寄生曲霉快速分子檢測方法的研究

王歡 薛健

(吉林農業(yè)科技學院生物與制藥工程學院，吉林 吉林 132101)

前言

黃曲霉毒素(Aflatoxins，AFT)主要由黃曲霉(Aspergillus flavus)和寄生曲霉(Aspergillus parasiticus)等多種真菌代謝產生，能夠污染谷物、堅果、干果及中藥材等，在自然條件下性質非常穩(wěn)定[1,2]。AFT屬于二呋喃香豆素衍生物，其基本結構中均含有二呋喃環(huán)和氧雜萘鄰酮(香豆素)，在紫外光照射下可產生熒光。其中，黃曲霉毒素B1(AFB1)的毒性最強。AFB1具有極高的致突變性、毒性和致癌性[3]，其致癌性是氰化鉀的10倍，毒性是砒霜的68倍，是誘發(fā)原發(fā)性肝癌的最主要的原因，同時也會對胰臟、脾臟等器官有輕微的影響，造成機體免疫力下降，生長遲緩[4]。

在產AFT真菌中，寄生曲霉是常見的產毒曲霉之一，對人類的生產、生活造成了極大的危害。能夠產生AFT的黃曲霉菌株有30%～60%，而幾乎所有的寄生曲霉菌株均產生AFT，而且寄生曲霉嗜干燥，在適宜生長條件下可快速繁殖。寄生曲霉除能夠產生AFT外，還能產生腎臟毒素—曲酸(Kojic acid)[5]，不僅會感染動物，使動物致病致死，還會導致人體發(fā)生急性肝中毒、慢性肝中毒、慢性腎臟損傷，甚至致癌、致畸、致突變。

目前寄生曲霉污染的檢測主要集中在對黃曲霉毒素含量的檢測上，且常用的方法有薄層色譜法、高效液相色譜法和ELISA法[6]。而這些方法不能從源頭上對寄生曲霉的污染進行防治，且存在儀器復雜、樣品處理繁瑣及價格昂貴等缺點。為此，本研究針對寄生曲霉合成黃曲霉毒素的關鍵基因柄曲霉素轉甲氧基酶基因Omt-1、調節(jié)基因aflR[7]，建立一種改良的溶菌酶-CTAB法進行黃曲霉的快速、靈敏、高效的分子檢測方法。該方法簡單便捷，大大節(jié)省了檢測時間，可作為防控AFT污染的有效方式。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 供試菌株

黑曲霉、米曲霉、產黃青霉和釀酒酵母是本實驗室保藏，寄生曲霉(AS 3.4407)購自北京微生物研究所。

1.1.2 試劑與儀器

察氏培養(yǎng)基：硝酸鈉0.3%、磷酸氫二鉀0.1%、硫酸鎂0.05%、氯化鉀0.05%、硫酸亞鐵0.001%、蔗糖3%、瓊脂粉2%，pH自然，121℃、滅菌25min。

溶菌酶、Taq DNA聚合酶、dNTPs，生工生物工程(上海)股份有限公司，其他試劑均為國產分析純。

DHP-9052恒溫培養(yǎng)箱(南京卓鼎干燥設備廠)；R404A離心機(德國 Eppendorf)；TP600 PCR(大連Takara公司)；JY600PJ電泳儀(北京君意東方電泳有限公司)；LAS500凝膠成像系統(tǒng)(美國GE公司)；Biospec-nano核酸濃度測定儀(日本SHIMADZU公司)。

1.2 方法

1.2.1 寄生曲霉基因組DNA的提取

使用溶菌酶-CTAB法提取寄生曲霉基因組DNA。刮取活化后的菌絲于1mL無菌生理鹽水中，10000rpm、離心5min，漂洗2次。棄上清，稱取100mg沉淀，加入100μL 1M Tris-HCL，20μL 1M EDTA，5mg·mL-1溶菌酶，混勻。30℃溫育30min。再加入1mL CTAB裂解液60℃溫育30min，每隔10min振蕩1次。12000rpm離心10min，向上清中加入等體積24∶1的氯仿和異戊醇混合液，旋渦振蕩后靜置5min,12000rpm、4℃離心5min，重復2次。取上清，加入等體積預冷的異丙醇，輕輕混勻，于4℃靜置5min，12000rpm、離心5min，棄上清。用0.5mL 70%乙醇洗滌沉淀后，12000rpm、離心10min，棄上清，自然風干2～3min。使用30μL TE溶解沉淀，于4℃儲存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設計

選擇寄生曲霉參與黃曲霉毒素合成的關鍵基因作為PCR檢測的靶基因，包括柄曲霉素轉甲氧基酶基因Omt-1、產黃曲霉毒素調節(jié)基因aflR[8-10]，使用Premier Primer 5.0設計引物，2對引物序列分別為Omt-F:GTGGACGGACCTAGTCCGACATCAC，Omt-R：GTCGGCGCCACGCACTGGGTTGGGG；aflR-F：AGAAT AGCTTCGCAGGGTGGT，aflR-R：AGTCTGGGAGGAA CGGATCG。由吉林庫美生物有限公司合成引物。

1.2.3 PCR反應體系與檢測條件

本研究所需的PCR反應體系包括DNA模板3μL，Taq酶1μL，上、下游引物各0.5μL，dNTPs 1μL，10×PCR buffer 2.5μL,ddH2O 16.5μL，反應總體積為25μL。反應前將PCR管置于冰上，依次加入各組分后輕輕混勻，短暫離心后進行PCR。PCR反應條件：95℃預變性5min后，95℃30s、55℃30s、72℃30s，30個循環(huán)，72℃延伸10min，4℃保存。反應結束后通過1%瓊脂糖凝膠電泳對結果進行檢測。

