王仕超,劉 斌,趙 星,任曉敏,潘園園,李 霞,徐淑英
(1.內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市第一醫(yī)院醫(yī)學遺傳實驗室,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030;2.內(nèi)蒙古自治區(qū)人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科,內(nèi)蒙古 呼和浩特 010030)
多形性膠質(zhì)母細胞瘤(glioblastoma multiforme,GBM)是原發(fā)性中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤中最常見的一類惡性腫瘤,其預后較差[1]。隨著對神經(jīng)膠質(zhì)瘤相關機制研究的逐步深入,有學者通過靶向阻斷神經(jīng)膠質(zhì)瘤增殖、侵襲或遷移的關鍵信號通路,達到了治療神經(jīng)膠質(zhì)瘤的目的[2-3],這是一種理論上可行,且具有廣闊應用前景的新型治療方法[4]。在細胞特定狀態(tài)下進行全轉(zhuǎn)錄組的研究,可以從轉(zhuǎn)錄層面系統(tǒng)地揭示生物學背后的調(diào)控規(guī)律。目前,學者們對非編碼RNA(non-coding RNA,ncRNA)的研究主要集中在微小RNA(microRNA,miRNA)、長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)和環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)上。多項研究證實,高頻突變轉(zhuǎn)錄本在細胞周期、能量代謝和信號傳導等方面發(fā)揮重要作用,或可作為潛在的生物標志物應用于臨床腫瘤的靶向治療[5-6]。近年來,Hh(Hedgehog)通路異常激活與各種惡性腫瘤之間的關系越來越受到重視[7]。BOC蛋白作為Hh通路上游的跨膜蛋白,能夠通過增加局部Hh配體濃度或延長與Hh配體結(jié)合時間來放大Hh信號[8],提示BOC蛋白可以影響整個中樞神經(jīng)系統(tǒng)的Hh通路反應。本研究擬在轉(zhuǎn)錄組水平揭示GBM增殖、侵襲的發(fā)生、發(fā)展機制,探尋具體有哪些關鍵基因參與了GBM的進展,在此基礎上構(gòu)建circRNA-miRNA -mRNA、lncRNA-miRNA-mRNA的關聯(lián)分析,進一步驗證BOC蛋白對GBM的生物學作用機制,為臨床制定診療方案提供更可靠的理論依據(jù)。
選取2018年11月—2019年2月呼和浩特市第一醫(yī)院GBM患者4例,其中男2例、女2例,年齡43~65歲;另選取2019年12月呼和浩特市第一醫(yī)院65歲男性GBM患者1例。所有患者均依據(jù)《中國中樞神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)瘤診斷與治療指南(2015)》[9]確診,病理學分期為Ⅳ級。本研究經(jīng)呼和浩特市第一醫(yī)院倫理委員會批準,所有患者或家屬均知情同意并簽署知情同意書。
收集手術中切除的癌組織和癌旁組織(距癌組織邊緣1 cm)。以0.5 cm為標準直徑對癌組織樣本及癌旁組織樣本進行塊狀切割,用0.9%Nacl溶液沖洗后,用滅菌凍存管封存,并做好標記,立即儲存于液氮罐內(nèi)。
樣本測序工作由天津諾禾致源基因測序公司完成,其中miRNA和lncRNA均獨立建庫,circRNA采用lncRNA建庫,去除樣本中的核糖體RNA(ribosomal RNA,rRNA)后,對線性RNA和circRNA進行測序。將2018年11月—2019年2月收集的4例GBM患者分別作為A組、B組、C組、D組。4例患者的癌組織樣本分別編號為AT、BT、CT、DT;對應的癌旁組織編號為AC、BC、CC、DC。4組混測的癌組織編號為Q1,癌旁組織編號為Q2。4組混測方法與單樣本測序方法一致。
