基于質(zhì)譜的尿蛋白質(zhì)組學(xué)在腫瘤生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)中的研究進(jìn)展*

寧思明 胡思雋 田苗苗 聶勇戰(zhàn)

腫瘤生物標(biāo)志物是反映腫瘤發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后的一系列物質(zhì)，在臨床上廣泛應(yīng)用于腫瘤的早期診斷、治療監(jiān)測(cè)和預(yù)后評(píng)估。血液能夠較真實(shí)反映機(jī)體的生理和病理變化，是腫瘤生物標(biāo)志物研究的主要樣本來(lái)源。與血液相比，尿液具有采集簡(jiǎn)便、非侵入性以及免受體內(nèi)穩(wěn)態(tài)機(jī)制的影響，成分是更為簡(jiǎn)單且穩(wěn)定的血液濾液。因此，通過(guò)研究尿液標(biāo)本尋找腫瘤生物標(biāo)志物是眾多研究者追求的目標(biāo)。

隨著質(zhì)譜（mass spectrometry，MS）檢測(cè)技術(shù)和數(shù)據(jù)處理方法的快速進(jìn)步，基于MS 的高通量和高精度蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)得到了飛速發(fā)展，蛋白質(zhì)標(biāo)志物在腫瘤的早期診斷和療效評(píng)估等方面發(fā)揮重要作用，應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在尿液中尋找生物標(biāo)志物的研究日益廣泛。在2016年蔡夢(mèng)等[1]和趙青等[2]研究中，詳細(xì)闡述了部分腫瘤中發(fā)現(xiàn)的潛在尿蛋白標(biāo)志物，并進(jìn)行了系統(tǒng)地分析總結(jié)，為尿液腫瘤標(biāo)志物進(jìn)一步的研究提供有價(jià)值的參考。本文綜述了近20年來(lái)通過(guò)MS 技術(shù)發(fā)現(xiàn)的尿蛋白標(biāo)志物在常見(jiàn)腫瘤中的研究進(jìn)展，并對(duì)尿蛋白質(zhì)組學(xué)研究的優(yōu)劣勢(shì)和應(yīng)用前景進(jìn)行分析。

1 基于MS 的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)中的研究進(jìn)展

1.1 常用的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)

早期的蛋白質(zhì)組學(xué)主要應(yīng)用于定性分析，隨著研究的不斷深入，提供蛋白質(zhì)種類等定性信息的分析技術(shù)已經(jīng)不能滿足實(shí)際蛋白質(zhì)組學(xué)研究的需求，當(dāng)今蛋白質(zhì)組學(xué)研究的熱點(diǎn)逐漸轉(zhuǎn)向定量分析。在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，蛋白質(zhì)鑒定經(jīng)常使用的MS 技術(shù)包括雙向凝膠電泳質(zhì)譜（two-dimensional electrophoresis MS，2-DE-MS）、毛細(xì)管電泳質(zhì)譜（capillary electrophoresis MS，CE-MS）、表面增強(qiáng)激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（surface-enhanced laser desorption/ionization time-offlight MS，SELDI-TOF-MS）、基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜（matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight MS，MALDI-TOF-MS）[3]。目前，蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)主要基于雙向電泳（2-DE）和MS兩大類技術(shù)。隨著高精度MS 技術(shù)的快速發(fā)展，基于MS 的蛋白質(zhì)組定量技術(shù)逐漸成為主要的分析手段。根據(jù)是否對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行定量，常用的蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)可分為非靶向定量蛋白質(zhì)組學(xué)和靶向定量蛋白質(zhì)組學(xué)兩大類。

非靶向定量蛋白質(zhì)組學(xué)是對(duì)樣品中所有蛋白進(jìn)行無(wú)差別定量分析，根據(jù)是否對(duì)樣品中的蛋白質(zhì)或多肽進(jìn)行標(biāo)記，又分為非標(biāo)記和標(biāo)記定量技術(shù)。常用的非標(biāo)記定量技術(shù)包括label-free 和基于數(shù)據(jù)非依賴采集（data-independent acquisition/sequential window acquisition of all theoretical mass spectra，DIA/SWATH）技術(shù)，標(biāo)記定量技術(shù)主要為細(xì)胞培養(yǎng)穩(wěn)定同位素標(biāo)記（stable isotope labeling with amino acids in cell culture，

