中華絨螯蟹翻譯起始因子4G基因在幼體發(fā)育階段的mRNA表達(dá)模式與適應(yīng)性進(jìn)化分析

吳海霞,時昕曄,2,周開亞,嚴(yán) 潔,李 鵬

(1.南京師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,江蘇 南京 210023) (2.南京師范大學(xué)海洋科學(xué)與工程學(xué)院,江蘇 南京 210023)

真核翻譯起始因子(eukaryotic translation initiation factors,eIFs)是一類調(diào)控起始密碼子周圍功能核糖體復(fù)合物組裝的蛋白質(zhì),在真核細(xì)胞蛋白質(zhì)翻譯起始過程中發(fā)揮重要作用. 真核生物的基因表達(dá)受基因轉(zhuǎn)錄和翻譯水平的調(diào)節(jié);在翻譯級聯(lián)的四個階段中,起始是關(guān)鍵的速率限制步驟,因此eIFs是蛋白質(zhì)生物合成的關(guān)鍵調(diào)節(jié)劑[1]. 但隨著研究的深入,發(fā)現(xiàn)eIFs的表達(dá)異常會導(dǎo)致一些基因無法正常翻譯,致使細(xì)胞惡變、腫瘤、神經(jīng)退行性疾病的發(fā)生[2]. 例如,eIFs家族與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后關(guān)系密切,主要體現(xiàn)在基因表達(dá)水平的變化上,已有研究在子宮內(nèi)膜癌中觀察到eIF4G、peIF2α、eIF3H的顯著過表達(dá),eIF3C表達(dá)顯著降低[3].

目前eIFs家族成員共有20余種,通常以復(fù)合物的形式實現(xiàn)其生物學(xué)活性[4];其中對eIF2、eIF3、eIF4、eIF5和eIF6的研究較多. eIF4家族由eIF4A、eIF4B、eIF4E、eIF4G等亞基組成(稱作eIF4F),真核細(xì)胞蛋白質(zhì)合成通常從該復(fù)合物與mRNA 5′端的7-甲基化鳥嘌呤核苷帽狀結(jié)構(gòu)(m7GpppN)特異性結(jié)合開始[4]. eIF4G作為組裝eIF4F復(fù)合物的骨架蛋白,與RNA解旋酶eIF4A有兩個結(jié)合位點,與mRNA帽結(jié)合蛋白eIF4E、核糖體結(jié)合復(fù)合物eIF3、促分裂原激活的蛋白激酶1(mitogen-activated protein kinase interacting kinase,MNK1)和聚腺苷酸結(jié)合蛋白(poly-A-binding protein,PABP)各有一個結(jié)合位點[5-6]. eIF4G與PABP相互作用以使mRNA有效環(huán)化,從而增強(qiáng)eIF4F復(fù)合物的帽結(jié)合活性以及60S與40S核糖體亞基的連接[7]. eIF4G與eIF4E結(jié)合,增加eIF4E介導(dǎo)的帽識別和eIF4F復(fù)合物的帽結(jié)合活性;eIF4G與eIF3的結(jié)合有助于將40S核糖體亞基帶入eIF4F復(fù)合體[8]. 此外,eIF4G將43S預(yù)啟動復(fù)合物(PIC,包括40S核糖體亞基、eIF3復(fù)合物和相關(guān)因子)募集到mRNA 5′非翻譯區(qū)(terminal untranslated region,UTR),隨后啟動掃描尋找起始密碼子[9].

