液體活檢在乳腺癌精準(zhǔn)治療中的應(yīng)用進(jìn)展及展望

張 羽，劉 強(qiáng)

中山大學(xué)孫逸仙紀(jì)念醫(yī)院乳腺腫瘤中心，廣東 廣州 510000

在全世界范圍內(nèi)，乳腺癌是最常見的惡性腫瘤，約占女性惡性腫瘤的30%，死亡率與發(fā)病率之比為15%［1］。自從乳腺癌的分子特征，包括免疫組織化學(xué)標(biāo)志物，如雌激素受體（estrogen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）、人表皮生長(zhǎng)因子受體2（human epidermal growth factor receptor 2，HER2）和Ki-67增殖指數(shù)；基因組標(biāo)志物，如BRCA1、BRCA2和PIK3CA；以及免疫學(xué)標(biāo)志物，如腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞和程序性死亡［蛋白］配體-1（programmed death ligand-1，PD-L1），被廣泛描述以來，人們看待乳腺癌的方式已經(jīng)發(fā)生了巨大的變化［2］。近年來，隨著分子生物學(xué)技術(shù)以及“組學(xué)”知識(shí)體系的迅速擴(kuò)大，惡性腫瘤的分子多樣性和復(fù)雜性正在被逐漸揭示［3］，治療方式也從以腫瘤類型為導(dǎo)向轉(zhuǎn)向以基因?yàn)閷?dǎo)向，即根據(jù)生物標(biāo)志物分析為患者進(jìn)行個(gè)體化治療［4］，尤其是對(duì)于具有極其復(fù)雜且個(gè)體獨(dú)特基因改變的轉(zhuǎn)移性癌癥［3，5］，以基因?yàn)閷?dǎo)向的精準(zhǔn)治療更是給患者帶來了新的希望。從患者獲得的腫瘤分子圖譜可以優(yōu)化癌癥個(gè)性化治療方案的選擇，以及顯著改善對(duì)治療反應(yīng)、耐藥及腫瘤復(fù)發(fā)的監(jiān)測(cè)［6］，惡性腫瘤的治療已經(jīng)進(jìn)入精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)時(shí)代。

液體活檢即通過對(duì)體液中腫瘤衍生材料所包含的基因組、蛋白質(zhì)組等數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，可以獲得并縱向?qū)崟r(shí)監(jiān)測(cè)關(guān)于個(gè)體患者腫瘤特征的詳細(xì)信息，如腫瘤基因突變、表觀遺傳學(xué)改變等，為基于精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的治療開辟新思路。本文將簡(jiǎn)要介紹液體活檢中研究較為廣泛的兩種腫瘤衍生材料——循環(huán)腫瘤細(xì)胞（circulating tumor cell，CTC）和循環(huán)腫瘤DNA（circulating tumor DNA，ctDNA），就近年來CTC及ctDNA在乳腺癌精準(zhǔn)治療中的應(yīng)用研究進(jìn)展進(jìn)行綜述，并對(duì)未來的發(fā)展趨勢(shì)予以展望。

1 液體活檢概述

液體活檢，即從患者的血液、尿液、唾液、糞便、腦脊液等體液中分離獲得腫瘤DNA、RNA、腫瘤細(xì)胞或細(xì)胞外囊泡等腫瘤衍生材料的過程［7］，通過進(jìn)一步分析可以獲得腫瘤基因突變、關(guān)鍵基因的拷貝數(shù)改變、蛋白質(zhì)組學(xué)、表觀遺傳學(xué)改變等信息。相較于傳統(tǒng)活檢，液體活檢在克服腫瘤異質(zhì)性、克隆變異，以及連續(xù)采樣等方面具有顯著優(yōu)勢(shì)，使得在整個(gè)治療過程中實(shí)時(shí)反映腫瘤分子圖譜、縱向監(jiān)測(cè)腫瘤反應(yīng)和復(fù)發(fā)等變得可行。既往研究顯示，液體活檢在乳腺癌早期分子診斷、制訂個(gè)性化治療方案、評(píng)估治療效果、預(yù)測(cè)預(yù)后等方面均可能發(fā)揮作用［8］。