SILAC）技術(shù)、同位素親和標(biāo)簽（isotope-coded affinity tag，ICAT）技術(shù)、同位素標(biāo)記相對(duì)和絕對(duì)定量（isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ）技術(shù)、串聯(lián)質(zhì)量標(biāo)簽（tandem mass tags，TMT）技術(shù)、二甲基化或18O 標(biāo)記技術(shù)[4]。Label-free 定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在于成本低廉和樣品制備簡(jiǎn)單，與標(biāo)記定量相比，定量的準(zhǔn)確性相對(duì)較差。Label-free 和標(biāo)記定量技術(shù)均屬于數(shù)據(jù)依賴采集技術(shù)（data dependent analysis，DDA），盡管已廣泛用于復(fù)雜樣品中蛋白質(zhì)的定性和定量分析，但DDA 一級(jí)掃描過(guò)程中總是偏向信號(hào)強(qiáng)的肽段進(jìn)行裂解，因此容易造成感興趣的低豐度肽段的丟失。數(shù)據(jù)非依賴采集（data independent analysis，DIA）技術(shù)利用高分辨MS 采集各區(qū)域范圍內(nèi)所有母離子的全部碎片離子信息，最后根據(jù)DDA參考譜圖庫(kù)對(duì)DIA 數(shù)據(jù)進(jìn)行定性與定量分析。與DDA 技術(shù)相比，DIA 技術(shù)可對(duì)樣品中所有離子的碎片信息進(jìn)行無(wú)偏向性的數(shù)據(jù)采集，具有定量準(zhǔn)確度高、重復(fù)性好和可回溯性高等優(yōu)點(diǎn)[5]。靶向蛋白質(zhì)組學(xué)能夠?qū)δ繕?biāo)蛋白質(zhì)、目標(biāo)肽段進(jìn)行選擇性檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)目標(biāo)蛋白質(zhì)/多肽的相對(duì)/絕對(duì)定量。目前，主要有多重反應(yīng)監(jiān)測(cè)技術(shù)（multiple reaction monitoring，MRM）/選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)技術(shù)（selected reaction monitoring，SRM）和平行反應(yīng)監(jiān)測(cè)技術(shù)（parallel reaction monitoring，PRM）。該技術(shù)擺脫了傳統(tǒng)依賴商品化抗體質(zhì)量的蛋白驗(yàn)證方法，如酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）和蛋白免疫印跡（Western blot）等，能夠同時(shí)對(duì)多個(gè)目標(biāo)蛋白質(zhì)/肽段進(jìn)行選擇性檢測(cè)分析。

非靶向蛋白質(zhì)組學(xué)旨在發(fā)現(xiàn)并檢測(cè)樣品中更多的蛋白質(zhì)，從而發(fā)現(xiàn)新的蛋白質(zhì)和生物標(biāo)志物等，適合于生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的早期研究階段。在非靶向蛋白質(zhì)組學(xué)研究中發(fā)現(xiàn)感興趣的特定蛋白質(zhì)或生物標(biāo)志物之后，可進(jìn)一步通過(guò)靶向蛋白質(zhì)組學(xué)的方法，在更多的樣本中驗(yàn)證和研究這些蛋白質(zhì)。相比于非靶向蛋白質(zhì)組學(xué)，靶向蛋白質(zhì)組學(xué)具有更高的準(zhǔn)確性、靈敏度和重現(xiàn)性，可以有效彌補(bǔ)非靶向蛋白質(zhì)組學(xué)重復(fù)性和分析效率低的缺點(diǎn)。根據(jù)不同的定量原理，任何一種蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)均不可能是完美無(wú)缺的，應(yīng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求進(jìn)行合適選擇。目前基于MS 的常用定量蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的特點(diǎn)、優(yōu)勢(shì)及局限性進(jìn)行匯總，見(jiàn)表1。