從酵母、植物到哺乳動物,迄今已在許多物種中鑒定出eIF4G,其一般具有3個典型結(jié)構(gòu)域:MIF4G、MA3和W2/eIF5C結(jié)構(gòu)域,均為由α螺旋組成的HEAT重復(fù)片段結(jié)構(gòu). 其中哺乳動物細(xì)胞具有3種同工型,即eIF4GI、eIF4GII和p97/NAT1/DAP-5[10]. eIF4GI和eIF4GII都具有eIF4A、eIF4E、eIF3和PABP的結(jié)合位點,但eIF4GI與eIF4GII的濃度在不同細(xì)胞中有所不同,通常eIF4GI的表達(dá)濃度高于eIF4GII[11]. 有研究發(fā)現(xiàn)eIF4G基因表達(dá)水平的上升與細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化、抑制凋亡有關(guān),而表達(dá)水平下降與營養(yǎng)缺乏、熱休克、缺氧等因素有關(guān)[12]. Das等報道eIF4G可以通過充當(dāng)細(xì)胞mRNA代謝的銜接分子,總體上調(diào)整mRNA的功能狀態(tài)[13]. Orellana等研究表明,當(dāng)缺乏合成代謝刺激時,脂多糖LPS誘導(dǎo)的蛋白質(zhì)合成減少與核糖體效率和eIF4E·eIF4G組裝體降低有關(guān),因此發(fā)育過程涉及核糖體數(shù)目和翻譯因子豐度降低,以及eIF2α磷酸化增加[14]. 紅細(xì)胞特異性RNA結(jié)合蛋白RBM38與eIF4G相互作用,促進(jìn)mRNA的翻譯,從而動態(tài)控制哺乳動物紅細(xì)胞的生成過程[15]. Ghosh和Lasko研究發(fā)現(xiàn),果蠅eIF4GI基因敲低并不影響雄性生育能力,而eIF4GII在精子發(fā)生過程中的作用卻很明顯;這些蛋白質(zhì)在雙重敲除后,發(fā)現(xiàn)其在精子發(fā)生早期功能冗余[16]. 以上所有發(fā)現(xiàn)均證明eIF4G家族在蛋白質(zhì)合成中起關(guān)鍵調(diào)節(jié)作用,從而調(diào)控機(jī)體的代謝、生長、發(fā)育和繁殖過程.

中華絨螯蟹(Eriocheirsinensis)屬于真蟹類方蟹科,其形態(tài)在發(fā)育早期經(jīng)歷從似蝦型向蟹型進(jìn)化的“短尾化(Brachyurization)”過程[17]. 短尾化期間,蟹的外部形態(tài)發(fā)生顯著變化,包括腹部退化、折疊在頭胸甲下方并插入到步足之間或特殊腔內(nèi)[18]. 目前,對短尾化變態(tài)的分子機(jī)制研究甚少,主要是對相關(guān)基因表達(dá)量變化的探究[19-22],比較功能基因在幼體不同發(fā)育階段或不同部位的表達(dá)差異;以及中華絨螯蟹幼體發(fā)育階段的比較轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析[23],篩選了1016個差異表達(dá)基因參與變態(tài)、感官知覺和免疫過程;但尚未研究eIF4G基因在甲殼動物變態(tài)發(fā)育過程的作用,且未從進(jìn)化生物學(xué)方面來探討相關(guān)基因是否在甲殼動物進(jìn)化過程中發(fā)生適應(yīng)性進(jìn)化. 本研究利用RACE(Rapid amplification of cDNA ends)技術(shù)克隆中華絨螯蟹eIF4G基因全長cDNA序列(命名為EseIF4G),運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析eIF4G基因的理化性質(zhì)、功能結(jié)構(gòu),并通過qRT-PCR(Quantitative real-time PCR)方法探究該基因在中華絨螯蟹幼蟹10個發(fā)育時期的mRNA表達(dá)差異情況,以及從進(jìn)化生物學(xué)角度對中華絨螯蟹EseIF4G進(jìn)行選擇壓力分析,為進(jìn)一步探究該基因在中華絨螯蟹早期發(fā)育過程的分子進(jìn)化機(jī)制以及十足目甲殼動物的短尾化變態(tài)發(fā)育研究提供參考.

1 材料與方法

1.1 實驗樣品采集

實驗材料取自江蘇泰州興化中堡鎮(zhèn)中華絨螯蟹養(yǎng)殖場,取仔蟹Ⅰ期腹部組織約30 mg,加入RNA保護(hù)試劑,使用無RNase的手術(shù)剪剪碎混勻后保存于-80 ℃?zhèn)溆? 另取中華絨螯蟹受精卵(oosperm,O)、溞狀幼體Ⅰ期(the first zoea stage,Z1)、溞狀幼體Ⅱ期(the second zoea stage,Z2)、溞狀幼體Ⅲ期(the third zoea stage,Z3)、溞狀幼體Ⅳ期(the fourth zoea stage,Z4)、溞狀幼體Ⅴ期(the fifth zoea stage,Z5)、大眼幼體期(megalopa stage,M)、仔蟹Ⅰ期(the first crab stage,J1)、仔蟹Ⅱ期(the second crab stage,J2)、仔蟹Ⅲ期(the third crab stage,J3)整體組織樣品各約30 mg,加入RNA保護(hù)試劑,剪碎勻漿后于-80 ℃保存?zhèn)溆?

