基于生物信息學(xué)分析GLIS3在胃癌中表達與免疫浸潤的臨床意義

王 瑞，馬騰達，屈才浩，李玉民△

(1.蘭州大學(xué)第二醫(yī)院普外科，蘭州 730030；2.甘肅省消化系腫瘤重點實驗室，蘭州 730030)

胃癌是全世界最常見的惡性腫瘤之一，2020年全球最新癌癥統(tǒng)計顯示：新發(fā)病例超過100萬,估計死亡病例76.9萬，已經(jīng)成為第五大最常見的癌癥和第四大癌癥死亡原因[1]。目前，全球43.9%的胃癌新發(fā)病例和48.6%的胃癌致死病例發(fā)生在中國，對我國的公共衛(wèi)生領(lǐng)域構(gòu)成了極大的挑戰(zhàn)[2]。盡管目前以手術(shù)、放化療、靶向治療和免疫治療的聯(lián)合治療改善了胃癌患者的生存和預(yù)后，但進展期胃癌患者接受手術(shù)后的5年生存率仍不理想[3-4]。因此，尋找胃癌相關(guān)的診斷及預(yù)后標志物對于改善胃癌患者的預(yù)后具有重要意義。

GLIS3基因位于染色體9p24.2上，共有11個外顯子，編碼930個氨基酸，它是GLI樣鋅指蛋白家族的成員之一，其異常表達與一些病理狀態(tài)有關(guān)，如骨質(zhì)疏松癥、肋骨骨折、甲狀腺功能減退癥、胰腺功能不全和糖尿病[5]。近年來，隨著基因組學(xué)、分子生物學(xué)的快速發(fā)展，發(fā)現(xiàn)GLIS3的異常表達與癌癥有關(guān)，如上皮瘤[6]、乳腺癌[7]等，但GLIS3在胃癌中的作用仍不清楚。本研究通過生物信息學(xué)方法分析TCGA數(shù)據(jù)庫數(shù)據(jù)，探討GLIS3在胃癌中的表達及其與免疫浸潤、預(yù)后的意義，并預(yù)測調(diào)控GLIS3表達的微RNA(microRNA,miRNA)和GLIS3在胃癌可能參與的生物學(xué)功能，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

從TCGA數(shù)據(jù)庫(http://www.tcga.org)下載胃癌mRNA-seq數(shù)據(jù)、miRNA-seq數(shù)據(jù)及臨床相關(guān)數(shù)據(jù)，其中包括375個腫瘤組織和32個正常組織。使用R及perl軟件整理合并數(shù)據(jù)文件。排除了生存時間缺失和臨床信息不完整的標本。

1.2 方法

1.2.1GLIS3在腫瘤中的表達差異分析

利用TIMER數(shù)據(jù)庫(http://timer.comp-genomics.org/)分析GLIS3在不同腫瘤中的表達水平。使用R軟件提取GLIS3在胃癌組織標本和癌旁組織標本的表達數(shù)據(jù)，分析GLIS3在胃癌組織及癌旁組織標本中的表達差異,并分析其在26例配對胃癌及癌旁組織標本的表達水平，使用GEPIA在線工具(http://gepia2.cancer-pku.cn/)進行表達差異驗證。用受試者工作特征(ROC)曲線評價GLIS3在胃癌中的診斷性能。

1.2.2GLIS3表達水平與患者臨床病理特征的相關(guān)性分析

根據(jù)下載整理的患者臨床病理信息，匹配GLIS3表達水平，研究GLIS3與年齡、性別、組織學(xué)分級、TNM分期等臨床相關(guān)性。

1.2.3GLIS3表達水平與胃癌患者的生存分析

以GLIS3表達水平中位數(shù)為截斷值，將患者分為高表達組和低表達組，比較兩組間的生存差異，并用“survival”包繪制生存曲線。同時使用GEPIA進一步驗證GLIS3在胃癌患者中的生存關(guān)系。采用單因素和多因素Cox回歸分析判斷GLIS3在胃癌中的預(yù)后價值。

