柚木野螟成蟲復(fù)眼外部形態(tài)和超微結(jié)構(gòu)觀察

苑鵬宇, 胡可炎, 錢沉魚, 王勝坤, 溫秀軍, 王 偲, 馬 濤,*

(1. 華南農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)與風(fēng)景園林學(xué)院, 廣州 510642; 2. 中國林業(yè)科學(xué)研究院熱帶林業(yè)研究所, 廣州 510520)

昆蟲復(fù)眼(compound eye)是探測和識別外部環(huán)境的主要視覺器官，其形態(tài)學(xué)和內(nèi)部結(jié)構(gòu)特征決定了視覺功能特性，在昆蟲覓食、求偶、搜尋產(chǎn)卵場所、歸巢和避敵等行為中發(fā)揮著重要作用，進而影響其識別形狀和顏色以及檢測周圍環(huán)境中的特定對象的能力(Rutowskietal., 2002; Warrantetal., 2010)。研究復(fù)眼的形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征為探討昆蟲對明暗環(huán)境的適應(yīng)調(diào)控奠定組織學(xué)和生理學(xué)基礎(chǔ)，也為理解其光視覺行為與相關(guān)生理反應(yīng)提供重要依據(jù)。

柚木野螟Eutectonamachaeralis屬鱗翅目草螟科，是危害珍貴樹種柚木Tectonagrandis的主要食葉害蟲(吳士雄等, 1979; Lanetal., 2020)。幼蟲取食葉肉留下葉脈，呈疏網(wǎng)狀，嚴重時林相如火燒；成蟲白天隱藏在林內(nèi)地被物或雜草中，夜間集中樹冠處活動。該蟲發(fā)生量大、世代周期短、為害期長，并且蟲口高峰期正值柚木生長季節(jié)，嚴重影響植物光合作用，致使柚木生長減慢，對闊葉樹生態(tài)系統(tǒng)產(chǎn)生嚴重威脅。目前相關(guān)研究多側(cè)重于柚木野螟生物學(xué)特性和生物化學(xué)方面(張蒙等, 2014; 藍來嬌等, 2018, 2019, 2020)，關(guān)于其復(fù)眼結(jié)構(gòu)特征、視覺行為及其光適應(yīng)機制等尚未研究報道。

本研究利用光學(xué)和電子顯微技術(shù)觀察柚木野螟復(fù)眼的形態(tài)、組織結(jié)構(gòu)和超微結(jié)構(gòu)，旨在闡明其復(fù)眼形態(tài)和結(jié)構(gòu)特征，為更好地了解柚木野螟復(fù)雜的視覺行為和感光機制的關(guān)系奠定基礎(chǔ)，以期為發(fā)展柚木野螟靶標(biāo)精準(zhǔn)、環(huán)境友好的綠色防控技術(shù)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試蟲源

柚木野螟成蟲和幼蟲均采于廣東省惠州市龍源興茂生態(tài)園(22.50°N, 114.30°E)，人工氣候箱中飼養(yǎng)，飼養(yǎng)溫度為26±1℃，相對濕度為75%～80%，光周期為16L∶8D。

1.2 掃描電子顯微鏡樣品制備及觀察

解剖觀察前，取柚木野螟雌雄成蟲各10頭，冷凍麻醉處理10 min。斷頭后，置于2%多聚甲醛和2.5%戊二醛混合固定液(10%多聚甲醛∶25%戊二醛∶0.2 mol/L磷酸緩沖溶液∶蒸餾水=2∶1∶5∶2, v/v)(pH 7.2)中4℃固定24 h。0.1 mol/L磷酸緩沖液(pH 7.2)清洗樣品3次，每次10 min。30%, 50%, 70%, 80%和90%乙醇梯度脫水各15 min，再用100%乙醇脫水3次，每次15 min。脫水后，用乙酸異戊酯置換2次，各30 min。之后，經(jīng)過CO2臨界點干燥，用雙面導(dǎo)電膠將樣品固定到樣品臺上，放入自動精細離子濺射儀(JFC-1600)內(nèi)噴金2次，每次1 min。置于掃描電子顯微鏡(JEOL, JSM-6510LV)下觀察并拍照。