1.2 EseIF4G基因cDNA全長擴(kuò)增

按RNeasy Mini Kit(Qiagen,Germany)說明書提取總RNA,使用BioPhotometer核酸和蛋白質(zhì)定量儀(Eppendorf,Germany)檢測RNA的濃度和純度(OD260/OD280). 采用Super SMARTTMPCR cDNA Synthesis Kit(Clontech,USA)合成cDNA,用于后續(xù)RACE實驗克隆EseIF4G基因,以及實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測.

根據(jù)課題組前期構(gòu)建的中華絨螯蟹抑制性消減雜交文庫[20]中獲得的一個492 bp的表達(dá)序列標(biāo)簽(Expressed sequence tags,EST)序列(GenBank登錄號:GE329190)設(shè)計RACE反應(yīng)特異引物(見表1). 以仔蟹I期腹部組織cDNA為模板,用EseIF4G基因特異性引物和通用引物10×Universal Primer A Mix(UPM)進(jìn)行RACE PCR擴(kuò)增. 5′RACE和3′RACE產(chǎn)物進(jìn)行切膠純化和載體連接,連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)入Escherichiacoli細(xì)胞DH5α(TaKaRa,中國大連)并經(jīng)藍(lán)白斑篩選,選取3個陽性克隆送往生工生物工程(上海)股份有限公司測序.

1.3 EseIF4G基因序列分析

將拼接獲得的EseIF4G基因全長cDNA序列用NCBI(http://www.ncbi. nlm.nih.gov/)進(jìn)行cDNA全長完整性驗證、開放閱讀框查找(open reading frame,ORF). 使用ExPASy服務(wù)器(https://web.expasy.org/)[24]的ProtParam和ProtScale工具分析EseIF4G蛋白的理化性質(zhì)和疏水性. 使用SignalP程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP)[25]預(yù)測信號肽,MotifScan程序(http://myhits.isb-sib.ch/cgi-bin/motif_scan)查找motif,SMART軟件(http://smart.embl-heidelberg.de/)[26]分析結(jié)構(gòu)功能域,PSORT II軟件(http://psort.hgc.jp/form2.html)進(jìn)行亞細(xì)胞定位,TMHMM v.2.0軟件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/)[27]預(yù)測跨膜區(qū). 使用在線軟件PSIPRED(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)預(yù)測二級結(jié)構(gòu),SWISS-MODEL(http://www.expasy.org/swissmod/SWISS-MODEL.html)預(yù)測三級結(jié)構(gòu)[24]. 使用MEGA X軟件構(gòu)建鄰接樹(Neighbor-joining tree,NJ tree)來驗證EseIF4G蛋白在進(jìn)化過程中與其他同源蛋白的關(guān)系[28].

表1 本研究所用的主要引物Table 1 Primers used in this study

1.4 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測

用Prime Primer 5軟件設(shè)計引物qβ-actin-F和qβ-actin-R(表1)用于qRT-PCR檢測,選擇β-actin基因(GenBank登錄號:HM053699.1)作為內(nèi)參基因,其引物qβ-actin-F和qβ-actin-R引自文獻(xiàn)[29]. 使用SYBR?Premix Ex-TaqTMII試劑盒(TaKaRa,中國大連)在ABI Step One PlusTM儀器上檢測EseIF4G基因在中華絨螯蟹幼體10個不同發(fā)育階段的mRNA表達(dá)情況. PCR反應(yīng)和實驗樣本均設(shè)計3次重復(fù),采用2-ΔΔCt方法計算相對表達(dá)量[30]. 用SPSS 25.0軟件進(jìn)行單因素方差分析和Tukey’s法多重比較,以(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示,顯著性差異水平以α=0.05表示,圖中用不同的小寫字母標(biāo)注.

1.5 適應(yīng)性進(jìn)化分析

1.5.1 序列獲取

為研究中華絨螯蟹EseIF4G基因的適應(yīng)性進(jìn)化,選擇了其他13種代表性節(jié)肢動物物種的eIF4G基因序列加入分析,涉及甲殼亞門、螯肢亞門和六足亞門,并選擇黑頭軟口鰷(Pimephalespromelas)作為外群. 部分物種的eIF4G基因序列從NCBI數(shù)據(jù)庫直接下載,或從NCBI下載的基因組中用近緣物種的序列執(zhí)行本地blast獲取,本研究所用的直系同源基因在NCBI上的登錄號和本地獲取所用物種基因組信息見表2.

