功在111 073條unigenes中注釋出111 228個基因.其中有7 519條unigenes同時在7個數(shù)據(jù)庫中注釋成功，占總數(shù)的6.76 %，在7個數(shù)據(jù)庫中至少有1個數(shù)據(jù)庫注釋成功的，占58.69 %.根據(jù)數(shù)據(jù)庫注釋成功的unigenes統(tǒng)計，GO數(shù)據(jù)庫注釋分類信息最多，共注釋了53 149條unigenes，占總數(shù)的47.85 %(表2).根據(jù)GO功能的分類方式，GO注釋的unigenes可以分為生物過程、細胞組分和分子功能3大類，包含50個詳細的亞類(圖1).生物過程包含25個不同的亞類，褐軟蠟蚧的注釋基因中與細胞過程和代謝過程相關(guān)的unigenes所占比例較高，分別約占20.80 %和18.48 %；而與細胞聚集相關(guān)的基因所占比例最低，僅有6條。細胞組分包括20個不同的亞類，其中與細胞和細胞組分相關(guān)的unigenes所占比例最高，均約占18.49 %；其次為細胞器相關(guān)的基因序列，占12.90 %；細胞外基質(zhì)成分相關(guān)的基因序列最少，僅有4條。分子功能包含10個亞類，與結(jié)合相關(guān)的unigenes數(shù)量較多，占46.78 %；其次是催化活性和轉(zhuǎn)錄活性的unigenes數(shù)量，占35.21 %；而與金屬離子結(jié)合相關(guān)的所占比例最少，僅有33條.

1-25為生物過程：1.行為；2.生物附著；3.生物相；4.生態(tài)調(diào)控;5.細胞聚集；6.細胞凋亡；7.細胞組織成分或生物發(fā)生；8.細胞過程；9.發(fā)育過程；10.生長；11.免疫過程；12.定位；13.運動；14.代謝過程；15.多種有機體過程；16.多細胞生物過程；17.生態(tài)負反饋過程；18.生態(tài)正反饋過程；19.生態(tài)過程調(diào)節(jié)；20.生殖；21.生殖過程；22.應(yīng)激反應(yīng)；23.節(jié)律過程；24.信號；25.信號傳導(dǎo)過程；26-45為細胞組分：26.細胞；27.細胞黏附；28.細胞組分；29.細胞外基質(zhì)；30.細胞外基質(zhì)成分；31.胞外區(qū)；32.胞外區(qū)組分；33.大分子復(fù)合物；34.細胞膜；35.細胞膜成分；36.膜封閉腔；37.擬核；38.細胞器；39.細胞器成分；40.其他組織；41.其他組織成分；42.突觸；43.突觸成分；44.病毒；45.病毒成分；46-55為分子功能：46.抗氧化活性；47.粘合；48.催化活性；49.金屬伴侶蛋白活性；50.分子功能調(diào)控；51.分子傳導(dǎo)活性；52.核酸結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子活性；53.結(jié)構(gòu)分子活；54.轉(zhuǎn)錄因子活性，蛋白質(zhì)結(jié)合；55.轉(zhuǎn)運體活性.圖1 褐軟蠟蚧的unigene GO功能注釋Fig.1 GO Functional Annotation of Unigene of Coccus hesperidum

2.2 褐軟蠟蚧SSR的分布特點

利用MISA軟件對褐軟蠟蚧轉(zhuǎn)錄組111 073條unigenes數(shù)據(jù)進行預(yù)測，共在30 331條unigenes中預(yù)測得到51 272個SSR位點，SSR位點的出現(xiàn)頻率為27.31 %(含SSR的unigenes數(shù)量/總unigenes數(shù)量)，其中19 478條unigenes序列只含有1個SSR位點，10 853條unigenes序列含有1個以上SSRs位點.褐軟蠟蚧的SSR位點信息類型豐富，單核苷酸至六核苷酸重復(fù)類型均檢測到，其中單核苷酸占比最高，為87.14 %；其次為三核苷酸、二核苷酸和四核苷酸，分別占SSR位點總數(shù)的8.93 %，2.74 %，0.76 %；五核苷酸和六核苷酸含量較少，僅占0.20 %和0.23 %.在單核苷酸重復(fù)中，A/T基序重復(fù)為主要類型，占比為80.16 %；其次為C/G基序重復(fù)占比6.98 %.二核苷酸以AG/CT重復(fù)為主要類型；三核苷酸中ACG/CGT，AGC/CTG和CCG/CGG的重復(fù)超過1.00 %；四核苷酸中AAAT/ATTT基序重復(fù)最多，所占比例為0.37 %(表3，圖2).