1.3 透射電子顯微鏡樣品制備及觀察

取柚木野螟雌雄成蟲各10頭，斷頭后，在光學(xué)顯微鏡下剖獲完整復(fù)眼。將復(fù)眼放入2%多聚甲醛+4%戊二醇混合液中，經(jīng)醋酸雙氧鈾塊染色后4℃下避光過夜。固定后的復(fù)眼樣品經(jīng)緩沖液漂洗4次，每次20 min；再用鋨酸固定液避光固定4 h，固定畢用雙氧水漂洗多次。30%, 50%, 70%, 85%和95%乙醇溶液逐級脫水，每次15 min，再用100%的乙醇脫水2次，每次20 min。隨后，用3個不同體積比例的丙酮和樹脂混合物(丙酮∶樹脂=3∶1, 1∶1和1∶3, v/v)依次滲透，再用純樹脂滲透兩次，每次12 h。滲透好的樣品用純樹脂包埋，將包埋好的樣品置于30℃烘箱中聚合12 h，再在60℃下聚合48 h。

聚合完成后，在Leica EM UC7冷凍超薄切片機上，將樣品塊分別用玻璃刀、鉆石刀進行半薄切片(約2 μm)和超薄切片(約70 nm)。半薄切片置于帶水滴的載玻片上，烘干后用1%甲苯胺藍染液染色，用蒸餾水沖洗掉染料，在連接CCD成像系統(tǒng)的Olympus BX-51型光學(xué)顯微鏡下觀察并拍照。超薄切片依次用2%醋酸雙氧鈾染色8 min和4%檸檬酸鉛染色10 min，在FEI/Talos L 120C透射電子顯微鏡下觀察并拍照。

1.4 數(shù)據(jù)分析

上述所拍攝照片均使用Adobe Photoshop CC 2018添加比例尺和標(biāo)注，應(yīng)用ImageJ 1.8.0軟件測量，每個指標(biāo)至少觀測5個樣品。數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0軟件進行統(tǒng)計，其中利用獨立樣本t檢驗對掃描電子顯微鏡圖中柚木野螟雌、雄成蟲的小眼周長、直徑等測量數(shù)據(jù)進行分析。

2 結(jié)果

2.1 柚木野螟成蟲復(fù)眼外部形態(tài)

柚木野螟成蟲復(fù)眼著生于頭部觸角基部，屬對稱性復(fù)眼。從蟲體頭部的背面觀可以看出，復(fù)眼位于頭部兩側(cè)，左右復(fù)眼外部形態(tài)基本一致，呈橢球形，有光澤，長軸約823.69 μm，短軸約386.15 μm(圖1: A, B)。小眼面微外凸，排列整齊緊密有規(guī)律，各小眼間平均間隔0.18 μm，復(fù)眼中心小眼呈正六邊形，邊緣偶有五邊形(圖1: C, D)，外表面密布著角膜乳突(圖1: E)。柚木野螟雌、雄成蟲復(fù)眼總面積相差不大，但在小眼數(shù)量、大小及邊長等方面上表現(xiàn)出差異，雌蟲小眼面積略小于雄蟲，雌、雄成蟲小眼數(shù)量分別為2 300～2 755個和1 950～2 316個(表1)，小眼間偶爾可見感覺毛，長約8.50～9.75 μm(圖1: F)。

表1 柚木野螟雌雄成蟲復(fù)眼外部形態(tài)結(jié)構(gòu)的參數(shù)比較

圖1 掃描電子顯微鏡下柚木野螟成蟲視覺器官外部形態(tài)

2.2 柚木野螟成蟲復(fù)眼組織結(jié)構(gòu)