1.2.4預(yù)測胃癌中調(diào)控GLIS3異常表達的miRNA

運用miRWALK(3.0)、TargetScan v7.2數(shù)據(jù)庫預(yù)測調(diào)控GLIS3的miRNA,并與TCGA數(shù)據(jù)庫篩選得到的差異表達的miRNA取交集獲得共同的miRNA。進一步通過線性回歸分析，確定胃癌中調(diào)控GLIS3異常表達的miRNA。

1.2.5基因富集分析

采用GSEA(版本4.0.3)以分子特征數(shù)據(jù)庫中c2.cp.kegg.v7.0.symbols.gmt數(shù)據(jù)集作為功能基因集，對GLIS3高表達數(shù)據(jù)集進行基因富集分析。P<0.05和錯誤發(fā)生率(false discovery rate,FDR)<0.25的基因集作為明顯富集的基因集。

1.2.6免疫浸潤分析

運用TIMER數(shù)據(jù)庫分析GLIS3表達水平與胃癌免疫細胞浸潤水平的相關(guān)性，包括CD4+T、CD8+T和巨噬細胞等。另外，將375例腫瘤標本以GLIS3表達水平中位數(shù)為界分為高、低表達兩組。使用CIBERSORT算法(http：//cibersort.stanford.edu/)評估兩組中免疫細胞占比，繪制22種免疫細胞在GLIS3高低表達組占比的小提琴圖。

1.3 統(tǒng)計學(xué)處理

計數(shù)資料以頻數(shù)表示，兩組間比較采用Wilcoxon秩和檢驗；生存分析采用Kaplan-Meier法，采用Log-rank檢驗生存差異；相關(guān)性分析采用Pearson相關(guān)性分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 GLIS3在胃癌和癌旁組織中的表達差異

與癌旁組織比較，GLIS3在膽管癌、子宮內(nèi)膜癌、胃癌等腫瘤中高表達，見圖1。TCGA數(shù)據(jù)庫中，GLIS3在胃癌組織中表達水平明顯高于癌旁組織(P<0.05)，26例配對的胃癌組織中GLIS3也高表達。同樣，GEPIA數(shù)據(jù)庫的驗證結(jié)果顯示，GLIS3在胃癌組織中的表達也高于癌旁組織(P<0.05)。另外，通過ROC曲線分析顯示，GLIS3對胃癌具有明顯的診斷價值，曲線下面積(AUC)=0.763(P<0.05)，見圖2。

圖1 TIMER數(shù)據(jù)庫中GLIS3在不同腫瘤組織和癌旁組織中的表達

A:TCGA數(shù)據(jù)庫中GLIS3胃癌及癌旁組織中的表達；B:TCGA數(shù)據(jù)庫中GLIS3在配對胃癌及癌旁組織中的表達；C：GEPIA數(shù)據(jù)庫中GLIS3在胃癌及癌旁組織中的表達；D：GLIS3診斷胃癌的ROC曲線；a：P<0.05。

2.2 GLIS3表達與胃癌患者臨床病理特征的關(guān)系

GLIS3表達與患者腫瘤組織學(xué)分級相關(guān)(P<0.05)，而與年齡、性別、TNM分期、T分期、N分期無關(guān)，見圖3。

2.3 GLIS3表達水平與胃癌患者預(yù)后的關(guān)系

TCGA數(shù)據(jù)庫得到的生存曲線表明，GLIS3的差異表達明顯影響胃癌患者生存預(yù)后，與低表達組比較，GLIS3高表達組總體生存期明顯降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。GEPIA在線數(shù)據(jù)庫生存曲線同樣表明，GLIS3高表達組生存率明顯低于低表達組(P<0.05)，見圖4。單因素和多因素Cox回歸分析顯示，GLIS3表達是影響胃癌患者預(yù)后的獨立危險因素，見表1。

圖3 GLIS3表達與胃癌患者臨床病理資料的相關(guān)性

表1 影響胃癌患者預(yù)后的Cox單因素及多因素回歸分析

2.4 調(diào)控GLIS3異常表達的miRNA

miR-204-5p是調(diào)控GLIS3表達的潛在miRNA。在TCGA數(shù)據(jù)庫中，與癌旁組織比較，胃癌組織中miR-204-5p表達明顯下調(diào)(P<0.001)。且在配對的胃癌組織中也明顯下調(diào)，通過相關(guān)性分析顯示，miR-204-5p與GLIS3 mRNA表達情況呈明顯負相關(guān)(r=—0.17,P<0.001)，見圖5。