1.2 蛋白質(zhì)組學(xué)用于生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的研究策略

在蛋白質(zhì)組學(xué)研究中，生物標(biāo)志物的臨床前研究通常分為3 個(gè)階段：發(fā)現(xiàn)階段，驗(yàn)證階段和確認(rèn)階段。整個(gè)標(biāo)志物研究階段通常呈現(xiàn)的特點(diǎn)為患者群體規(guī)模的增加和候選生物標(biāo)志物數(shù)量的減少。生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)階段主要目標(biāo)是全面量化單個(gè)或混合樣本中的數(shù)千種蛋白質(zhì)。非靶向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已成為一種適合對(duì)大量蛋白質(zhì)進(jìn)行相對(duì)定量以尋找新的候選生物標(biāo)志物的工具。發(fā)現(xiàn)階段主要生成候選生物標(biāo)志物列表為后續(xù)階段分析建立至關(guān)重要的橋梁。生物標(biāo)志物的驗(yàn)證和確認(rèn)階段通過(guò)擴(kuò)大樣本數(shù)量和規(guī)模，驗(yàn)證并確認(rèn)發(fā)現(xiàn)階段最有潛力的候選蛋白生物標(biāo)志物列表。該階段通過(guò)靶向蛋白定量方法來(lái)識(shí)別感興趣的蛋白質(zhì)或肽段?；隍?yàn)證和確認(rèn)階段篩選出的候選標(biāo)志物的優(yōu)先排序結(jié)果，在臨床驗(yàn)證階段將選擇數(shù)量有限且有前景的潛在候選標(biāo)志物進(jìn)行進(jìn)一步評(píng)估。

2 尿蛋白質(zhì)組學(xué)生物標(biāo)志物的特征

2.1 尿蛋白質(zhì)組學(xué)在生物標(biāo)志物研究中的優(yōu)勢(shì)

蛋白質(zhì)組學(xué)常用的研究對(duì)象包括臨床組織樣本和生物體液如腦脊液、血液、尿液等。由于組織樣本和近源體液通常需要高侵入性手段獲得，因此非侵入性收集的尿液、唾液和汗液等體液逐漸引起研究者的關(guān)注。例如，唾液蛋白在口腔癌、肺癌等多種癌癥中的應(yīng)用[6]，汗液中的囊性纖維化跨膜傳導(dǎo)調(diào)節(jié)蛋白在囊性纖維化中的應(yīng)用等[7]。由于唾液蛋白具有易降解、易受飲食習(xí)慣等影響，汗液樣本量少、采樣困難等缺點(diǎn)，使其在蛋白質(zhì)組學(xué)的研究中受到較大限制。生物標(biāo)志物是與疾病相關(guān)的可測(cè)量指標(biāo)，由于血液與身體各部位息息相關(guān)，能夠較真實(shí)的反映人體微環(huán)境狀態(tài)。因此，血液一直是尋找生物標(biāo)志物的最主要來(lái)源。但是血液樣本的蛋白質(zhì)組學(xué)分析存在一定的缺點(diǎn)：血液取樣是侵入性的；血液含有20 種高豐度蛋白質(zhì)使低豐度蛋白質(zhì)的識(shí)別能力變差，這將掩蓋那些豐度較低但可能具有潛在意義的蛋白質(zhì)。相較血液而言，尿液在腫瘤分子標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)方面具有采集簡(jiǎn)單、無(wú)創(chuàng)，容易連續(xù)性獲得等優(yōu)點(diǎn)。尿蛋白質(zhì)組相較血液蛋白質(zhì)組復(fù)雜性更低，因此更易于檢測(cè)低豐度蛋白的變化[8]。另外，血液作為體內(nèi)環(huán)境的重要組成部分，受到人體內(nèi)穩(wěn)態(tài)機(jī)制的調(diào)節(jié)并盡可能保持機(jī)體穩(wěn)定，然而，在檢測(cè)過(guò)程中血液中微小的變化會(huì)被機(jī)體的穩(wěn)態(tài)機(jī)制逐漸消除，特別是當(dāng)變化發(fā)生得相對(duì)較早且很小的時(shí)候，這使得很難發(fā)現(xiàn)血液中的變化[9]，而尿液收集全身的廢物，變化比血液更豐富，其被認(rèn)為是早期和敏感生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的最有吸引力的來(lái)源之一。

近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，尿液在疾病早期的蛋白質(zhì)組學(xué)變化使其成為更好的生物標(biāo)志物來(lái)源。如市面上的早孕試紙通過(guò)檢測(cè)尿液中的特異激素人絨毛膜促性腺激素來(lái)判斷是否懷孕，盡管這種檢測(cè)不能保證100%的準(zhǔn)確率，但它具有快速、方便、靈敏、特異性高等優(yōu)點(diǎn)，已被廣泛用于早孕的初篩檢查。隨著尿蛋白質(zhì)組學(xué)研究領(lǐng)域的不斷深入，許多復(fù)雜疾病得到了廣泛的研究。2022年，Bi 等[10]通過(guò)TMT 定量技術(shù)，對(duì)新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）患者組以及健康對(duì)照組的尿液和血清樣本進(jìn)行了蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)尿液中的蛋白分子量分布與全人類蛋白組的蛋白分子量分布一致。此外，該研究還表明尿液蛋白組顯示出比血液蛋白組更高的檢測(cè)靈敏度。