1.1 液體活檢中的循環(huán)腫瘤細(xì)胞

CTC是主動(dòng)或被動(dòng)從原發(fā)和（或）轉(zhuǎn)移部位腫瘤中脫落進(jìn)入人體循環(huán)的腫瘤細(xì)胞［6］。它們?cè)谘褐械臄?shù)量相當(dāng)少，每百萬個(gè)白細(xì)胞中幾乎僅有一個(gè)CTC［9］，且在外周血中的半衰期非常短（1.0～ 2.4 h）［10］，這決定了CTC分離技術(shù)的高難度及高挑戰(zhàn)性。

許多技術(shù)已經(jīng)被開發(fā)用于從液體標(biāo)本中檢測(cè)存活的CTC，以獲得關(guān)于腫瘤的信息。這些技術(shù)主要基于以下幾種原理：

①基于免疫磁珠的C T C 分離技術(shù)。如EPISPOT，使用針對(duì)存在于腫瘤細(xì)胞上的上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）的膜結(jié)合抗體，并隨后在體外或體內(nèi)條件下進(jìn)行擴(kuò)增；CellSearch，使用抗體標(biāo)記的磁珠富集具有上皮細(xì)胞系標(biāo)志物（如EpCAM）的CTC，但其局限性在于并不是所有的CTC都帶有EpCAM［11］；AdnaTest，在CellSearch的基礎(chǔ)上還包括聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）步驟來檢測(cè)腫瘤細(xì)胞的mRNA；CTC CHIP，它包含數(shù)千個(gè)標(biāo)記抗體的小微柱，已經(jīng)被用來從血液樣本中捕獲攜帶特定腫瘤抗原的CTC［12］。② 基于負(fù)耗盡的CTC分離技術(shù)：其原理為利用針對(duì)除CTC外細(xì)胞（如白細(xì)胞、紅細(xì)胞、血小板等）的反染色標(biāo)志物，將它們從液體活檢樣本中耗盡，從而CTC得以從血液樣本中濃縮，如EasySep Depletion Kit、RosetteSep，其局限性在于其他血液成分與CTC之間可能存在交叉，在大量白細(xì)胞下拉中有CTC丟失的風(fēng)險(xiǎn)［13］。③基于細(xì)胞大小的CTC分離技術(shù)：其中尺寸放大技術(shù)通過使用標(biāo)記有抗EpCAM抗體的微珠來人為增加CTC的尺寸，克服由于CTC的大小幾乎與白細(xì)胞相同所致CTC損失的限制，從而提高細(xì)胞回收率和純度；CELE系統(tǒng)則可以同時(shí)利用尺寸及變形性差異（CTC比白細(xì)胞更容易變形）來分離和分析CTC，相較于CellSearch系統(tǒng)有更高的靈敏度。④ 基于表面電荷及極化率差異的CTC分離技術(shù)：ApoStreamTM，相較于CellSearch系統(tǒng)同樣被證明可以提高CTC的檢測(cè)和回收［14］。

1.2 液體活檢中的循環(huán)腫瘤DNA

ctDNA只占循環(huán)中細(xì)胞游離DNA（cell-free DNA，cfDNA）的0.1%～ 10.0%，而cfDNA正常血漿水平僅為10～ 100 ng/mL［15］，因此ctDNA在癌癥患者外周血中的含量也是相當(dāng)?shù)偷?。此外，ctDNA片段相較于cfDNA更短，為20～ 50個(gè)堿基對(duì)［16］。血漿中的ctDNA水平隨腫瘤負(fù)荷、分期和治療反應(yīng)而變化［17］，與CTC不同，ctDNA被認(rèn)為是指示腫瘤負(fù)荷的生物標(biāo)志物［18-19］。除了定量外，ctDNA在精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)中的臨床應(yīng)用還體現(xiàn)在可以分析血漿中的ctDNA變異。

