木霉緩解外源草酸對黃瓜幼苗毒害的作用研究

吳曉青，任何，呂玉平，趙曉燕，周紅姿，張新建，楊合同

(1.齊魯工業(yè)大學(xué)(山東省科學(xué)院)生態(tài)研究所/山東省應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 濟(jì)南 250103；2.山東新時(shí)代藥業(yè)有限公司，山東 臨沂 273400；3.中國科學(xué)院分子植物科學(xué)卓越創(chuàng)新中心，上海 201602)

草酸(oxalic acid，OA)是簡單的有機(jī)二元酸，核盤菌(Sclerotinia sclerotiorum)、灰霉菌(Botrytis cinerea)等病原菌在侵染植物過程中分泌的外源草酸(相對于植物細(xì)胞內(nèi)源草酸而言)不僅是非特異性植物毒素，還能通過降低侵染環(huán)境的pH值，一方面誘導(dǎo)自身細(xì)胞壁降解酶(聚半乳糖醛酸酶、天冬氨酸蛋白酶、漆酶等)活性提高，另一方面抑制植物保護(hù)酶的活性，連同抑制植物氧爆作用、調(diào)節(jié)氣孔保衛(wèi)細(xì)胞關(guān)閉、誘導(dǎo)植物細(xì)胞程序性死亡等參與到侵染機(jī)制中[1，2]。盾殼霉(Coniothyrium minitans)、木霉(Trichoderma)等生防功能菌在拮抗核盤菌、灰霉菌時(shí)會(huì)通過產(chǎn)生草酸脫羧酶(oxalate decarboxylase，OXDC)消除外源草酸的作用，從而阻止病原菌對植物的侵染[3－6]。但一定濃度的外源草酸又是有效的化學(xué)誘抗劑，能顯著提高植物對病原菌的系統(tǒng)抗性[7，8]。因此，明確外源草酸的毒性作用和誘抗作用濃度對合理利用外源草酸具有重要意義。

前期工作中，我們已對一株防治黃瓜灰霉病的非洲哈茨木霉(T.afroharzianum)LTR－2降解草酸的作用及機(jī)制進(jìn)行了研究，本研究在此基礎(chǔ)上，分析了不同濃度草酸浸根及接種木霉對黃瓜幼苗的毒害程度和葉片中4種抗性酶(兩種抗氧化酶和兩種抗病相關(guān)酶)活性的影響，以期進(jìn)一步了解木霉在黃瓜幼苗抗性系統(tǒng)響應(yīng)外源草酸脅迫中的作用。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試菌株為非洲哈茨木霉LTR－2，由山東省應(yīng)用微生物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室分離自土壤并保藏?！敖蜓兴奶枴秉S瓜(Cucumis sativusL.)種子，購自天津市津科力豐種苗有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 黃瓜育苗及取樣 2020年4月，在無菌條件下將黃瓜種子先后浸入75%乙醇和次氯酸鈉溶液(有效氯含量2%)中表面消毒30 s和15 min，無菌水沖洗2~3次，轉(zhuǎn)移至濕潤的濾紙上，于25℃暗培養(yǎng)2 d，待胚根伸長至1~2 cm時(shí)移入折疊式育苗缽中，置于恒溫光照培養(yǎng)箱中，在光照25℃12 h、黑暗18℃12 h培養(yǎng)。育苗基質(zhì)為普通園藝基質(zhì)，購自濟(jì)南魯青種苗有限公司，使用前經(jīng)121℃、103 kPa滅菌2次，每次1 h，間隔24 h。待幼苗長出3~4片真葉時(shí)，翻轉(zhuǎn)折疊式育苗缽取出完整植株，用無菌水淋洗去除根部附著的育苗基質(zhì)。

1.2.2 木霉發(fā)酵及草酸處理方法 無菌條件下，將活化的0.5 cm木霉菌塊接入PDA(potato dextrose agar，BD，USA)平皿中央，在25℃、光照12 h、黑暗12 h條件下培養(yǎng)7 d；用接種環(huán)輕輕刮取分生孢子層，混入無菌水中，滅菌脫脂棉過濾制成孢子懸濁液，利用血球計(jì)數(shù)法調(diào)整孢子濃度為107個(gè)/mL，備用。將100 mL PDB(potato dextrose broth，BD，USA)分裝于500 mL三角瓶中，于115℃、90 kPa滅菌25 min。配制0.5 mol/L草酸(分析純)母液，通過0.22μm無菌聚醚砜濾膜過濾除菌，在PDB中添加不同比例的草酸母液使草酸終濃度分別為0、10、20、30、50、80 mmol/L。將100μL上述木霉分生孢子懸濁液接種至含不同濃度草酸的100 mL PDB中。以無菌蒸餾水處理、空白PDB培養(yǎng)基處理、接種木霉的PDB發(fā)酵濾液處理為對照。所有處理的培養(yǎng)液均在160 r/min、28℃條件下振蕩培養(yǎng)5 d。為了方便描述，將處理組和對照組進(jìn)行編號，如表1所示。