2.2 尿蛋白質(zhì)組學(xué)在生物標(biāo)志物研究中存在的問(wèn)題

隨著MS 檢測(cè)技術(shù)和分析方法的快速發(fā)展，尿蛋白質(zhì)組學(xué)逐漸趨于成熟。各種新型MS 技術(shù)的出現(xiàn)，使得尋找腫瘤生物標(biāo)志物的困難程度大大降低。盡管尿蛋白質(zhì)組學(xué)在生物標(biāo)志物的發(fā)現(xiàn)中得到了廣泛的應(yīng)用，但到目前為止，很少有尿蛋白候選生物標(biāo)志物被應(yīng)用于臨床中。因?yàn)橛行飿?biāo)志物的發(fā)現(xiàn)受到許多因素的挑戰(zhàn)，綜合多個(gè)方面的專家建議和新技術(shù)的進(jìn)展，其主要包括研究設(shè)計(jì)、樣本收集和準(zhǔn)備、蛋白質(zhì)定量、儀器平臺(tái)和數(shù)據(jù)分析等因素影響[11]。研究設(shè)計(jì)包括患者選擇和嚴(yán)格的統(tǒng)計(jì)設(shè)計(jì)。樣本收集和準(zhǔn)備包括尿液的采集和蛋白質(zhì)的提取。蛋白質(zhì)定量即不同蛋白質(zhì)組學(xué)定量技術(shù)的選擇，包括發(fā)現(xiàn)生物標(biāo)志物的非靶向定量技術(shù)或驗(yàn)證候選生物標(biāo)志物的靶向定量技術(shù)。儀器平臺(tái)和數(shù)據(jù)分析包括基于MS 平臺(tái)的選擇和生物信息學(xué)數(shù)據(jù)分析方法的選擇等。

目前，大多數(shù)生物標(biāo)志物的研究局限于患病群體和健康對(duì)照組之間的比較，由于尿液中潛在蛋白生物標(biāo)志物的濃度非常低，尿液的特征與患者的性別、年齡、激素狀態(tài)、飲食或身體活動(dòng)等差異密切相關(guān)。因此，在尿蛋白生物標(biāo)志物研究中，假陽(yáng)性的發(fā)現(xiàn)率很高。已有研究者提出對(duì)于尿液生物標(biāo)志物的研究，轉(zhuǎn)化為臨床最接近的方法是對(duì)同一患者進(jìn)行疾病標(biāo)志物前后的比較。這樣，只要被比較的兩種狀態(tài)之間的生存方式無(wú)顯著變化，大多數(shù)混雜因素就可以被抵消掉。通過(guò)使用同一患者疾病前后對(duì)照樣本進(jìn)行早期診斷標(biāo)志物的篩選，并且可以收集健康人的尿液樣本作為未來(lái)的對(duì)照[9]。如在2020年進(jìn)行的一項(xiàng)研究中，Wu 等[12]通過(guò)label-free 定量技術(shù)對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者的術(shù)前和術(shù)后尿樣進(jìn)行差異蛋白的分析。由于腫瘤患者術(shù)后引起的應(yīng)激反應(yīng)較大，延長(zhǎng)患者術(shù)后樣本收集時(shí)間對(duì)試驗(yàn)樣本策略來(lái)講，將會(huì)是一個(gè)更好的選擇，但同時(shí)也會(huì)增加樣本收集的難度。另外，由于各種實(shí)驗(yàn)條件的限制，多數(shù)尿蛋白標(biāo)志物的研究還不夠成熟，大部分蛋白質(zhì)組學(xué)研究均處于單中心研究階段，且缺乏在其他腫瘤患者尿液中的驗(yàn)證研究，這樣很難建立高可信度和高特異性的疾病生物標(biāo)志物。因此，這些潛在的腫瘤生物標(biāo)志物應(yīng)用到臨床中還需要很長(zhǎng)的路要走。

3 尿蛋白質(zhì)組學(xué)在腫瘤生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)中的應(yīng)用