2.5 基因富集分析預(yù)測GLIS3的功能

GSEA富集分析共篩選出與GLIS3高表達相關(guān)的12個P<0.05且FDR<0.25的基因集，選取7個有意義的信號通路，發(fā)現(xiàn)GLIS3高表達主要富集在細胞外基質(zhì)(ECM)受體相互作用、鈣、黏著斑、縫隙連接、腫瘤、絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)、緊密連接這些信號通路，見表2、圖6。

表2 GLIS3在胃癌中的基因富集分析

續(xù)表2 GLIS3在胃癌中的基因富集分析

A：TCGA數(shù)據(jù)庫中GLIS3表達與胃癌患者預(yù)后的生存曲線；B：GEPIA數(shù)據(jù)庫中GLIS3與胃癌患者預(yù)后的生存曲線。

A：miR-204-5p在胃癌組織及癌旁組織中的表達水平；B:miR-204-5p在配對胃癌組織及癌旁組織中的表達水平；C：miR-204-5p表達與GLIS3表達之間的相關(guān)性;a:P<0.05。

2.6 GLIS3表達與胃癌組織中免疫細胞浸潤水平的關(guān)系

使用TIMER數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，GLIS3表達與胃癌組織中CD4+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞和樹突狀細胞均呈正相關(guān)(P<0.05)，相關(guān)系數(shù)分別為0.194、0.314、0.147、0.174。以GLIS3表達的中位值為界，將375個腫瘤標本分為高低表達兩組，使用CIBESORT算法分析22種免疫細胞表達水平的差異，結(jié)果顯示記憶B細胞、巨噬細胞(M2)、靜止樹突狀細胞、活化的樹突狀細胞是受GLIS3表達影響的主要細胞，其中高表達組的巨噬細胞(M2)、靜止樹突狀細胞增加(P<0.05)，而活化的樹突狀細胞減少(P<0.05)，見圖7。

圖6 GLIS3在胃癌中的相關(guān)通路

A:GLIS3表達與免疫浸潤水平之間的相關(guān)性；B:腫瘤標本中GLIS3高表達和低表達組中22種免疫細胞小提琴圖。

3 討 論

胃癌的發(fā)生是癌基因、抑癌基因、細胞黏附因子、DNA修復(fù)基因、遺傳不穩(wěn)定性及端粒酶活化等多種因素共同作用的結(jié)果，而轉(zhuǎn)錄因子在胃癌的發(fā)生、發(fā)展中也發(fā)揮著重要的作用。GLIS3基因中的鋅指結(jié)構(gòu)區(qū)和C末端轉(zhuǎn)錄激活區(qū)在其發(fā)揮轉(zhuǎn)錄激活功能中起到重要作用[8]。GLIS3的過表達已在多種腫瘤細胞類型中發(fā)現(xiàn)，包括甲狀腺癌[9]、結(jié)直腸癌[10]和黑色素瘤[11]。此外。RAMI等[7]檢測了15例新鮮乳腺癌組織和癌旁組織GLIS3基因mRNA的含量，發(fā)現(xiàn)癌組織中GLIS3表達明顯高于癌旁正常組織，同時使用免疫組織化學(xué)技術(shù)檢測了雌激素受體、孕激素受體和人類表皮生長因子受體-2(HER-2)的表達情況，發(fā)現(xiàn)三陰性乳腺癌中的GLIS3同樣高表達。因此，GLIS3有助于三陰性乳腺癌的診斷和預(yù)后，或許還可作為這些患者治療的靶點。本研究首先進行GLIS3基因的泛癌表達分析，發(fā)現(xiàn)其在包括胃癌的多種腫瘤中高表達，再利用TCGA數(shù)據(jù)庫證實了GLIS3在胃癌組織中明顯上調(diào)，且對胃癌具有一定的診斷價值，進一步研究發(fā)現(xiàn)GLIS3高表達與胃癌患者預(yù)后不良有關(guān)，COX回歸模型再次驗證：GLIS3表達是胃癌患者的獨立危險因素，可作為胃癌潛在的預(yù)后標志物。