表2 本研究所用物種基因或基因組信息Table 2 Species genes or genomes information used in this study

1.5.2 構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹

使用PRANK軟件對上述獲取的eIF4G基因序列進(jìn)行密碼子水平的比對[31]. 使用Gblocks軟件過濾比對后序列,刪除一些低質(zhì)量或高變異度的序列區(qū)域,僅留進(jìn)化保守的區(qū)域用于后續(xù)分析[32]. 使用IQ-TREE自動測試并選擇最佳替代模型,構(gòu)建最大似然樹(maximum likelihood tree,ML tree)[33]. 該系統(tǒng)發(fā)育樹同時也被用于構(gòu)建后續(xù)選擇壓力分析的樹文件. 從TimeTree(http://www.timetree.org/)獲取該15個物種的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系[34].

1.5.3 檢測特異性位點

選擇其中6種甲殼動物,將其編碼區(qū)序列翻譯為氨基酸序列,PRANK比對后使用FasParser軟件鑒定中華絨螯蟹EseIF4G基因的特異性位點(Segregating sites)[35].

1.5.4 選擇壓力分析

非同義替代率(Non-synonymous substitution rate,dN)與同義替代率(Synonymous substitution rate,dS)的比值ω(dN/dS),通常作為檢測選擇壓力的標(biāo)準(zhǔn),其中ω>1,ω=1和ω<1分別代表基因受到正選擇(Positive selection),中性選擇(Neutral selection)和純化選擇(Purify selection). 本研究使用PAML 4.9軟件包的CODEML程序,選擇位點模型(Site model)、分支模型(Branch model)和分支位點模型(Branch-site model)進(jìn)行進(jìn)化分析[36].

使用位點模型檢測eIF4G基因在節(jié)肢動物數(shù)據(jù)集中受正選擇的位點,比較M8a和M8模型,利用似然率檢測方法(Likelihood ratio teats,LTRs),計算2ΔlnL值與自由度之間的卡方分布,若P<0.05,則兩個模型之間有顯著差異[37]. 在M8模型中,利用經(jīng)典貝葉斯方法BEB(Bays empirical bays)計算位點的后驗概率(Posterior probability,PP),若PP>0.95,則被認(rèn)為是潛在的正選擇位點[38]. 在分支模型中,首先比較one-ratio和free-ratio模型以確定支系是否具有不同的進(jìn)化速率;其次,將中華絨螯蟹末端分支設(shè)為前景支,比較 one-ratio 模型與two-ratio模型來判斷前景分支是否受正選擇. 使用分支位點模型檢測某一進(jìn)化譜系受正選擇作用影響的位點,本研究中同樣將中華絨螯蟹的末端分支設(shè)為前景支進(jìn)行分析,若Ma0和Ma模型差異顯著且ω>1時,接受正選擇模型Ma,同時所檢測的正選擇位點PP>0.95,則被認(rèn)為是正選擇位點.

此外,使用Datamonkey(http://www.datamonkey.org/)中的固定效應(yīng)似然法(fixes effects likelihood,FEL)、單一似然祖先計數(shù)法(singe likelihood ancestor,SLAC)和FUBRA(Fast unconstrainted bayesian approximation)檢測正選擇位點,設(shè)置FEL和SLAC顯著水平小于0.2,FUBAR后驗概率值大于0.8[39]. 最后,整合PAML和Datamonkey篩選的正選擇位點,將兩種方法以上檢測到的位點視為顯著的正選擇位點,并標(biāo)注在模擬的中華絨螯蟹eIF4G蛋白三維結(jié)構(gòu)中.

2 結(jié)果與討論

2.1 中華絨螯蟹EseIF4G基因cDNA全長序列的克隆與分析

通過RACE PCR擴(kuò)增與測序獲得EseIF4G基因序列片段,使用DNAStar 7.1軟件拼接獲得的各序列,獲得中華絨螯蟹EseIF4G基因的cDNA全長序列為3 769 bp(圖1),GenBank登錄號為KF199900. 其包括568 bp的5′-UTR、822 bp的3′-UTR和2 379 bp的ORF. 其編碼的蛋白質(zhì)具有792個氨基酸,分子量為89.6 kDa,理論等電點pI為6.07. EseIF4G蛋白是不穩(wěn)定蛋白和非分泌型蛋白,沒有明顯的疏水性區(qū)域,沒有跨膜區(qū)且不具有信號肽,定位于細(xì)胞核可能性高達(dá)91.3%.

推導(dǎo)的氨基酸序列進(jìn)行同源比對分析后發(fā)現(xiàn),本實驗克隆的EseIF4G蛋白與其他物種顯示出較高的同源性,例如與克氏原螯蝦(Procambarusclarkii,GenBank登錄號:ASW35070.1)eIF4G蛋白的同源性高達(dá)84%,與南美白對蝦(P.vannamei,GenBank登錄號:XP_027234070.1)eIF4G2-like蛋白的同源性為86%,與灰眼雪蟹(C.opilio,GenBank登錄號:KAG0719495.1)eIF4G2蛋白的同源性為83%,與普通卷甲蟲(A.vulgare,GenBank登錄號:RXG61596.1)eIF4G2蛋白的同源性為60%等.