與分離和分析極低水平的ctDNA相關(guān)的限制在很大程度上已經(jīng)被不斷發(fā)展的技術(shù)應(yīng)用所減少［20-21］，但樣品處理、ctDNA分離和分析方法尚未完全標(biāo)準(zhǔn)化。ctDNA的分析主要包括以下兩類方法：①靶向方法：專注于特定基因組區(qū)域中的特定基因重排或基因突變，而這些基因重排或基因突變是該類型腫瘤中常見的變異（如乳腺癌中的TP53、PI3KCA、GAB2、IRS2等）。包括基于PCR的液滴數(shù)字聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（droplet digital polymerase chain reaction，ddPCR）、光束法（BEAMing）、個(gè)性化重排末端分析（personalized analysis of rearranged ends，PARE）等，以及基于二代測(cè)序（next generation sequencing，NGS）的標(biāo)記擴(kuò)增深度測(cè)序（tagged-amplicon deep sequencing，Tam-Seq）等方法。這些方法在多種腫瘤中顯示出很高的靈敏度和特異度［22-25］。② 非靶向方法：與靶向方法不同，非靶向方法對(duì)血漿ctDNA進(jìn)行全基因組圖譜分析，因此獲得的腫瘤基因組信息相對(duì)更全面。如大規(guī)模平行測(cè)序、高通量IlluminationsMiseq等。血漿ctDNA全基因組分析在多種腫瘤中被證實(shí)可以獲得關(guān)于腫瘤基因突變、拷貝數(shù)改變，以及染色體重排等信息［26-27］。

2 液體活檢在乳腺癌精準(zhǔn)治療中的應(yīng)用研究進(jìn)展

液體活檢在乳腺癌精準(zhǔn)治療中的研究包括預(yù)測(cè)生存預(yù)后、檢測(cè)微小殘留疾?。╩inimal residual disease，MRD）、監(jiān)測(cè)治療效果，以及指導(dǎo)治療方案的選擇等，以下將從該4個(gè)方面對(duì)近年來的研究進(jìn)展簡(jiǎn)要敘述。

2.1 預(yù)測(cè)生存預(yù)后

對(duì)于早期乳腺癌，一項(xiàng)前瞻性研究發(fā)現(xiàn)在接受手術(shù)及輔助化療前具有1個(gè)或更多CTC的Ⅰ～ Ⅲ期乳腺癌患者的無進(jìn)展生存期（progression-free survival，PFS）和總生存期（overall survival，OS）顯著縮短［28］。2016年的一項(xiàng)meta分析也提示在原發(fā)性乳腺癌患者中，CTC的存在是無病生存期（disease-free survival，DFS）、OS、乳腺癌特異性生存期（breast cancer-specific survival，BCSS）和遠(yuǎn)處無病生存期（distant disease-free survival，DDFS）的一個(gè)獨(dú)立預(yù)測(cè)因子［29］。除了CTC數(shù)目，CTC中表觀遺傳學(xué)改變也可以預(yù)測(cè)預(yù)后，在Chimonidou等［30］從乳腺癌患者血液分離的EpCAM+CTC中，腫瘤/轉(zhuǎn)移抑制基因（如SOX17、BRMS1和CST6）啟動(dòng)子區(qū)的表觀遺傳學(xué)改變，如DNA甲基化，與腫瘤轉(zhuǎn)移增強(qiáng)和預(yù)后不良相關(guān)。另外，在影像學(xué)的基礎(chǔ)上，血液中的CTC水平還能提供額外的預(yù)后信息［31］。既往研究顯示，ctDNA的檢測(cè)同樣與轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)的增加相關(guān)，本團(tuán)隊(duì)的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)新輔助化療開始前基線ctDNA陽性與較短的DFS和OS相關(guān)，特別是在激素受體陰性患者中［32］。PEARLYⅢ期臨床試驗(yàn)納入465例Ⅱ～ Ⅲ期TNBC患者，中位隨訪16.8個(gè)月，在新輔助化療之前進(jìn)行ctDNA拷貝數(shù)變異（copy number aberration，CNA）負(fù)荷檢測(cè)，并分析其預(yù)后價(jià)值。發(fā)現(xiàn)新輔助化療前基線ctDNA能夠預(yù)測(cè)Ⅱ～ Ⅲ期TNBC患者的復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，并且ctDNAⅠ-score獨(dú)立于病理學(xué)完全緩解（pathological complete response，pCR）狀態(tài)顯示出預(yù)后價(jià)值，這提示基線ctDNA可作為TNBC患者升級(jí)或降級(jí)（新）輔助治療策略的有效臨床決定因素［33］。其他類似研究顯示，新輔助治療1個(gè)周期后ctDNA陽性與較短的DFS和OS相關(guān)［34］。Magbanua等［35］發(fā)現(xiàn)對(duì)于高危早期乳腺癌患者，新輔助治療期間或結(jié)束后ctDNA未清除是反應(yīng)不佳和遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)的重要預(yù)測(cè)因素，而ctDNA清除［即使未達(dá)到病理學(xué)完全緩解（nonpathological complete response，non-pCR）］則與較好的生存率相關(guān)，新輔助治療期間對(duì)ctDNA進(jìn)行個(gè)性化監(jiān)測(cè)可能有助于實(shí)時(shí)評(píng)估治療反應(yīng)，并有助于調(diào)整pCR作為生存的替代終點(diǎn)。2022年的一項(xiàng)meta分析報(bào)道基線及新輔助治療結(jié)束后ctDNA的存在與較差的無復(fù)發(fā)生存（recurrencefree survival，RFS）及OS相關(guān)［36］。除此之外，術(shù)后ctDNA監(jiān)測(cè)同樣能夠準(zhǔn)確區(qū)分有遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)和無遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)的患者（靈敏度為93%，特異度為100%）［36］，并且比臨床診斷疾病復(fù)發(fā)平均早數(shù)月［37-38］。