為了進一步研究胃癌中GLIS3基因異常表達的潛在機制，本研究使用多個數(shù)據(jù)庫預(yù)測其上游的miRNAs。miRNAs作為一類內(nèi)源性非編碼短RNA，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展中扮演著重要作用，其作為腫瘤致癌或抑癌因子參與腫瘤細胞增殖、分化、侵襲和轉(zhuǎn)移等生物過程[12]。既往研究表明，miR-204-5p作為腫瘤抑制因子在結(jié)腸癌[13]、肺癌[14]、前列腺癌[15]、胃癌[16]等癌癥中明顯下調(diào)。YANG等[17]研究發(fā)現(xiàn)miR-204-5p在胃癌組織中明顯下調(diào)，且通過調(diào)節(jié)HER-2來抑制細胞增殖、遷移和侵襲，并促進細胞凋亡，從而發(fā)揮其抗腫瘤功能，這可能是胃癌的一個潛在治療靶點。ZHANG等[18]研究表明miR-204-5p通過靶向CXCR4和CXCL12來調(diào)控胃癌的侵襲和遷移，且miR-204-5p低表達與胃癌的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)。本研究結(jié)果顯示，miR-204-5p在胃癌組織表達明顯下調(diào)，這與此前的研究報道結(jié)論一致，且miR-204-5p與GLIS3表達呈負相關(guān)。因此，推測GLIS3在胃癌中的異常表達，可能是由于miR-204-5p表達下調(diào)造成的，但仍需進一步研究證實。

本研究使用GSEA分析了GLIS3可能參與的生物學(xué)通路，高表達標本主要富集到ECM受體相互作用、鈣、黏著斑、縫隙連接、腫瘤、MAPK、緊密連接等，其中ECM受體相互作用是富集分數(shù)最高的信號途徑，它在腫瘤的脫落、黏附、降解和增生過程中發(fā)揮著重要作用[19]，并參與了胃癌的侵襲和轉(zhuǎn)移過程[20]。此外，在侵襲性黑色素瘤中，GLIS3表達水平升高與E-鈣黏蛋白表達水平降低有關(guān)，且通過siRNA下調(diào)GLIS3的表達后可抑制黑色素瘤細胞的遷移和侵襲[11]。本研究表明GLIS3的表達與胃癌的分化程度相關(guān)，因此，推測GLIS3的表達增加可能會促進癌細胞增殖、遷移和轉(zhuǎn)移，有研究證實可能與刺激了上皮-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)有關(guān)[21]，而EMT是腫瘤最常見的侵襲和轉(zhuǎn)移起始原因[22]。因此，GLIS3可能是通過參與細胞的增殖和侵襲轉(zhuǎn)移過程影響患者的生存，進一步證實GLIS3可以作為預(yù)測患者腫瘤轉(zhuǎn)移、判斷預(yù)后的有效生物標志物。

此外，TIMER數(shù)據(jù)庫分析結(jié)果顯示GLIS3的表達與CD4+T細胞、巨噬細胞、中性粒細胞、樹突狀細胞具有相關(guān)性。CIBESORT算法結(jié)果表明GLIS3高表達組中，巨噬細胞(M2)、靜止樹突狀細胞增加，這與TIMER數(shù)據(jù)庫得到的結(jié)論一致。既往研究表明巨噬細胞通過分泌多種細胞因子來促進腫瘤的生長和轉(zhuǎn)移，且巨噬細胞浸潤程度越高，胃癌患者預(yù)后越差[23]。這可能提示GLIS3的過表達有效促進了巨噬細胞的免疫反應(yīng)和浸潤。

綜上所述，GLIS3有望成為胃癌潛在的診斷及預(yù)后分子標志物。同時，本研究還探討了GLIS3異常表達的潛在調(diào)控機制、可能參與的生物學(xué)功能和免疫浸潤之間的關(guān)系，為后續(xù)深入研究GLIS3基因與胃癌的關(guān)系提供了理論支持。