主要分析內(nèi)容包括樣本總RNA檢測、分類注釋、已知miRNA分析、ncRNA分析、重復序列比對、新miRNA預測、小分子RNA(small RNA,sRNA)分類注釋統(tǒng)計、miRNA分析、miRNA堿基編輯分析、miRNA家族分析、miRNA表達及差異分析、miRNA靶基因預測、差異miRNA靶基因富集分析、差異lncRNA表達共定位、基因本體(Gene Ontology,GO)富集(包括分子功能、生物學過程和細胞組分)及京都基因與基因組數(shù)據(jù)庫(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析。
采用實時熒光定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction,PCR)檢測5例GBM患者組織樣本中BOCmRNA的相對表達量。PCR試劑盒購自上海英拜生物有限公司,檢測儀器為QuantStudio 6 Flex熒光定量PCR儀(美國ABI公司)。引物由上海吉凱生物有限公司合成。引物序列見表1。反應體系:2×Master Mix 5.0 μL,PCR引物(10 μmol/L)各0.3 μL,加ddH2O至總體積為9 μL。反應條件:95℃ 10 min;95℃ 15 s,60℃60 s,45個循環(huán)。以GAPDH為內(nèi)參,采用2-ΔΔCt法計算BOCmRNA的相對表達量。
表1 引物序列
高通量測序分析共篩選出3 088個癌組織與癌旁組織差異表達的mRNA,其中表達上調(diào)1 375個,表達下調(diào)1 713個,見圖1(a)。表達上調(diào)居前10位的基因分別為CUL2、HDGF、BOC、PTCH1、ACY1、BCL2L13、CRYAB、WNT5B、PIK3R3、ZNF658。表達下調(diào)居前10位的基因分別為PKA、Slmb、CK1、MMP8、LSM4、NFATC1、ZNF211、WDR7、MMP13、SHTN1。
4組間共有差異基因33個,分別為HIVEP2、NUB1、OLIG1、BOC、SOX8、LLGL1、PTK2B、SEMA6D、PRUNE2、SPOP、IL11RA、MAP4K4、SPOCK3、GPRASP1、POGZ、HIP1R、CALM3、ANK2、DIO2、OLIG2、DCX、F5、CLU、FLNB、KCNIP4、AK5、ZEB2、POU2F1、KCNJ10、RABGAP1L、BMPR1B、VIPR2、RHOT1。A組中癌組織與癌旁組織差異基因1 669個,其中表達上調(diào)768個、表達下調(diào)901個;B組差異基因3 571個,其中表達上調(diào)1 717個、表達下調(diào)1 854個;C組差異基因4 354個,其中表達上調(diào)1 715個、表達下調(diào)2 639個;D組差異基因5 708個,其中表達上調(diào)2 750個、表達下調(diào)2 958個。見圖1(b)。
對差異表達的mRNA進行KEGG通路富集分析,選擇富集最顯著的20條通路信息,涉及的KEGG通路包括癌信號途徑、絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase,MAPK)信號通路、cAMP信號通路、軸突導向及鈣信號途徑等通路。見圖1(c)。這些通路與免疫反應、氨基酸代謝、細胞增殖、蛋白轉(zhuǎn)運等生理生化反應有關。
對3 088個差異表達基因進行GO富集分析。結(jié)果顯示,有2 206個基因涉及生物學過程,其中1 082個表達上調(diào)、1 124個表達下調(diào);有2 311個基因涉及細胞組分,其中901個表達上調(diào)、1 410個表達下調(diào);有2 222個基因涉及分子功能,其中866個表達上調(diào)、1 356個表達下調(diào)。見圖1(d)。
圖1 mRNA測序分析結(jié)果
測序結(jié)果顯示,差異表達的lncRNA共有106個,其中表達上調(diào)52個,包括lnc_000266、lnc_000276、lnc_000417、lnc_000510、lnc_000565、lnc_000662、lnc_000853、lnc_001155、lnc_001315、lnc_001370、lnc_001788、lnc_001827等;表達下調(diào)54個,包括ENST00000572151、lnc_000009、lnc_000021、lnc_000036、lnc_000115、lnc_000410、lnc_000467等。見圖2(a)。