3′RACE引物以方框標(biāo)注,5′RACE引物以波浪線標(biāo)注,ORF擴(kuò)增引物以雙下劃線標(biāo)注;MIF4G、MA3和W2/eIF5C結(jié)構(gòu)域被分別標(biāo)注為陰影,推導(dǎo)的加尾信號用粗體和下劃線表示,終止密碼子以“*”標(biāo)注.圖1 中華絨螯蟹EseIF4G基因的cDNA全長序列和推導(dǎo)的氨基酸序列結(jié)構(gòu)Fig.1 The full-length cDNA and predicted amino acid sequence of EseIF4G gene from Eriocheir sinensis

用SMART分析EseIF4G蛋白的結(jié)構(gòu)域,結(jié)果表明EseIF4G蛋白含有MIF4G結(jié)構(gòu)域、MA3結(jié)構(gòu)域和W2/eIF5C結(jié)構(gòu)域,前兩個結(jié)構(gòu)域是eIF4G蛋白家族共有的典型結(jié)構(gòu)域. 用Motif Scan搜索EseIF4G蛋白的motif,結(jié)果表明EseIF4G蛋白可能還含有如下功能基序:6個N端糖基化(Asn糖基化)位點、2個環(huán)腺苷酸(cyclic adenosine monophosphate,cAMP)磷酸化位點、11個酪蛋白激酶II(casein kinase II,CK2)磷酸化位點、7個N-?；?N-myristoylation)位點、8個蛋白激酶C(protein kinase C,PKC)磷酸化位點、1個NLS_BP核定位信號和1個富含Gln區(qū)等. 使用PSIPRED預(yù)測EseIF4G蛋白的二級結(jié)構(gòu),結(jié)果表明EseIF4G蛋白包含30個α螺旋,無β-折疊和31個無規(guī)則卷曲. SWISS-MODEL對EseIF4G蛋白進(jìn)行同源建模,顯示該蛋白與模板3l6a.1.A蛋白的匹配度最高,構(gòu)建的蛋白三維結(jié)構(gòu)圖如圖2所示,與PSIPRED預(yù)測結(jié)果一致,該蛋白為全α蛋白.

圖中藍(lán)色代表α-螺旋,淺灰色代表無規(guī)則卷曲,紅色標(biāo)注受正選擇的位點.圖2 中華絨螯蟹EseIF4G蛋白的三維結(jié)構(gòu)Fig.2 Predicted three-dimensional structure ofEseIF4G from Eriocheir sinensis

2.2 多序列比對和系統(tǒng)發(fā)育分析

為了更好地研究EseIF4G與其他同源蛋白的關(guān)系,從NCBI上下載了包括脊椎動物和無脊椎動物在內(nèi)的22個不同物種的eIF4G蛋白序列,使用MEGA X軟件基于鄰接法構(gòu)建了NJ系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3). 系統(tǒng)發(fā)育分析顯示,EseIF4G與無脊椎動物分支(Crustacea+Insecta+Merostomata,甲殼綱+昆蟲綱+肢口綱)聚在了一起;同時,中華絨螯蟹與南美白對蝦(P.vannamei)、普通卷甲蟲(A.vulgare)形成了甲殼綱分支,該分支與昆蟲綱分支和肢口綱分支完全分離.

2.3 中華絨螯蟹EseIF4G基因在其不同幼體發(fā)育階段的mRNA表達(dá)模式

利用qRT-PCR技術(shù)對EseIF4G基因在中華絨螯蟹其不同幼體發(fā)育階段的mRNA表達(dá)進(jìn)行檢測,結(jié)果如圖4所示. 以受精卵期的基因表達(dá)量作為參照,EseIF4G基因在中華絨螯蟹10個不同的幼體發(fā)育階段廣泛表達(dá). 總體上,EseIF4GmRNA表達(dá)量在受精卵、溞狀幼體Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ期相對較高,相反在溞狀幼體Ⅴ期、大眼幼體期、仔蟹Ⅰ、Ⅱ期相對較低.EseIF4G基因的表達(dá)量在短尾化期間顯著波動.EseIF4G基因在溞狀幼體Ⅱ期表達(dá)量最高,而在溞狀幼體Ⅴ期和仔蟹Ⅱ期表達(dá)量最低(P>0.05). 值得注意的是,在Z5期急劇下降至最低后,EseIF4G基因表達(dá)量在大眼幼體期和仔蟹Ⅰ期逐步增加(P<0.05).