對(duì)于晚期乳腺癌，現(xiàn)有研究已證實(shí)在接受全身治療前外周血中CTC的數(shù)量是轉(zhuǎn)移性乳腺癌PFS和OS的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子［39］，基線CTC水平高與較差的PFS及OS相關(guān)［40-41］，并且在全身治療期間任何時(shí)候CTC數(shù)量增加（≥5vs＜5）與轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者較差的PFS和OS相關(guān)［42］。與CTC相似，ctDNA水平與進(jìn)展期乳腺癌生存結(jié)果密切相關(guān)［40，43］。除了ctDNA水平，ctDNA中遺傳改變的數(shù)量(＜2vs≥2)也被發(fā)現(xiàn)對(duì)PFS和OS有影響［40］。除此之外，CTC及ctDNA在治療前后的動(dòng)態(tài)變化與生存結(jié)果顯著相關(guān)，既往研究顯示，在轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中，治療后CTC計(jì)數(shù)的增加與PFS和OS縮短相關(guān)，當(dāng)添加至完整的臨床病理學(xué)預(yù)測(cè)模型中時(shí)，CTC計(jì)數(shù)還可以提高對(duì)轉(zhuǎn)移性乳腺癌預(yù)后的預(yù)測(cè)價(jià)值［41］。O’Leary等［44］發(fā)現(xiàn)，哌柏西利聯(lián)合氟維司群治療15 d后，PIK3CA突變ctDNA水平的相對(duì)變化對(duì)PFS有很強(qiáng)的預(yù)測(cè)作用，CDR15［治療第15天ctDNA突變豐度（突變拷貝數(shù)/mL）相對(duì)于基線的比率］中位數(shù)水平以下患者的PFS顯著延長(zhǎng)。因此，可以預(yù)見，液體活檢有可能發(fā)展成為預(yù)測(cè)乳腺癌患者生存的早期替代終點(diǎn)。