1.2.4 靈敏度檢測

將提取的寄生曲霉基因組DNA依次按照10-1、10-2、10-3、10-4、10-5進行梯度稀釋后作為模板進行PCR擴增。再通過1%瓊脂糖凝膠電泳對PCR結果進行檢測。

1.2.5 特異性檢測

為考察寄生曲霉Omt-1與aflR作為檢測靶基因的特異性，按照1.2.1的方法提取各對照菌的基因組DNA，然后進行PCR擴增，使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果。

2 結果與分析

2.1 基因組的PCR擴增結果

經溶菌酶-CTAB法提取的基因組作為模板，進行PCR擴增與1%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，如圖1，Omt-1的擴增產物(泳道1)和aflR(泳道2)的擴增產物均清晰可見，且亮度較高，大小分別位于750bp和500bp附近，與預期的Omt-1與aflR片段長度795bp和516bp一致，表明上述基因組提取方法可以有效用于寄生曲霉的檢測。

圖1 PCR擴增目的片段電泳圖M.Marker DL2000bp;1.柄曲霉素轉甲氧基酶基因Omt-1；2.aflR基因啟動子

2.2 靈敏度檢測結果

經可見光掃描分光光度計檢測，寄生曲霉DNA模板的核酸濃度為138.71ng·μL-1，分別對2種引物進行PCR靈敏度檢測，由圖2可得,當DNA濃度最低至1ng·μL-1，可見清晰的Omt-1擴增基因條帶，由圖3可得,當DNA濃度最低至100pg·μL-1，可見清晰的aflR擴增基因條帶。寄生曲霉1個孢子中的DNA質量為103pg[11],所以若以Omt-1作為靶基因，靈敏度下限為10個孢子；若以aflR作為靶基因，靈敏度下限為1個孢子，表明aflR的檢測靈敏度優(yōu)于Omt-1。

圖2 寄生曲霉Omt-1靈敏度電泳結果M.Marker DL2000bp;1.稀釋10-1倍的基因組DNA；2.稀釋10-2倍的模板基因組DNA；3.稀釋10-3倍的基因組DNA；4.稀釋10-4倍的基因組DNA；5.稀釋10-5倍的基因組DNA

圖3 寄生曲霉aflR靈敏度電泳結果M.Marker DL2000bp;1.稀釋10-1倍的基因組DNA；2.稀釋10-2倍的基因組DNA；3.稀釋10-3倍的基因組DNA；4.稀釋10-4倍的基因組DNA；5.稀釋10-5倍的基因組DNA

2.3 特異性檢測結果

分別使用2對引物對米曲霉、寄生曲霉、黑曲霉、產黃青霉和釀酒酵母進行了PCR檢測，根據圖4，米曲霉和寄生曲霉均能擴增出Omt-1目的產物；而圖5只有寄生曲霉能擴增aflR目的產物。上述結果表明以aflR作為靶基因的特異性更強。

圖4 Omt-1特異性電泳結果M.Marker DL2000bp;1.米曲霉；2.寄生曲霉；3.黑曲霉；4.產黃青霉；5.釀酒酵母

圖5 aflR特異性電泳結果M.Marker DL2000bp;1.米曲霉；2.寄生曲霉；3.黑曲霉；4.產黃青霉；5.釀酒酵母

3 討論

目前寄生曲霉污染的檢測與防控主要集中在對黃曲霉毒素的檢測[6]，主要方法包括色譜法和免疫法，其中薄層色譜法(TLC)法靈敏度低，穩(wěn)定性差，現已很少使用；高效液相色譜法(HPLC)法成本較高，操作復雜，對操作人員的專業(yè)性要求較高，不適用于普通實驗室，不能用于現場快速檢測；酶聯免疫法(ELISA)由于靈敏度低常導致假陽性的出現,并且這些方法只能在AFT污染后進行檢測。

利用分子生物學方法檢測產毒真菌具有特異性好、靈敏度高、準確、便捷等優(yōu)點,可對真菌污染進行提早防控。李慧[8]等以黃曲霉基因組DNA為模板構建的多重PCR檢測方法中，其aflR靶基因的靈敏度下限為100pg。晏麗等[11]通過熒光定量PCR特異性針黃曲霉的nor-1基因進行檢測，靈敏度最低至10個孢子，從提取菌株DNA到熒光定量PCR全過程在6h內。蔣丹[12]等建立了液氮研磨-CTAB法制備產毒曲霉菌DNA及其aflR基因PCR檢測的方法。本研究中靈敏度指標與李慧等的研究結果一致，aflR基因的檢測靈敏度最低可1個孢子，優(yōu)于晏麗等研究結果。與蔣丹等研究相比，本研究中的溶菌酶-CTAB基因組提取方法更加簡單、便捷，但由于真菌DNA的提取時間較長，今后可以針對該方法進行優(yōu)化，以期進一步縮短檢測時間。

4 結論

本文采用溶菌酶-CTAB法制備寄生曲霉基因組DNA，針對寄生曲霉的黃曲霉毒素合成關鍵基因aflR與Omt-1進行PCR檢測，該方法對aflR具有較高的靈敏度和較強的特異性、簡單快捷并且成本較低，能夠在早期對寄生曲霉的污染進行有效防控。