每一枝上的數(shù)值表示Neighbor-Joining bootstrap值;氨基酸序列號在物種名之后,不同分支被不同顏色覆蓋;各物種eIF4G蛋白的結(jié)構(gòu)域在對應(yīng)分支后方顯示.圖3 基于鄰接法構(gòu)建的EseIF4G及其同源蛋白的聚類樹狀圖Fig.3 Phylogenetic tree of EseIF4G and its homologs bases on neighbor-joining method

O:受精卵,Z1:溞狀幼體I期,Z2:溞狀幼體Ⅰ期,Z2:溞狀幼體Ⅱ期,Z3:溞狀幼體Ⅲ期,Z4:溞狀幼體Ⅳ期,Z5:溞狀幼體Ⅴ期,M:大眼幼體期,J1:仔蟹Ⅰ期,J2:仔蟹Ⅱ期,J3:仔蟹Ⅲ期. 以卵期基因的表達(dá)量為參照,采用(平均值±標(biāo)準(zhǔn)差)表示,不同的小寫字母表示不同發(fā)育階段表達(dá)量的差異水平顯著(P<0.05),內(nèi)參基因β-actin,n=3.圖4 中華絨螯蟹EseIF4G基因在其不同幼體發(fā)育階段的相對表達(dá)量Fig.4 The relative expression level of EseIF4G gene in different larval development stages of Eriocheir sinensis

2.4 中華絨螯蟹EseIF4G基因的適應(yīng)性進(jìn)化分析

2.4.1 系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系

利用包括中華絨螯蟹在內(nèi)的14種節(jié)肢動物以及外群黑頭軟口鰷的eIF4G基因序列,基于最大似然法構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹. 結(jié)果如圖5顯示,eIF4G基因樹分為三個主要的進(jìn)化枝:甲殼亞門進(jìn)化枝(Crustacea clade)、六足亞門進(jìn)化枝(Hexapoda clade)和螯肢亞門進(jìn)化枝(Hexapoda clade). 比較eIF4G基因樹(圖5-a)和物種樹(圖5-b)后,發(fā)現(xiàn)甲殼動物eIF4G基因樹與物種樹的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)略有差異. 在物種樹中,鰓足綱的大型溞(D.magna)和顎足綱的鵝頸藤壺(P.pollicipes),與其余甲殼動物聚成一個大的進(jìn)化枝;而在基因樹中,大型溞和鵝頸藤壺,與六足亞門昆蟲綱的兩個物種聚為一個進(jìn)化枝;其余的進(jìn)化枝(例如軟甲綱、螯肢亞門)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)完全一致.

a:基于eIF4G基因密碼子序列構(gòu)建的最大似然樹;b:從TimeTree下載的節(jié)肢動物的物種樹.圖5 節(jié)肢動物和外群eIF4G基因的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.5 Phylogenetic tree of eIF4G genes from arthropods and outgroup species

2.4.2 特異性位點檢測

對中華絨螯蟹EseIF4G蛋白的特異性位點檢測結(jié)果如圖6所示,位點97、457為特異性位點,分別位于MIF4G結(jié)構(gòu)域和MA3結(jié)構(gòu)域. 位點97處的氨基酸由谷氨酰胺(Gln,Q)變?yōu)榫彼?Arg,R),位點457處的氨基酸由賴氨酸(Lys,K)變?yōu)榫彼?Arg,R).

圖中特異性位點用紅色標(biāo)記.圖6 中華絨螯蟹EseIF4G基因的特異性位點Fig.6 Segregating sites of EseIF4G gene in Eriocheir sinensis

2.4.3 選擇壓力分析

為研究中華絨螯蟹EseIF4G基因是否受到正選擇作用,首先假設(shè)系統(tǒng)發(fā)生樹所有分支有同一個ω值,one-ratio模型結(jié)果顯示ω值為0.035 5,顯著小于1,表明該基因整體上受純化選擇作用(表3). Free-ratio模型假定系統(tǒng)發(fā)生樹上每一支和節(jié)點都具有獨(dú)立的ω值,發(fā)現(xiàn)free-ratio模型顯著優(yōu)于one-ratio模型,提示不同支系具有不同的進(jìn)化速率. 在分支模型的two-ratio中,將中華絨螯蟹的末端分支設(shè)置為前景支,其余分支設(shè)為背景支,two-ratio模型擬合效果并沒有明顯優(yōu)于one-ratio模型(P=0.440),表明中華絨螯蟹EseIF4G基因與其他近緣甲殼動物有相似的進(jìn)化速率(表3). 其次,使用位點模型對EseIF4G基因檢測,M8模型明顯優(yōu)于M8a模型(P<0.01),但是沒有檢測出后驗概率大于0.95的正選擇位點(表3). 最后,使用分支位點模型,將中華絨螯蟹設(shè)置為前景支,發(fā)現(xiàn)Ma模型和Ma0模型之間沒有顯著差異(P>0.05).