表1 處理及編號

1.2.3 浸根法處理黃瓜幼苗 將各處理的木霉發(fā)酵液經(jīng)10 000 r/min離心和0.22μm聚醚砜濾膜抽濾徹底去除菌體，濾清后的處理液轉(zhuǎn)移至滅菌的500 mL燒杯中，同時(shí)取出10 mL處理液用pH計(jì)測定pH值。從育苗缽中小心取出完整苗體，用清水洗凈根系，用打孔的PVC板將黃瓜幼苗固定在處理液上方，使根系下端浸于處理液中。每瓶插入2棵黃瓜幼苗，每處理設(shè)6瓶重復(fù)。在25℃條件下放置24 h，拍照并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

草酸毒害程度的統(tǒng)計(jì)方法:中毒嚴(yán)重度分為4個(gè)級別，0級為所有葉片挺闊，根莖飽滿；1級有1~2片真葉輕度萎蔫，根莖挺拔；2級有2~3片真葉萎蔫，根莖軟化；3級有3片及以上真葉萎蔫，根莖下部失綠萎縮；4級為整體植株萎蔫，根莖整體萎縮嚴(yán)重。每個(gè)處理重復(fù)3次。參考病情指數(shù)的計(jì)算方法計(jì)算中毒指數(shù)，具體公式為:中毒指數(shù)＝(N0×0＋N1×1＋N2×2＋N3×3＋N4×4)/每處理總苗數(shù)，其中N0、N1、N2、N3和N4分別為各級別的黃瓜幼苗數(shù)。以每瓶的兩棵幼苗為一個(gè)重復(fù)，采集葉片，每個(gè)處理重復(fù)3次，用液氮速凍后研磨成細(xì)粉，待測酶活。

1.2.4 酶活性測定 苯丙氨酸解氨酶(PAL)、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、多酚氧化酶(PPO)活性分別采用蘇州科銘的PAL、SOD、CAT、PPO試劑盒(微量法)測定。

1.3 數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析

采用Microsoft Excel 2019軟件進(jìn)行平均值和標(biāo)準(zhǔn)差計(jì)算，用SPSS 22.0進(jìn)行Duncan’s多重檢驗(yàn)，使用Origin 8.0繪制圖表。

2 結(jié)果與分析

2.1 木霉處理降低外源草酸對黃瓜幼苗的脅迫

黃瓜幼苗在各處理?xiàng)l件下處理24 h后呈現(xiàn)出不同程度的生長狀態(tài)(圖1)。無菌水處理(H2O)的黃瓜幼苗葉片挺闊、根莖茁壯飽滿(圖1 A)；PDB培養(yǎng)基處理(PD)后，葉片邊緣出現(xiàn)輕度脫水現(xiàn)象、根莖挺拔(圖1 C)；木霉發(fā)酵液處理(T)后，黃瓜幼苗狀態(tài)與PD處理的相似(圖1 D)。10 mmol/L草酸處理(OA10)的黃瓜葉片出現(xiàn)萎蔫，根莖輕微脫水但未見明顯萎縮(圖1 E)；同草酸濃度的木霉處理(T＋OA10)后，幼苗葉片萎蔫程度降低、根莖恢復(fù)挺拔(圖1 F)。20 mmol/L草酸處理(OA20)對黃瓜幼苗的脅迫作用明顯，葉片全部萎蔫，根莖出現(xiàn)萎縮失綠及軟化現(xiàn)象(圖1 G)；同草酸濃度的木霉處理(T＋OA20)有效緩解了葉片的萎蔫狀況，根莖輕度萎縮，少有失綠軟化現(xiàn)象(圖1 H)。當(dāng)草酸濃度達(dá)到30 mmol/L(OA30)時(shí)，植株整體嚴(yán)重萎蔫，根莖部變白軟化(圖1 I)；同草酸濃度的木霉處理(T＋OA30)則可改善部分生長較粗壯植株受脅迫的狀況(圖1 J)。當(dāng)草酸濃度提高至50、80 mmol/L時(shí)，幼苗萎蔫情況愈加嚴(yán)重，木霉處理也無明顯緩解作用。

圖1 不同處理黃瓜幼苗的表型

利用中毒指數(shù)對脅迫程度進(jìn)行量化，結(jié)果表明，10~30 mmol/L草酸對黃瓜幼苗均有不同程度的毒害作用，而木霉處理顯著緩解了草酸對黃瓜的脅迫，10、20、30 mmol/L草酸處理下，接種木霉后的幼苗中毒指數(shù)分別降低50.00%、41.18%、22.22%(圖2)。