2.2 檢測(cè)MRD

在完成治愈性治療的早期癌癥患者中，相當(dāng)一部分體內(nèi)仍存在MRD，這些病灶在最初局部和全身治療后持續(xù)存在，成為遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)的潛在來源，尤其是激素受體陽性的乳腺癌，這是與晚期復(fù)發(fā)有關(guān)的典型癌癥［45］。相較于出現(xiàn)臨床復(fù)發(fā)后給予解救治療，及時(shí)發(fā)現(xiàn)MRD可以極大地幫助預(yù)防復(fù)發(fā)和增加這些患者的治愈機(jī)會(huì)，這可能是由于微轉(zhuǎn)移患者腫瘤負(fù)荷低，且MRD可能會(huì)隨著時(shí)間的推移而出現(xiàn)克隆演變導(dǎo)致腫瘤內(nèi)部高度異質(zhì)性［46］。MRD檢測(cè)已廣泛用于血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者［47-48］，但對(duì)于實(shí)體腫瘤患者，治愈性治療后患者體內(nèi)ctDNA和CTC遠(yuǎn)低于已確診轉(zhuǎn)移的患者，因此需要使用超靈敏檢測(cè)技術(shù)，受上述因素的限制，MRD檢測(cè)仍然具有挑戰(zhàn)性。然而，近年來隨著液體活檢技術(shù)尤其是ctDNA的發(fā)展，實(shí)體腫瘤MRD檢測(cè)變得可行并在許多實(shí)體腫瘤中被報(bào)道［49-52］。

ctDNA和CTC在外周血中的典型轉(zhuǎn)運(yùn)時(shí)間在數(shù)小時(shí)范圍內(nèi)［53］，因此，在治愈性治療數(shù)月或數(shù)年后檢測(cè)到ctDNA和（或）CTC表明MRD的持續(xù)存在。既往研究顯示，高危乳腺癌患者化療結(jié)束后2年CTC陽性狀態(tài)預(yù)示著較短的DFS和OS［54］。2018年，Sparano等［55］發(fā)現(xiàn)在確診后至5年內(nèi)出現(xiàn)CTC可以預(yù)測(cè)可手術(shù)的激素受體陽性HER2-乳腺癌患者的晚期復(fù)發(fā)，在激素受體陽性的353例患者中，CTC陽性組的年復(fù)發(fā)率為21.4%，而CTC陰性組僅為2.0%，并且在多因素分析中，CTC檢測(cè)結(jié)果陽性將使復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)增加13.1倍。多項(xiàng)小型研究表明，手術(shù)或完成標(biāo)準(zhǔn)全身系統(tǒng)治療后ctDNA-MRD（基于ctDNA的微小殘留疾?。╆栃曰颊哳A(yù)后差，是復(fù)發(fā)的高風(fēng)險(xiǎn)群體。Olsson等［24］發(fā)現(xiàn)新輔助治療和術(shù)后ctDNA監(jiān)測(cè)可用于評(píng)估MRD及復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)，其靈敏度和特異度分別達(dá)到93%、100%，在86%的患者中，基于ctDNA的檢測(cè)先于臨床檢測(cè)轉(zhuǎn)移，平均提前時(shí)間為11個(gè)月。Garcia-Murillas等［37］也發(fā)現(xiàn)，在完成治愈性治療后檢測(cè)血漿中的ctDNA可以高度準(zhǔn)確地預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)，而序列樣本中的突變跟蹤可以增加預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)的靈敏度，相較于臨床復(fù)發(fā)中位提前時(shí)間為7.9個(gè)月。2019年Garcia-Murillas等［56］前瞻性使用個(gè)性化的腫瘤特異性PCR，監(jiān)測(cè)接受手術(shù)及全身系統(tǒng)治療后患者外周血中的ctDNA，在隨訪的第一年每 3個(gè)月采集1次，隨后每6個(gè)月采集1次，發(fā)現(xiàn)與臨床復(fù)發(fā)相比，ctDNA檢測(cè)到復(fù)發(fā)的中位時(shí)間提前10.7個(gè)月（95% CI：8.1～ 19.1 個(gè)月），并且與所有乳腺癌亞型相關(guān)。此外，一項(xiàng)基于83例確診5年以上臨床明確無復(fù)發(fā)的高危激素受體陽性/HER2-乳腺癌患者的前瞻性研究，中位隨訪8.4年，所有發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的6例患者均可在外周血中檢測(cè)到ctDNA，且相較于臨床復(fù)發(fā)中位時(shí)間提前達(dá)1年［57］。另外一項(xiàng)研究對(duì)納入156例乳腺癌患者的1 141個(gè)術(shù)后監(jiān)測(cè)血液樣本進(jìn)行了回顧性分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ctDNA檢測(cè)陽性的患者手術(shù)后RFS較差（HR=47.50；95% CI：18.5～ 161.4；P＜0.001），且術(shù)后連續(xù)監(jiān)測(cè)ctDNA可相較于臨床顯著提前預(yù)測(cè)轉(zhuǎn)移性復(fù)發(fā)（中位10個(gè)月，范圍：0～ 39個(gè)月），其中激素受體陽性/HER2-亞型提前預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)中位數(shù)為15個(gè)月（范圍：2～ 39個(gè)月）、TNBC亞型為9個(gè)月（范圍：0～ 20個(gè)月）、激素受體陽性/HER2+亞型為8個(gè)月（范圍：5～ 14個(gè)月）、HR-/HER2+亞型為6個(gè)月（范圍：0.5～ 12個(gè)月）［58］。因此，外周血ctDNA與早期乳腺癌未來復(fù)發(fā)高風(fēng)險(xiǎn)相關(guān)，更重要的是，早期發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)移性復(fù)發(fā)為治療干預(yù)提供了可能的窗口期，但仍需要前瞻性研究來評(píng)估分子復(fù)發(fā)檢測(cè)指導(dǎo)輔助治療的潛力。