表3 基于分支模型、位點模型和分支位點模型對EseIF4G基因的選擇壓力分析Tablele 3 Selective pressure analysis of EseIF4G gene based on branch model,site model and branch-site model

在Datamonkey網(wǎng)站上選用SLAC、FEL和FUBAR 3種方法檢測,設(shè)置SLAC和FEL顯著水平為0.2,FUBAR后驗概率為0.8. 分析結(jié)果顯示,FEL檢測出3個正選擇位點(448、512和655),FUBAR檢測出 2個正選擇位點(448和655),而SLAC沒有檢測出正選擇位點(表4). 將PAML和Datamonkey 2種方法檢測的結(jié)果整合起來,EseIF4G基因檢測出2個正選擇位點(448和655),標(biāo)注在eIF4G蛋白三維結(jié)構(gòu)中,如圖2所示.

表4 PAML和Datamonkey鑒定EseIF4G基因的正選擇位點Table 4 Positively selected sites of EseIF4G gene by PAML and Datamonkey

eIF4G是eIF4F復(fù)合體的重要組成部分,在翻譯過程中可作為組裝mRNA、核糖體亞基和帽結(jié)合蛋白的骨架蛋白. 本研究克隆了中華絨螯蟹EseIF4G基因的全長cDNA序列. 系統(tǒng)發(fā)育分析發(fā)現(xiàn),EseIF4G蛋白序列具有高度保守的結(jié)構(gòu)域,其在無脊椎動物和脊椎動物的整個物種中高度保守.

中華絨螯蟹胚胎與幼體發(fā)育包括受精卵、5個溞狀幼體期、1個大眼幼體期和3個仔蟹期,此后幼蟹經(jīng)過多次蛻皮發(fā)育為成蟹. 在溞狀幼體Ⅴ期至仔蟹Ⅰ期,中華絨螯蟹幼體形態(tài)發(fā)生顯著變化,即“短尾化”過程. 短尾化之前,蟹類幼體呈類似蝦的體型;短尾化過程中,形態(tài)結(jié)構(gòu)變化過程分為兩個截然相反的過程:分化和整合. 一些部位高度分化(尤其是附肢)或融合在一起(尤其是腹神經(jīng)節(jié));某些部位的功能得到加強(qiáng),例如胸部;某些部位的功能減弱了,例如腹部[18]. 短尾化過程完成后,蟹的顯著形態(tài)變化減少,但體型隨蛻殼而不斷變大. 本實驗中,在中華絨螯蟹幼體發(fā)育的10個階段均檢測到EseIF4G基因表達(dá),表明EseIF4G基因可能在中華絨螯蟹的幼體發(fā)育過程中起調(diào)節(jié)作用. 其次,隨著幼蟹的形態(tài)變化,EseIF4G基因的表達(dá)量也隨之波動,在溞狀幼體Ⅴ期(Z5)突然下降,然后在大眼幼體期(M)顯著升高,這個顯著變化暗示EseIF4G基因可能在中華絨螯蟹的短尾化過程中起調(diào)節(jié)作用. 此外,中華絨螯蟹幼體經(jīng)歷生活環(huán)境由咸淡水轉(zhuǎn)為淡水的過程:從受精卵到大眼幼體期前期生活在江河口或沿海水域等咸淡水中,而后在大眼幼體后期則遷移到淡水中[21,40]. 中華絨螯蟹EseIF4G基因表達(dá)變化的趨勢與其生活史對應(yīng),說明EseIF4G基因在中華絨螯蟹適應(yīng)生活環(huán)境的滲透壓調(diào)節(jié)方面有一定作用. 已有研究表明,中華絨螯蟹EjsHSP90、EjsANK和EjsPCNA基因在仔蟹Ⅰ期腹部組織的表達(dá)量均高于在大眼幼體期腹部組織[19-20],EsScr和EsAntp基因在溞狀幼體Ⅴ期的表達(dá)量最低且顯著高于在大眼幼體期[21]. 上述基因的表達(dá)模式的變化與EseIF4G基因高度相似,驗證了EseIF4G基因隨著幼蟹的形態(tài)變化和生活環(huán)境的遷移,可能參與中華絨螯蟹幼蟹的早期發(fā)育,特別是短尾化過程.