癌癥的進(jìn)展與癌基因的激活和抑癌基因的失活密切相關(guān)，這些變化造成了正常細(xì)胞和癌細(xì)胞之間基因、蛋白質(zhì)和代謝物表達(dá)的一系列差異，其中一些變化可以在體液中被捕獲到來(lái)鑒定體內(nèi)的腫瘤狀態(tài)。體液中有意義的蛋白質(zhì)多為低豐度蛋白質(zhì)，隨著MS 技術(shù)的飛速發(fā)展，基于MS 的高通量、高靈敏及高深度蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)的日漸成熟，為篩選和定量體液中的低豐度生物標(biāo)志物提供了技術(shù)可能。如最新的超靈敏蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)已經(jīng)能夠?qū)εR床復(fù)雜生物樣本中小于微克級(jí)的上萬(wàn)個(gè)蛋白質(zhì)實(shí)現(xiàn)快速定量深度分析。另外，針對(duì)基于MS 的蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在體液中篩選出的微量目標(biāo)蛋白，已有多種操作簡(jiǎn)單且快速的技術(shù)用于靶向蛋白的定量分析。如腫瘤標(biāo)志物即時(shí)檢測(cè)（POCT）技術(shù)、基于特異性親和試劑的ELISA 法、新型的超高靈敏度單分子（Simoa）蛋白質(zhì)檢測(cè)技術(shù)等。尿液分子包括細(xì)胞內(nèi)成分、循環(huán)蛋白和抗體，通常與機(jī)體的各個(gè)部位接觸。因此，對(duì)腫瘤患者尿液成分的檢測(cè)可能有助于識(shí)別新的生物標(biāo)志物和監(jiān)測(cè)疾病的進(jìn)展。近年來(lái)，尿蛋白質(zhì)組學(xué)在各類腫瘤生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)的研究中得到迅速發(fā)展，下面將對(duì)11 種常見(jiàn)腫瘤中已發(fā)現(xiàn)并初步驗(yàn)證的尿蛋白生物標(biāo)志物進(jìn)行歸納總結(jié)。

3.1 泌尿系統(tǒng)腫瘤

膀胱癌（bladder cancer，BLCA）、腎癌（kidney cancer，RC）和前列腺癌（prostate cancer，PCa）是國(guó)際主要泌尿系統(tǒng)癌癥。由于泌尿系統(tǒng)與尿液直接接觸，且尿液中70%的蛋白質(zhì)由泌尿系統(tǒng)產(chǎn)生。因此，尿液十分適用于泌尿系統(tǒng)腫瘤生物標(biāo)志物的研究。目前，已被推廣于臨床應(yīng)用的尿蛋白腫瘤標(biāo)志物多為泌尿系統(tǒng)癌癥。如美國(guó)食品藥品監(jiān)督管理局（FDA）批準(zhǔn)的BLCA 尿液標(biāo)志物核基質(zhì)蛋白22（NMP22）。

BLCA 目前檢測(cè)和監(jiān)測(cè)腫瘤進(jìn)展以及復(fù)發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)方法涉及尿細(xì)胞學(xué)、膀胱鏡和活檢檢查。盡管BLCA 尿液標(biāo)志物如膀胱腫瘤抗原（BTA）和NMP22等已用于臨床尿樣檢測(cè)，但至今臨床應(yīng)用并不如細(xì)胞學(xué)檢查廣泛，主要原因可能存在許多干擾因素，如炎癥、血尿等會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果。RC 的診斷以臨床表現(xiàn)和影像學(xué)檢查為主，大多數(shù)患者確診時(shí)已到晚期。因此，RC 的早期篩選和診斷至關(guān)重要。PCa 目前篩查的手段主要包括前列腺特異性抗原（PSA）/前列腺特異性膜抗原（PSMA）血清水平的測(cè)量、直腸指診（DRE）和前列腺活檢。PSA 是PCa 檢測(cè)、隨訪和治療監(jiān)測(cè)中最重要的生物標(biāo)志物，采用PSA 血清檢測(cè)可顯著降低PCa 的死亡率，但同時(shí)也導(dǎo)致了對(duì)惰性PCa 的過(guò)度診斷和治療。

基于MS 的尿蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在常見(jiàn)的泌尿系統(tǒng)腫瘤生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)中的研究匯總，見(jiàn)表2。提示其中BLCA 相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，不同于以往疾病組和健康對(duì)照組的樣本策略，Li 等[13]利用iTRAQ標(biāo)記定量技術(shù)對(duì)發(fā)現(xiàn)組中BLCA Ⅲ期患者的術(shù)前和術(shù)后尿樣進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析，該研究通過(guò)驗(yàn)證確認(rèn)了一組具有代表性的候選生物標(biāo)志物分子，其表達(dá)水平的改變與BLCA 患者的復(fù)發(fā)率顯著相關(guān)。因此，這些分子可能成為監(jiān)測(cè)和預(yù)測(cè)BLCA 的有用生物標(biāo)志物。這種同一患者術(shù)前術(shù)后的樣本設(shè)計(jì)很大程度降低了尿液中混雜因素的影響。