4組間共有的差異lncRNA數(shù)目為0,見圖2(b)。A組和B組篩選出的癌組織與癌旁組織差異表達的lncRNA均為151個,C組和D組分別篩選出221和290個。
KEGG通路富集結(jié)果顯示,差異lncRNA共表達mRNA主要涉及的細胞通路有血小板活化及基礎轉(zhuǎn)錄因子、環(huán)磷酸鳥苷蛋白激酶信號以及神經(jīng)活性配體-受體互作等相關途徑。見圖2(c)。
對1 098個差異表達的lncRNA靶基因進行GO富集分析,其中685個基因表達上調(diào)、413個基因表達下調(diào),見圖2(d)。
圖2 lncRNA測序分析結(jié)果
測序得到差異表達的circRNA共82個,其中表達上調(diào)32個,包括hsa_circ_0047720、hsa_circ_0050334、hsa_circ_0067774、hsa_circ_0068375、hsa_circ_0069397、hsa_circ_0069982、hsa_circ_0078241等;表達下調(diào)50個,包括hsa_circ_0004027、hsa_circ_0004101、hsa_circ_0004550、hsa_circ_0006323、hsa_circ_0006528、hsa_circ_0010459、hsa_circ_0010466、hsa_circ_0017673、hsa_circ_0027641等。見圖3(a)。
4組間共有的差異circRNA為245個,其中已知的circRNA 156個,包括hsa_circ_0000814、hsa_circ_0000894、hsa_circ_0000970、hsa_circ_0001277、hsa_circ_0001289、hsa_circ_0001475等;新定義circRNA 89個,包括novel_circ_0000585、novel_circ_0000886、novel_circ_0001046、novel_circ_0002180、novel_circ_0002215、novel_circ_0002371等。見圖3(b)。
KEGG通路富集結(jié)果顯示,差異表達的circRNA涉及的細胞通路有新陳代謝、MAPK信號通路、細胞內(nèi)嗜作用等相關途徑。共有的差異circRNA的GO富集分類統(tǒng)計圖見圖3(d),細胞組分分析以胞液與細胞間組分最為顯著。
圖3 circRNA測序分析結(jié)果
差異表達的miRNA共15個,其中表達上調(diào)8個,分別為hsa-miR-3157-3p、hsa-miR-6761-5p、hsa-miR-3124-5p、hsa-miR-5009-5p、hsamiR-216b-3p、hsa-miR-296-3p、novel_912、novel_328;表達下調(diào)7個,分別為hsa-miR-135b-5p、hsa-miR-377-3p、hsa-miR-136-5p、hsa-miR-381-3p、hsa-miR-153-5p、hsa-miR-299-3p、hsamiR-4473。見圖4(a)。
繪制多組比較的差異miRNA韋恩圖,選擇2個組、3個組或4個組比較得到的差異miRNA數(shù)進行統(tǒng)計。結(jié)果顯示,4組間交集的miRNA數(shù)為0。見圖4(b)。
差異表達miRNA的KEGG富集通路散點圖見圖4(c)。
圖4 miRNA測序分析結(jié)果
4組癌組織樣本(AT、BT、CT、DT)之間的r2值接近0.95,癌旁組織(AC、BC、CC、DC)之間的r2值接近0.93,表明不同樣本之間表達模式的相似度較高。見表1。
表1 4組不同樣本之間的相關性
在競爭性內(nèi)源RNA(competitive endogenous RNA,ceRNA)理論的基礎上,根據(jù)結(jié)合點位是否相同來尋找與miRNA同類的lncRNA與基因的配對等,完成ceRNA調(diào)控網(wǎng)絡的構(gòu)建。見圖5、圖6。