2.3 監(jiān)測(cè)治療效果

液體活檢作為一種相對(duì)無創(chuàng)的活檢方法，在治療期間易于獲得連續(xù)的血液樣本，尤其是當(dāng)腫瘤轉(zhuǎn)移至傳統(tǒng)活檢難以取樣的部位（如肺或腦等），更加體現(xiàn)出液體活檢的優(yōu)勢(shì)。既往研究報(bào)道，無論是早期乳腺癌的新輔助治療、輔助治療，還是轉(zhuǎn)移性乳腺癌的解救治療，液體活檢都可以用于縱向監(jiān)測(cè)治療效果，進(jìn)而指導(dǎo)臨床決策。

2.3.1 新輔助治療

本團(tuán)隊(duì)使用覆蓋1 021個(gè)基因的大型面板，縱向監(jiān)測(cè)接受新輔助治療的早期乳腺癌患者外周血中的ctDNA，發(fā)現(xiàn)在新輔助治療2個(gè)周期及新輔助治療結(jié)束后ctDNA的水平與腫瘤應(yīng)答顯著相關(guān)，并且新輔助治療2個(gè)周期后ctDNA水平的變化預(yù)測(cè)局部腫瘤對(duì)治療的反應(yīng)比超聲檢查更好［32］。2021年Magbanua等［35］使用包含16個(gè)左右突變基因的個(gè)性化面板，監(jiān)測(cè)新輔助治療期間患者外周血ctDNA的動(dòng)態(tài)變化，發(fā)現(xiàn)ctDNA的清除與腫瘤對(duì)治療的反應(yīng)相關(guān)，早期（1個(gè)周期后）清除相較于早期未清除患者的pCR率高，而越后期未清除對(duì)non-pCR的陽性預(yù)測(cè)值越高。另外一項(xiàng)研究納入了ABCSG-34試驗(yàn)招募的187例患者（其中127例為激素受體陽性，57例為TNBC），回顧性分析了患者新輔助系統(tǒng)治療（neoadjuvant systemic treatment，NST）期間381例血液樣本，發(fā)現(xiàn)在NST中期檢測(cè)和持續(xù)存在ctDNA有可能負(fù)面預(yù)測(cè)對(duì)NST的反應(yīng)，并識(shí)別無法達(dá)到pCR或?qū)⒈粴w類為殘留腫瘤負(fù)荷（residual cancer burden，RCB）Ⅱ/Ⅲ的患者，提示pCR或RCB的無創(chuàng)鑒定在未來可能有助于臨床決策，進(jìn)一步提高患者獲益［59］。除此之外，甲基化RASSF1同樣與新輔助治療反應(yīng)（降低vs不降低）及預(yù)測(cè)復(fù)發(fā)相關(guān)（隨訪3～ 33個(gè)月）；而甲基化基因清除與pCR顯著相關(guān)［60］。因此，在新輔助治療期間監(jiān)測(cè)ctDNA可能有助于實(shí)時(shí)評(píng)估治療反應(yīng)及療效。