表2 常見(jiàn)泌尿系統(tǒng)腫瘤中發(fā)現(xiàn)的潛在尿蛋白生物標(biāo)志物

3.2 呼吸系統(tǒng)腫瘤

肺癌（lung cancer，LC）在國(guó)際上是男性中最常被診斷的癌癥，也是癌癥死亡的主要原因之一。肺癌分為兩種類型：小細(xì)胞肺癌（small cell lung cancer，SCLC）和非小細(xì)胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）。目前用于LC 診斷的方法有胸部X 光、CT、PET、痰細(xì)胞學(xué)和支氣管鏡檢查等。但這些既耗時(shí)又昂貴并且存在受到輻射照射的危險(xiǎn)。癌胚抗原（CEA）、鱗狀細(xì)胞癌抗原（SCC-Ag）和神經(jīng)元特異性烯醇化酶（NSE）是檢測(cè)肺癌、監(jiān)測(cè)病情進(jìn)展和疾病復(fù)發(fā)的常用血清標(biāo)志物。然而，對(duì)于局限性腫瘤，上述標(biāo)志物的診斷能力相對(duì)較差。事實(shí)上，多數(shù)LC 病例是在進(jìn)展期或晚期發(fā)現(xiàn)的，因此增加了癌癥相關(guān)的死亡率。

基于MS 的尿蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在常見(jiàn)的呼吸系統(tǒng)腫瘤生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)中的研究匯總，見(jiàn)表3。其中Ma 等[20]通過(guò)DIA 定量蛋白質(zhì)組學(xué)MS 技術(shù)，發(fā)現(xiàn)NSCLC 患者尿液中蘋果酸脫氫酶2（MDH2）含量顯著高于對(duì)照組，并通過(guò)ELISA 方法對(duì)1 091 例NSCLC患者和736 例健康對(duì)照組的尿液樣本進(jìn)行驗(yàn)證，該研究表明，與對(duì)照組相比，早期 NSCLC 患者的尿MDH2濃度更高，提示MDH2 可能作為早期檢測(cè)NSCLC 的潛在生物標(biāo)志物。該項(xiàng)研究樣本量相對(duì)較大，增加了研究結(jié)果的可信度和說(shuō)服力，但健康人群與NSCLC患者的人口學(xué)特征并不完全匹配，以及尿液中MDH2蛋白在NSCLC 中的特異性均需進(jìn)一步的驗(yàn)證和研究。

表3 常見(jiàn)呼吸系統(tǒng)腫瘤中發(fā)現(xiàn)的潛在尿蛋白生物標(biāo)志物

3.3 乳腺及婦科腫瘤

乳腺癌（breast cancer，BC） 是女性中最常見(jiàn)的惡性腫瘤，目前診斷程序的第一步包括乳房檢查和影像學(xué)檢查。盡管目前檢測(cè)到早期BC 的病例數(shù)大幅增加，但篩查性乳房X 光檢查僅略微降低了晚期癌癥的檢出率，這種不平衡表明存在嚴(yán)重的過(guò)度診斷。在篩查試驗(yàn)呈陽(yáng)性結(jié)果的情況下，需要進(jìn)行乳腺活檢，通過(guò)檢查細(xì)胞形態(tài)學(xué)來(lái)確認(rèn)癌癥的存在。乳腺活檢是一種侵入性檢查，對(duì)患者來(lái)說(shuō)具有一定的風(fēng)險(xiǎn)。卵巢癌（ovarian cancer，OC）盡管在手術(shù)和免疫治療等方面取得了巨大進(jìn)步，但OC 的5年總生存率僅為45%[24]。腫瘤抗原125（CA125）是OC 中應(yīng)用最廣泛的血清標(biāo)志物，但缺乏足夠的診斷敏感度和特異性使其難以用于早期診斷。子宮內(nèi)膜癌（endometrial cancer，ECa）的治療主要是手術(shù)治療。晚期或轉(zhuǎn)移性ECa 的患者預(yù)后較差，其5年生存率<20%，與早期患者>90%的5年生存率相比，復(fù)發(fā)的風(fēng)險(xiǎn)更高[25]。