圖5 mRNA-miRNA-circRNA的關聯(lián)分析
圖6 mRNA-miRNA-lncRNA的關聯(lián)分析
利用miRBase數(shù)據(jù)庫構(gòu)建33個差異表達基因的miRNA-lncRNA-mRNA 的關聯(lián)分析,見圖7。其中BOC基因位于調(diào)控網(wǎng)絡的關鍵節(jié)點,以BOC為核心進行拓撲分析,結(jié)果顯示,BOC與has-miR-4763-5p、has-miR-6848-5p、has-miR-6860 miRNA具有潛在的靶向結(jié)合位點,這3類miRNA下游存在POU2F1、TP53等與腫瘤發(fā)生相關的基因轉(zhuǎn)錄本,見圖8。
圖7 mRNA-miRNA-lncRNA/circRNA的關聯(lián)分析
圖8 BOC與ncRNA、基因的關聯(lián)分析
采用STRING數(shù)據(jù)庫中的Confidence Score可靠指數(shù)對每個預測的相互關聯(lián)性進行分析。結(jié)果顯示,SHH、CDON、PTCH1等蛋白與BOC關聯(lián),主要定位在Hh通路上。見圖9。
圖9 BOC-蛋白互作分析圖
5例GBM患者中有4例患者癌組織BOCmRNA水平明顯高于癌旁組織(P<0.05),1例患者癌組織BOCmRNA水平低于癌旁組織(P<0.05)。見圖10。
圖10 5例GBM患者癌組織與癌旁組織BOC mRNA相對表達量比較
ncRNA在各種生物過程中起著重要的調(diào)控作用。本研究基于全轉(zhuǎn)錄組測序,同時分析5例GBM患者癌組織與癌旁組織中差異表達的mRNA、lncRNA、circRNA和miRNA,并且通過兩兩關聯(lián)分析、三元關聯(lián)分析、多元關聯(lián)分析,深入挖掘相關轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制。
本研究篩選出的差異表達的mRNA中已有多個被證實與膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關,如Rab23[10]、RAS[11]、BRAF[12]、VEGF[13]、PTCH1[14]、MAPK[15-16]等基因。有研究結(jié)果顯示,Rab23 mRNA及蛋白在膠質(zhì)瘤組織中高表達,其表達水平與病理分級相關[10-11]。本研究結(jié)果顯示,癌組織RAS家族中與增殖相關的蛋白(ERAS、GEM、HRAS、KRAS、MRAS)的mRNA相對表達量顯著高于癌旁組織,與文獻報道[13]一致。
BRAF基因編碼的蛋白屬于raf/mil家族的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,參與調(diào)控MAPK/細胞外調(diào)節(jié)蛋白激酶信號通路,通過細胞分裂、分化、分泌等功能促進腫瘤形成[12]。MAPK是在真核生物中非常保守的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶,參與了細胞增殖、分化、運動及凋亡等生物過程。本研究結(jié)果顯示,膠質(zhì)瘤患者癌組織BRAFmRNA、MAPKmRNA呈高表達,提示BRAF、MAPK等癌基因參與了GBM的惡性增殖、侵襲等生物學過程。
本研究篩選得到的差異表達mRNA的轉(zhuǎn)錄本富集通路包括Shh(Sonic hedgehog)信號途徑、膠質(zhì)瘤信號途徑、胰腺癌信號途徑、軸突導向、TNF信號途徑等通路,這些通路與免疫反應、氨基酸代謝、細胞增殖、蛋白轉(zhuǎn)運等生理生化反應相關。BOC作為跨膜蛋白定位在Shh信號途徑上游。本研究結(jié)果顯示,癌組織BOCmRNA水平高于癌旁組織(P<0.05),與文獻報道[17]一致。SHERGALIS等[17]利用TCGA數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)膠質(zhì)瘤組織BOC高于正常腦組織(P<0.05),高表達BOC的膠質(zhì)瘤患者生存期明顯縮短。提示BOC激活了Hh信號途徑,可促進GBM的進展,因此BOC有成為藥物靶點的潛力。