圖2 不同處理黃瓜幼苗的中毒指數(shù)分布

2.2 木霉緩解草酸處理對黃瓜PAL活性的影響

結(jié)果(圖3)表明，H2O處理的PAL活性為(28.91±2.32)U/mgFW，PD、T處理后的PAL活性分別為(31.80±0.67)(17.04±4.04)U/mgFW，三者間差異不顯著。與PD處理相比，不同濃度草酸處理均使PAL活性顯著升高(P<0.05)，表現(xiàn)為OA80>OA30>OA50>OA20>OA10；不同草酸濃度下接種木霉后，幼苗中的PAL活性也均高于PD處理，表現(xiàn)為T＋OA30>T＋OA50>T＋OA80>T＋OA20>T＋OA10，除T＋OA10、T＋OA20處理外差異均達(dá)顯著水平(P<0.05)。相同草酸濃度下，接種木霉處理的PAL活性顯著低于未接種的?？梢姡鞑菟釢舛认陆臃N木霉均抑制了黃瓜幼苗PAL活性的升高。

圖3 不同處理黃瓜幼苗葉片的PAL活性

2.3 木霉緩解草酸處理對黃瓜PPO活性的影響

結(jié)果(圖4)顯示，PD、T處理后PPO活性分別為(33.66±1.10)(38.10±1.10)U/gFW，兩者間差異顯著，但均與H2O處理[(37.29±0.80)U/gFW)]無顯著差異。與PD處理相比，草酸處理后黃瓜幼苗葉片中的PPO活性均顯著提高(P<0.05)，表現(xiàn)為OA20>OA30>OA80>OA10>OA50；不同草酸濃度下接種木霉后，PPO活性也均升高，表現(xiàn)為T＋OA30>T＋OA50>T＋OA20>T＋OA80>T＋OA10，除T＋OA10處理外均顯著高于H2O、PD、T處理(P<0.05)。相同草酸濃度下，與不接種木霉處理相比，接種木霉的T＋OA30和T＋OA50處理顯著提高黃瓜幼苗葉片中的PPO活性，而其余接種木霉處理均顯著降低PPO活性?？梢姡臃N木霉對PPO活性的提升作用在30、50 mmol/L草酸處理下最明顯，草酸濃度過低或過高都不能發(fā)揮其對PPO活性的提升作用。

圖4 不同處理黃瓜幼苗葉片的PPO活性

2.4 木霉緩釋草酸處理對黃瓜CAT活性的影響

結(jié)果(圖5)顯示，H2O處理的CAT活性為(2 374.39±466.04)nmol/(min?mL)，PD、T處理后活性分別為(2 985.38±528.45)(1 343.62±348.17)nmol/(min?mL)，其中T處理的CAT活性最低，顯著低于H2O和PD處理(P<0.05)，僅為PD處理的45.01%。相比于PD處理，不同濃度草酸處理的CAT活性表現(xiàn)為OA80>OA20>OA30>OA10>OA50，其中，OA20和OA80處理顯著高于PD處理(P<0.05)，其余濃度草酸處理與PD處理無顯著差異；不同草酸濃度下接種木霉后，黃瓜幼苗葉片中的CAT活性均降低，表現(xiàn)為T＋OA50>T＋OA10>T＋OA20>T＋OA30>T＋OA80，其中，T＋OA10和T＋OA50處理與PD處理差異不顯著，但顯著高于T處理(P<0.05)，其余處理均顯著低于PD處理，與T處理差異不顯著。相同草酸濃度下，整體來說接種木霉處理的CAT活性低于不接種木霉的，尤其當(dāng)草酸濃度為20、30、80 mmol/L時(shí)，接種木霉顯著抑制了黃瓜幼苗葉片中的CAT活性。

圖5 不同處理黃瓜幼苗葉片的CAT活性

2.5 木霉緩解草酸處理對黃瓜SOD活性的影響

結(jié)果(圖6)顯示，PD處理黃瓜幼苗葉片中的SOD活性最高，為(7 771.16±846.55)U/gFW，與H2O處理[(7 754.36±374.00)U/gFW]差異不顯著；T處理的SOD活性[(3 755.00±1124.93)U/gFW]顯著低于兩者(P<0.05)，僅為PD處理的48.32%。相比于PD處理，各濃度草酸處理均降低幼苗葉片中的SOD活性，接種木霉菌后降低效果更明顯，除OA20處理外差異均達(dá)顯著水平(P<0.05)；隨草酸濃度的升高，不接種木霉時(shí)SOD活性先升高后降低，OA20處理的最高，而接種木霉后SOD活性逐漸降低。相同草酸濃度下，相比于不接種木霉，接種木霉降低葉片中的SOD活性，草酸濃度為20 mmol/L時(shí)差異達(dá)顯著水平(P<0.05)，其余濃度下差異不顯著。