表3 褐軟蠟蚧轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中SSRs的類型及數(shù)目Tab.3 The Types and Number of SSRs in Transcriptome Data of Coccus hesperidum

圖2 褐軟蠟蚧的SSR重復(fù)基元出現(xiàn)頻率Fig.2 Fenquency of SSR Repeat Motif of Coccus hesperidum

2.3 褐軟蠟蚧SSR的引物驗證

使用Primer Premier 3對褐軟蠟蚧含有SSR位點的unigenes共設(shè)計118 215對SSR引物.本研究通過對三個不同地理種群的褐軟蠟蚧DNA進行PCR擴增，來驗證隨機挑選并合成的50對引物(表1)的穩(wěn)定性.結(jié)果顯示，有15對引物在3個地理種群中能成功擴增出與預(yù)期片段大小一致的特異性片段(圖3)，引物SSR-02，SSR-09，SSR-10，SSR-11，SSR-13，SSR-18，SSR-19，SSR-27，SSR-29，SSR-31，SSR-32，SSR-34，SSR-35，SSR-36，SSR-37，SSR-38，SSR-39，SSR-40和SSR-48這19對引物在3個地理種群均未擴增出特異性條帶，而其余的16對引物則在部分地區(qū)擴增失敗或無特異性條帶.

M.2000 DNA marker；1～50.SSR 引物.圖3 褐軟蠟蚧 DNA 擴增的電泳圖Fig.3 Electrophoretic Map of DNA Amplification of Coccus hesperidum

3 討 論

隨著現(xiàn)代生物技術(shù)和生物信息學(xué)的快速發(fā)展，轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)因其無需參考基因組數(shù)據(jù)便可對目標物種進行分子生物學(xué)研究，已成為非模式物種基因信息挖掘的重要研究手段[12].目前，本研究通過對褐軟蠟蚧進行轉(zhuǎn)錄組測序，共獲111 073條unigenes，平均長度1 687 bp，N50 為2 702 bp，并且該物種的注釋基因信息將為研究褐軟蠟蚧乃至蚧蟲的代謝途徑、基因功能分類和信號傳導(dǎo)等方面提供重要的參考依據(jù).

本研究中通過褐軟蠟蚧的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，從111 073條unigenes獲得30 331條SSR序列，褐軟蠟蚧SSR的出現(xiàn)頻率為27.31 %，其發(fā)生頻率遠高于另一種蚧蟲扶桑綿粉蚧(5.79 %)[13]，同時遠高于桔小實蠅Bactroceradorsalis(4.00 %)[26]、溝眶象Eucryptorrhynchuschinensis(9.47 %)[27]和沙蔥螢葉甲Galerucadaurica(4.53 %)[28]，但低于窄足真蚋Simulium(Eusimulium)angustipes(36.05 %)[29].由此看出，不同物種的SSR發(fā)生頻率不盡相同，這可能與物種自身的特性及差異有關(guān)，另一種可能是由于高通量測序標準或者SSR篩選方法設(shè)置的標準或參數(shù)不同所導(dǎo)致[30].在褐軟蠟蚧SSR位點中，單核苷酸重復(fù)(87.14 %)和三核苷酸重復(fù)(8.93 %)為主要類型，這與窄足真蚋[29]、孟氏隱唇瓢蟲Cryptolaemusmontrouzieri[31]、沙蔥螢葉甲[28]、扶桑綿粉蚧[13]、桔小實蠅[26]等昆蟲的結(jié)果相似，而意大利蝗Calliptamusitalicus[15]、梨小食心蟲Grapholithamolesta[32]、沙棘木蠹蛾Eogystiahippophaecolus[33]則以單核苷酸和二核苷酸重復(fù)為主要類型.這說明不同物種或者昆蟲SSR位點的核苷酸重復(fù)類型存在著一定的差異，這種差異可能是由于不同昆蟲的基因組測序數(shù)據(jù)、不同組裝方法獲得不同的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)大小、不同昆蟲所具有的獨特的基因編碼特點、SSR位點篩選方法和參數(shù)設(shè)置的不同所導(dǎo)致的[30,34].此外，我們對從大批量SSR引物中隨機選擇的50對引物進行了擴增穩(wěn)定性的驗證，其中有15對引物在不同地理種群的褐軟蠟蚧樣本中得到了穩(wěn)定擴增，19對引物在不同地理種群均擴增失敗，而其余16對引物則在部分種群沒有擴增到目的片段或者擴增失敗.這種現(xiàn)象的出現(xiàn)主要是因為轉(zhuǎn)錄組測序得到的序列不含有內(nèi)含子及其它非編碼序列，進而篩選獲得的SSR也無內(nèi)含子序列，但物種的基因組SSR存在內(nèi)含子序列，這樣會造成部分SSR序列與物種自身基因組的差異，從而影響PCR的擴增結(jié)果，因此應(yīng)選用可以穩(wěn)定擴增的SSR位點來作為未來褐軟蠟蚧種群遺傳學(xué)研究的微衛(wèi)星分子標記[35].

本研究對通過褐軟蠟蚧的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)篩選出SSR位點，并成功驗證出15 對能穩(wěn)定擴增的引物，為褐軟蠟蚧的細胞學(xué)、代謝途徑、種群遺傳學(xué)等方面的研究奠定了堅實的基礎(chǔ).