GBM的發(fā)生、發(fā)展與mRNA、lncRNA、miRNA、circRNA之間復雜的調(diào)控關系密切相關。本研究構(gòu)建GBM mRNA-miRNA-lncRNA/circRNA調(diào)控網(wǎng)絡后分析了網(wǎng)絡拓撲特性,發(fā)現(xiàn)BOC、miR-4763-5P、miR-6848-5P、miR-6880是關鍵節(jié)點。進一步對這些關鍵節(jié)點及其相互作用的RNA進行功能富集分析和生存分析,結(jié)果顯示,與miR-6880具有潛在結(jié)合位點的lncDUBR、lnc003875已被證實與多種腫瘤發(fā)生相關[18],提示BOC可能通過與miRNA結(jié)合,調(diào)控下游基因來影響腫瘤的進展。lnc003875/miR-363/EGR1在癌相關成纖維細胞調(diào)控網(wǎng)絡中的作用是控制人胎盤部位滋養(yǎng)層腫瘤的血管生成。另外,lnc003745、lnc003874、lnc001254、lnc001763、lnc002545、lnc002436、lnc003671、lnc3371、lnc00798、DCTN1-AS1、RP11-1055B83、lnc00653、c20orf166-AS1共計13個lncRNA也出現(xiàn)在BOC相關的互作網(wǎng)絡中,其中C20orf166-AS1與抗原處理、表達和細胞黏附分子通路相關。目前,C20orf166-AS1已被證實與MAPK信號通路相關,可導致前列腺癌、胃癌的發(fā)生[19]。lnc001763、lnc002436與病灶粘連、細胞外基質(zhì)受體相互作用、MAPK信號通路相關,共涉及到12個基因。
關于circRNA在惡性腫瘤發(fā)生、轉(zhuǎn)移、侵襲性生長和腫瘤血管新生等過程中的調(diào)控作用是目前腫瘤研究的熱點。本研究結(jié)果顯示,circRNA0000543、circRNA0003666、circRNA0047270、circRNA0010465等8個circRNA參與了BOC的互相作用。既往研究發(fā)現(xiàn),circSMARCA5和circCFH與膠質(zhì)瘤的特異性表達模式有關,這些circRNA或可作為腫瘤的生物標志物[20]。此外,一些circRNA已被發(fā)現(xiàn)在GBM中發(fā)揮致癌作用,如circNFIX、circNT5E;而另一些circRNA則具有抑癌作用,如circFBXW7、circSHPRH[21]。本研究還發(fā)現(xiàn)了多個差異表達且尚未報道的circRNA,其對GBM的調(diào)控機制還有待進一步驗證。
本研究全轉(zhuǎn)錄組多元關聯(lián)分析結(jié)果顯示,BOC位于調(diào)控網(wǎng)絡關鍵節(jié)點位置,其定位的Hh信號途徑在被異常激活的情況下會促進多種惡性腫瘤的進展,提示BOC可能受相關miRNA、circRNA、lncRNA的調(diào)控,影響下游靶基因的表達,參與了腫瘤增殖與侵襲的過程。本研究還對5例GBM患者癌組織和癌旁組織中BOCmRNA的相對表達量進行了檢測,結(jié)果顯示,有4例患者癌組織BOCmRNA水平明顯高于癌旁組織(P<0.05),1例患者癌組織BOCmRNA水平低于癌旁組織(P<0.05)。后續(xù)研究將重點針對BOC是否在GBM的致病機制中發(fā)揮癌基因作用,進一步在細胞層面進行驗證。
綜上所述,本研究利用二代測序技術對4例GBM患者的腫瘤組織及癌旁組織進行全轉(zhuǎn)錄組測序分析,篩選后得到33個共有差異基因,深入分析后挖掘到1個可能與GBM增殖、侵襲、遷移密切相關且定位于Hh通路的關鍵基因BOC。進一步對mRNA-miRNA-lncRNA/circRNA多元關聯(lián)網(wǎng)絡拓撲分析發(fā)現(xiàn),BOC位于調(diào)控網(wǎng)絡的關鍵節(jié)點位置,且其定位的Hh信號途徑在異常激活的情況下會促進多種腫瘤的惡性進程,提示BOC受到相關miRNA、circRNA、lncRNA的調(diào)控,影響下游靶基因的表達,從而導致GBM的發(fā)生。