圖6 不同處理黃瓜幼苗葉片的SOD活性

3 討論與結(jié)論

一定濃度的外源草酸對于植物是非?；远舅兀缬脻舛葹? mmol/L以上的草酸浸根處理3 d或10 mmol/L以上的草酸處理葉片24 h均可使油菜產(chǎn)生中毒癥狀，主要表現(xiàn)為葉片黃褐腐化和根莖脫水萎縮，處理濃度越高、時(shí)間越長，受害程度越重[6，9]。黃瓜含水量高，根際含水量達(dá)80%~90%，對溶液中毒性脅迫因子更為敏感[10]，本試驗(yàn)結(jié)果也顯示，用10~80 mmol/L草酸浸根處理黃瓜幼苗24 h后表現(xiàn)出與無菌水和PDB培養(yǎng)基對照處理差異顯著的發(fā)育形態(tài)，表明黃瓜幼苗耐草酸脅迫的能力較差；接種木霉可在一定程度上緩解10~30 mmol/L外源草酸對黃瓜幼苗的脅迫作用，使幼苗的中毒指數(shù)降低22.22%~50.00%，但對50~80 mmol/L外源草酸的脅迫作用無明顯緩解。前期研究表明，在草酸濃度低于20 mmol/L的培養(yǎng)液中接種木霉并培養(yǎng)5 d，草酸可完全被降解，降解率達(dá)100%；而當(dāng)草酸濃度為30 mmol/L時(shí)，降解率大幅降低至不到20%；當(dāng)草酸濃度繼續(xù)升高后，木霉自身生長也被顯著抑制，對草酸的降解作用就更加微弱[11]。

PAL與植物抗毒素及酚類化合物的形成密切相關(guān)，雖不能直接抵御病蟲害，但可通過苯丙烷類途徑進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為木質(zhì)素、黃酮、異黃酮、生物堿等次生代謝產(chǎn)物以增強(qiáng)植物的抗病性[12]。PPO是植物體內(nèi)普遍存在的一類銅結(jié)合酶，分為單酚單氧化酶(tyrosinase)、雙酚氧化酶(catechol oxidase)和漆酶(laccase)，其活性與植物抗病有關(guān)，能參與植物的次生代謝，產(chǎn)生一些毒性物質(zhì)，直接毒殺病原菌[13]。CAT廣泛存在于植物中，可催化細(xì)胞內(nèi)過氧化氫的分解，防止過氧化，主要與抗逆性和氧化衰老等生理過程有關(guān)。植物遭受生物和理化因子傷害時(shí)，產(chǎn)生的活性氧自由基(ROS)在傳遞和放大信號過程中可改變離子的分布和啟動(dòng)核基因的表達(dá)，并在一定范圍內(nèi)誘導(dǎo)提高植物對各種脅迫的耐受性，而CAT可清除過多的ROS以使其保持在一定的濃度范圍內(nèi)[14]。SOD是一類具有特定催化功能的蛋白質(zhì)，廣泛存在于植物中，是活性氧清除過程中第一個(gè)發(fā)揮作用的抗氧化酶，可將O2?－快速歧化為H2O2和分子氧，對防止氧自由基破壞細(xì)胞的組成、結(jié)構(gòu)和功能具有十分重要的作用[15]。為進(jìn)一步探究木霉緩解草酸毒害的機(jī)理，本研究分析了各處理下黃瓜幼苗葉片中這4種抗性酶的活性變化，結(jié)果表明，與PD處理相比，僅接種木霉的T處理降低PAL、CAT、SOD活性，尤其CAT、SOD活性降低顯著，但顯著增加PPO活性；添加草酸能大幅提高PAL和PPO活性，降低SOD活性，對CAT活性的影響多不顯著；而接種木霉可有效緩解外源草酸對PAL和PPO活性的影響，進(jìn)一步降低SOD和CAT活性，總體來說，外源草酸濃度低于20 mmol/L時(shí)，接種木霉對降低其脅迫作用的效果較好。前人對接種木霉菌株引發(fā)的植物抗性酶活性變化也進(jìn)行了一些研究[16－20]，但不同木霉菌株引發(fā)的不同植物的抗性酶響應(yīng)模式不同，甚至同一菌株對不同植物抗性酶系統(tǒng)的作用也不同；另外，不同作物的抗性酶系統(tǒng)對不同濃度草酸脅迫的響應(yīng)也不同[21，22]。造成上述差異的原因還有待進(jìn)一步研究。

綜上，木霉對草酸具有一定降解作用，接種木霉能有效緩解低濃度(10~20 mmol/L)外源草酸對黃瓜幼苗的毒害。這可為進(jìn)一步研究木霉對植物響應(yīng)外源草酸脅迫的影響提供參考。