2.3.2 輔助及解救治療

在HER2陰性的早期乳腺癌患者中，手術(shù)和（新）輔助化療后使用曲妥珠單抗治療并不會(huì)降低CTC檢出率［61］，而既往的一項(xiàng)大型隨機(jī)試驗(yàn)恰好顯示與在該患者群體中曲妥珠單抗療效為陰性結(jié)果［62］。在接受化療或內(nèi)分泌治療的轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者中，CTC計(jì)數(shù)與影像學(xué)疾病進(jìn)展之間存在強(qiáng)相關(guān)性，并且這種相關(guān)性適用于成像時(shí)（優(yōu)勢(shì)比OR=6.3）、成像前3～ 5周（OR=3.1）和成像前7～ 9周（OR=4.9）的CTC結(jié)果，這表明CTC可用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)，并在必要時(shí)迅速改變治療方案［63］。而Dawson等［64］研究發(fā)現(xiàn)，在接受全身治療的晚期乳腺癌患者中，與CA153或CTC相比，ctDNA水平顯示出更大的動(dòng)態(tài)范圍，以及與腫瘤負(fù)荷變化更顯著的相關(guān)性。并且19例患者中的10例（53%）在影像學(xué)確定疾病進(jìn)展前平均5個(gè)月，ctDNA水平在一個(gè)或多個(gè)連續(xù)時(shí)間點(diǎn)增加，這提示ctDNA可能是監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)更敏感的生物標(biāo)志物。

2.4 指導(dǎo)治療方案的選擇

通過采集患者的外周血進(jìn)行CTC和（或）ctDNA分析，可能檢測(cè)出具有遺傳和（或）表觀遺傳學(xué)變異的患者群體，這些變異可能是特定藥物的治療或耐藥靶點(diǎn)；另外，液體活檢有助于以“實(shí)時(shí)”方式檢測(cè)腫瘤相關(guān)基因的不斷演變，這有助于選擇并及時(shí)更換更有效的治療方案。尤其是對(duì)于轉(zhuǎn)移性乳腺癌的患者，每個(gè)患有轉(zhuǎn)移性癌癥的患者都有一組復(fù)雜的、往往是獨(dú)特的基因組異常［3，5］，因此，為了精確地靶向惡性腫瘤，治療更加需要個(gè)性化。

利用CellSearch系統(tǒng)針對(duì)ER、B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2基因（B cell lymphoma/leukemia-2gene，BCL2）、人表皮生長(zhǎng)因子受體2（epidermal growth factor receptor 2，EGFR2）和Ki-67增殖指數(shù)等標(biāo)志物分離的CTC所開發(fā)的新型CTC內(nèi)分泌治療指數(shù)，是預(yù)測(cè)乳腺癌患者內(nèi)分泌治療反應(yīng)的重要參數(shù)［65］。既往有研究顯示，芳香化酶抑制劑（aromatase inhibitor，AI）可能誘導(dǎo)ESR1基因突變［66-67］，ctDNA中ESR1突變陽性的晚期乳腺癌患者對(duì)依西美坦的反應(yīng)不佳，與內(nèi)分泌耐藥及疾病進(jìn)展相關(guān)［66］，而在將藥物方案從依西美坦改為氟維司群（ER下調(diào)劑）或在依西美坦中加入依維莫司（mTOR抑制劑）后，PFS有所改善［68］。另外，CTC中ESR1甲基化改變則與對(duì)依維莫司/依西美坦方案無反應(yīng)有關(guān)［69］。除此之外，ctDNA中的ESR1突變可以在臨床進(jìn)展前的6、7個(gè)月被檢測(cè)到，這為早期治療干預(yù)提供了充足的機(jī)會(huì)［70］。O’Leary等［44］研究發(fā)現(xiàn)，在接受哌柏西利與氟維司群聯(lián)合治療的激素受體陽性晚期乳腺癌患者中，當(dāng)在血漿中跟蹤PIK3CA主干突變時(shí)，PIK3CA突變ctDNA水平的早期相對(duì)變化預(yù)測(cè)長(zhǎng)期生存結(jié)果的時(shí)間遠(yuǎn)遠(yuǎn)早于腫瘤大小的變化，在治療第15天通過檢測(cè)ctDNA突變豐度即可對(duì)治療反應(yīng)進(jìn)行個(gè)體化早期評(píng)估，這為臨床治療方案的選擇和更換提供指導(dǎo)。Arpino等［71］發(fā)現(xiàn)結(jié)合ctDNA和胸苷激酶1活性（thymidine kinase 1 activity，TKa）兩種生物標(biāo)志物的早期動(dòng)態(tài)評(píng)估可能會(huì)改善RIB+LET（瑞博西尼+來曲唑）聯(lián)合治療的療效預(yù)測(cè)，在治療無效患者中，高度呈現(xiàn)出ctDNA+/TKa+。且僅需兩周的時(shí)間，即可以區(qū)分對(duì)治療有效和無效的患者。這種通過極小創(chuàng)傷、不需要組織穿刺來早期預(yù)測(cè)內(nèi)分泌治療效果的方法具有良好的應(yīng)用前景。乳腺癌患者液體活檢分析的關(guān)鍵研究見表1。