基于MS 的尿蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在乳腺癌及常見(jiàn)的婦科腫瘤生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)中的研究匯總，見(jiàn)表4。其中Ye 等[26]通過(guò)SELDI-TOF-MS 和ELISA 方法，對(duì)收集的128 例卵巢癌患者、118 例其他類型疾病患者和188 例健康對(duì)照組的尿液樣本進(jìn)行分析驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)聯(lián)用來(lái)自嗜酸性粒細(xì)胞源性神經(jīng)毒素（EDN）和骨橋蛋白（OPN）的片段，對(duì)于早期OC 診斷的靈敏度和特異性分別達(dá)到72%和93%。該研究值得注意的是通過(guò)對(duì)健康對(duì)照組和不同類型疾病組進(jìn)行了尿蛋白質(zhì)組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)卵巢癌特異的潛在生物標(biāo)志物，這樣的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)為癌癥的特異性研究提供了有價(jià)值的參考。

表4 乳腺及常見(jiàn)婦科腫瘤中發(fā)現(xiàn)的潛在尿蛋白生物標(biāo)志物

表4 乳腺及常見(jiàn)婦科腫瘤中發(fā)現(xiàn)的潛在尿蛋白生物標(biāo)志物 （續(xù)表4）

3.4 消化系統(tǒng)腫瘤

消化系統(tǒng)腫瘤是臨床上常見(jiàn)的惡性腫瘤，如肝癌（hepatic cancer，HCC）、結(jié)直腸癌（colorectal cancer，CRC）、胰腺癌（pancreatic cancer，PaC）、胃癌（gastric cancer，GC）等腫瘤，其發(fā)病率較高，盡管用于診斷的腫瘤標(biāo)志物較多，但目前尚沒(méi)有特異性和靈敏度均較高的診斷方法。HCC 目前的診斷方法主要依賴于成像技術(shù)，但成本較高且耗時(shí)，不適用于早期肝癌的大規(guī)模篩查。盡管甲胎蛋白（AFP）、脫-γ-羧基凝血酶原（DCP）和肝素結(jié)合細(xì)胞因子（MDK）等已被報(bào)道為HCC 特異的生物標(biāo)志物，但由于實(shí)際檢測(cè)的敏感性和特異性較低，研究人員仍在努力尋找新的生物標(biāo)志物。CRC 目前檢測(cè)的“金標(biāo)準(zhǔn)”是內(nèi)窺鏡檢查，但其具有高侵入性及潛在的并發(fā)癥等風(fēng)險(xiǎn)。臨床數(shù)據(jù)顯示Ⅰ期CRC 患者的5年生存率為93%，而Ⅳ期僅為8%。因此，早期發(fā)現(xiàn)CRC 可顯著提高患者的生存率。雖然近年來(lái)一些CRC 生物標(biāo)志物，如CEA，已經(jīng)應(yīng)用于當(dāng)前的臨床診斷中，但其靈敏度和特異性相對(duì)較差。PaC 目前根治的唯一手段是外科手術(shù)。然而，僅有20%～25% 的患者在疾病切除有效的早期階段被診斷出來(lái)[32]。在目前的診斷方法中，通常將糖類抗原19-9（CA19-9）血清檢測(cè)作為PaC 的輔助檢測(cè)。然而，盡管CA19-9 的敏感性可達(dá)80%，但其特異性較低，不適用于可切除期PaC 的檢測(cè)。GC 的常見(jiàn)癥狀也見(jiàn)于胃良性疾病，由于不是癌癥特異性的，因此通常在進(jìn)展期或晚期被確診出來(lái)，降低了治療的效果和患者存活的機(jī)會(huì)。然而，對(duì)于早期胃癌手術(shù)治療后5年生存率在90%以上，這突出了在高危人群中進(jìn)行早期篩查的重要性。目前，臨床使用的胃腸道腫瘤血清學(xué)蛋白生物標(biāo)志物，包括CEA、CA19-9 和癌抗原72-4（CA724），但由于其在GC 患者中的陽(yáng)性率<40%，且在早期胃癌患者中低于20%，不足以用于GC 的早期診斷。