篩查中華絨螯蟹EseIF4G蛋白的特異性位點,發(fā)現(xiàn)位點97、457為特異性位點,分別位于MIF4G結(jié)構(gòu)域和MA3結(jié)構(gòu)域. eIF4G的中間結(jié)構(gòu)域稱為MIF4G結(jié)構(gòu)域,已被證明介導(dǎo)多種蛋白質(zhì)-蛋白質(zhì)相互作用,例如與翻譯起始因子eIF4A和eIF3、RNA的結(jié)合. 同時,除了eIF4F復(fù)合體外,其他含MIF4G結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)還參與了mRNA成熟、監(jiān)視、翻譯和降解等信號通路[41]. eIF4G的C端結(jié)構(gòu)域也被稱為MA3結(jié)構(gòu)域,具有調(diào)控功能,可與ATP依賴性RNA解旋酶eIF4A結(jié)合以促進(jìn)翻譯起始;程序性細(xì)胞死亡4蛋白(PDCD4)也具有兩個MA3結(jié)構(gòu)域,與eIF4G-MA3競爭結(jié)合eIF4A,從而抑制蛋白質(zhì)的合成[42]. 因此推測這兩個特異位點可能與中華絨螯蟹的幼體發(fā)育階段的mRNA組裝、翻譯、降解相關(guān),但需要進(jìn)一步的實驗驗證.

基于one-ratio模型的PAML選擇壓力分析顯示ω值為0.035 5,顯著小于1,表明該基因整體上受純化選擇作用;free-ratio與one-ratio比較顯示不同的節(jié)肢動物譜系具有不同的進(jìn)化速率. 進(jìn)一步,將中華絨螯蟹的末端分支設(shè)為前景支的分支模型和分支位點模型,以及整體水平上的位點模型都沒有檢測到正選擇信號,一定程度上說明中華絨螯蟹EseIF4G基因進(jìn)化保守,純化選擇在該基因進(jìn)化過程中起關(guān)鍵作用,與其他節(jié)肢動物具有相同或類似的功能. 但在選定的節(jié)肢動物中,使用Datamonkey的FEL和FUBAR方法,共同鑒定到兩個正選擇位點(448和655),分別位于MA3和W2結(jié)構(gòu)域. W2結(jié)構(gòu)域是eIF4G蛋白羧基末端小卻保守的結(jié)構(gòu)域,因包含兩個保守的色氨酸得名;充當(dāng)潛在的翻譯調(diào)節(jié)劑參與到eIF2B、eIF5與eIF2亞基,eIF4G與蛋白激酶MNK1的相互作用[43]. 結(jié)果表明,這些位點在節(jié)肢動物eIF4G蛋白進(jìn)化中起重要作用,調(diào)控mRNA翻譯過程和蛋白質(zhì)相互作用,可能參與各種節(jié)肢動物外部形態(tài)、生理活動等的差異調(diào)控. 未來可通過定向誘變等實驗探明EseIF4G基因在中華絨螯蟹幼體發(fā)育階段發(fā)揮的作用,為深入理解中華絨螯蟹短尾化的遺傳學(xué)基礎(chǔ)提供證據(jù).

3 結(jié)論

本研究首次克隆了中華絨螯蟹EseIF4G基因全長cDNA序列,其編碼蛋白具有MIF4G、MA3和 W2/eIF5C 3個保守結(jié)構(gòu)域,在進(jìn)化上與甲殼動物最近,并且在無脊椎動物長期進(jìn)化過程中高度保守.EseIF4G基因在中華絨螯蟹幼體發(fā)育各個階段廣泛表達(dá),在溞狀幼體Ⅴ期表達(dá)量最低,隨后在大眼幼體期表達(dá)量顯著升高,可能參與調(diào)控中華絨螯蟹的短尾化和滲透壓適應(yīng)過程. 同時,檢測到eIF4G蛋白兩個中華絨螯蟹特異性位點和兩個節(jié)肢動物潛在正選擇位點,這些可能是調(diào)控mRNA翻譯和蛋白質(zhì)互作的位點,參與節(jié)肢動物生長、發(fā)育等過程. 本研究為進(jìn)一步探索甲殼動物幼體短尾化調(diào)控機(jī)制提供了基礎(chǔ)資料.