表1 乳腺癌患者液體活檢分析的關(guān)鍵研究Tab.1 Key studies of liquid biopsy analyses in patients with breast cancer

3 總結(jié)及未來展望

在過去的5年里，隨著NGS、ddPCR等技術(shù)的發(fā)展，液體活檢在臨床上的潛在應(yīng)用得到了廣泛的研究，在乳腺癌的精準(zhǔn)治療中顯示出巨大的潛力。它可以監(jiān)測(cè)對(duì)不同治療方案的反應(yīng)，并且是比影像學(xué)更敏感的生物標(biāo)志物，CTC和ctDNA能夠在影像學(xué)改變出現(xiàn)之前的幾個(gè)月預(yù)測(cè)疾病進(jìn)展，可以幫助臨床醫(yī)師在必要時(shí)及時(shí)改變治療方案，防止疾病復(fù)發(fā)或進(jìn)展。液體活檢還可以用于檢測(cè)完成手術(shù)和（新）輔助治療后體內(nèi)是否有微小殘留疾病，及時(shí)發(fā)現(xiàn)MRD可以極大地幫助預(yù)防復(fù)發(fā)和增加這些患者的治愈機(jī)會(huì)。此外，ctDNA的分子圖

譜比原發(fā)腫瘤更能反映復(fù)發(fā)/轉(zhuǎn)移疾病，因此ctDNA測(cè)序也可以為后續(xù)治療提供更好的指導(dǎo)。

對(duì)于使用內(nèi)分泌治療的乳腺癌患者，ctDNA檢測(cè)有助于識(shí)別對(duì)AI等療法產(chǎn)生耐藥的突變和（或）表觀遺傳學(xué)改變，這有助于在疾病進(jìn)展之前盡早改變治療方案。

雖然液體活檢在乳腺癌精準(zhǔn)治療方面的研究取得了令人矚目的進(jìn)展，但是仍存在一些問題。譬如多數(shù)患者隊(duì)列相當(dāng)?。ㄓ绕涫莄tDNA分析，很多研究中評(píng)估的患者數(shù)量＜50例），需要在更大的前瞻性臨床試驗(yàn)中進(jìn)一步驗(yàn)證這些發(fā)現(xiàn)；此外，在分離和分析血液中腫瘤衍生物方面，還需要更多的工作來進(jìn)一步改進(jìn)技術(shù)，并在目前眾多的技術(shù)和檢測(cè)程序中，確定最優(yōu)的檢測(cè)策略，為其在臨床上的使用建立標(biāo)準(zhǔn)化方案。

相信隨著時(shí)間的推移，液體活檢將在乳腺癌臨床實(shí)踐中發(fā)揮更大的作用。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。