基于MS 的尿蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在常見(jiàn)的消化系統(tǒng)腫瘤生物標(biāo)志物發(fā)現(xiàn)中的研究匯總，見(jiàn)表5。與傳統(tǒng)ELISA 和Western blot 驗(yàn)證方法不同，Br?ker 等[33]利用非靶向蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)發(fā)現(xiàn)潛在的候選標(biāo)志物，再通過(guò)靶向蛋白質(zhì)組學(xué)MRM 定量技術(shù)進(jìn)行候選標(biāo)志物的驗(yàn)證，從而系統(tǒng)地對(duì)24 例直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者和25 例健康對(duì)照的尿液標(biāo)本進(jìn)行差異表達(dá)多肽篩選和進(jìn)一步多肽組的驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)兩個(gè)有潛力的多肽其敏感性和特異性分別為88% 和88%，很可能作為直腸癌肝轉(zhuǎn)移患者的無(wú)創(chuàng)檢測(cè)。該研究分別利用不同MS 技術(shù)的優(yōu)勢(shì)在發(fā)現(xiàn)組和驗(yàn)證組進(jìn)行標(biāo)志物篩選和驗(yàn)證研究，將蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)合理應(yīng)用于不同實(shí)驗(yàn)分析中，但試驗(yàn)納入的樣本量較少，且亟需大量樣本進(jìn)行后續(xù)驗(yàn)證。

表5 常見(jiàn)消化系統(tǒng)癌癥中發(fā)現(xiàn)的潛在尿蛋白生物標(biāo)志物

表5 常見(jiàn)消化系統(tǒng)癌癥中發(fā)現(xiàn)的潛在尿蛋白生物標(biāo)志物 （續(xù)表5）

4 結(jié)語(yǔ)與展望

尿液本身具有非侵入性、收集簡(jiǎn)單、蛋白質(zhì)穩(wěn)定、種類多且不受機(jī)體穩(wěn)態(tài)機(jī)制調(diào)控等先天優(yōu)勢(shì)。目前，尿蛋白質(zhì)組學(xué)在腫瘤標(biāo)志物研究中需要解決的主要問(wèn)題包括：擴(kuò)大臨床驗(yàn)證組的樣本量、促進(jìn)臨床多中心合作和提高候選標(biāo)志物在其他腫瘤中的驗(yàn)證研究。查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)，基于MS 技術(shù)在尿液中尋找用于腫瘤早期診斷的生物標(biāo)志物不僅僅局限于蛋白質(zhì)組學(xué)的研究，其研究對(duì)象和領(lǐng)域已涉及多種物質(zhì)，如氨基酸、激素、揮發(fā)性有機(jī)化合物[38]等。有研究系統(tǒng)對(duì)基于MS 技術(shù)在4 種高發(fā)癌癥常見(jiàn)標(biāo)本中發(fā)現(xiàn)的腫瘤蛋白標(biāo)志物進(jìn)行了綜述，其中匯總的常見(jiàn)標(biāo)本主要為血清和組織樣本，旨在闡明腫瘤的發(fā)生發(fā)展機(jī)制、開(kāi)展精準(zhǔn)的靶向治療，為實(shí)現(xiàn)腫瘤精準(zhǔn)診療提供新的理論依據(jù)[39]。本文主要匯總了基于MS 技術(shù)在多種常見(jiàn)腫瘤尿液樣本中發(fā)現(xiàn)的蛋白標(biāo)志物，旨在尋找疾病早期高靈敏度和高特異性的候選生物標(biāo)志物，為腫瘤的早診早治提供更多的臨床依據(jù)。

隨著蛋白質(zhì)組學(xué)檢測(cè)技術(shù)的不斷進(jìn)步和尿中微量蛋白檢測(cè)靈敏度及穩(wěn)定性的不斷提高，尿蛋白質(zhì)組學(xué)在腫瘤標(biāo)志物的研究已經(jīng)取得了很大進(jìn)步。由于任何一種尿液腫瘤標(biāo)志物的研究都有其局限性，在臨床應(yīng)用中應(yīng)當(dāng)采用單一生物標(biāo)志物（或生物標(biāo)志物組）或與臨床檢測(cè)相結(jié)合等手段聯(lián)合分析。此外，伴隨日新月異的基因檢測(cè)新技術(shù)的涌現(xiàn)和成熟，結(jié)合血清腫瘤標(biāo)志物、基因標(biāo)志物和尿蛋白質(zhì)標(biāo)志物的聯(lián)合診斷，期待高靈敏度、高特異性且便捷的腫瘤生物標(biāo)志物技術(shù)被更好地應(yīng)用于臨床，受益于腫瘤患者。