柚木野螟成蟲單個小眼平均長度為193.40±1.85 μm，從外到內(nèi)為角膜、晶錐、視桿、初級色素細胞(primary pigment cell)、次級色素細胞(secondary pigment cell)和基膜(圖2: A)。綜合縱切和不同層深的橫切可見，柚木野螟成蟲復(fù)眼中心區(qū)晶錐多層緊密排布，晶錐下方無細胞結(jié)構(gòu)和色素顆粒，呈空腔狀；邊緣區(qū)角膜下方的晶錐呈子彈狀，與視網(wǎng)膜細胞之間存在明顯的透明區(qū)，長約29.92±4.75 μm，主要為次級色素細胞，屬重疊像眼(圖2: B, C)。

圖2 柚木野螟雌成蟲復(fù)眼組織結(jié)構(gòu)光學(xué)顯微鏡觀察

2.3 柚木野螟成蟲復(fù)眼組織超微結(jié)構(gòu)

柚木野螟雌、雄成蟲小眼的形態(tài)和結(jié)構(gòu)均無明顯差異。因此，為方便描述，下文統(tǒng)一選擇雌蛾的小眼從外到內(nèi)的結(jié)構(gòu)進行描述。

小眼的屈光器由角膜和晶錐構(gòu)成，角膜位于最外層，寬18.34±1.21 μm，外曲面半徑為15.45±0.73 μm，最厚處約為9.03±0.33 μm，主要保護復(fù)眼免受機械損傷。角膜外密集分布微小凸起，即角膜乳突(corneal nipples)，以減少光線反射并增加感受能力，直徑約180±10 nm，高約270±30 nm。角膜縱切面為透明層狀結(jié)構(gòu)，呈凸透鏡狀，約有25個纖維層，內(nèi)外層排列緊密，中間排列較疏松，各層染色深淺不一，表明其質(zhì)地不均勻(圖3: A)。

角膜下方的晶錐被一對初級色素細胞包圍，縱切面呈上寬下窄的子彈狀，長約28.54±1.4 μm，最寬處約15.67±1.24 μm，與角膜一同構(gòu)成屈光器(圖3: B)。晶錐橫切面近卵圓形，由4個等分的晶錐細胞(crystalline cone cell)及其細胞分泌物組成，染色強度由內(nèi)到外逐步變亮(圖3: C)。晶錐細胞細胞核位于晶錐最遠端(圖3: D)，細胞質(zhì)從核區(qū)沿中央分泌區(qū)外圍向下延伸(圖3: B)，并且分布大量平行于晶錐軸的微管。

一對初級色素細胞與角膜相接，一直圍繞晶錐(圖3: A)，細胞核卵圓形，位于晶錐的中部水平(圖4: C)，細胞質(zhì)中分布許多直徑為0.77±0.09 μm的球狀色素顆粒，近端有許多電子致密粒子(圖3: A; 圖4: D)，遠端含有線粒體和光面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，以分泌形成新的角膜生成物(圖3: D)。

6個次級色素細胞占據(jù)相鄰小眼之間的空間，從上至下依次圍繞初級色素細胞、視網(wǎng)膜細胞直至基膜，也被稱為膜間色素細胞(圖3: A; 圖4: C)。 次級色素細胞的細胞核分布于晶錐的遠端(圖4: A)，細胞質(zhì)多呈中性或弱電子密度，形成一個“透明區(qū)”，寬度為25.74～38.60 μm，含大量囊泡，將小眼的屈光器和感光層分開，分布許多直徑為0.55±0.05 μm的球狀色素顆粒(圖4: B)，明顯小于初級色素細胞中色素顆粒大小(表2)，并且電子密度分布不一。

表2 柚木野螟成蟲復(fù)眼內(nèi)色素顆粒直徑 (μm)

圖3 柚木野螟雌成蟲小眼遠心端透射電子顯微鏡觀察

圖4 柚木野螟雌成蟲小眼遠心端透射電子顯微鏡觀察

透明區(qū)將視桿層與屈光器分隔，偶爾視桿遠端延伸至透明區(qū)。晶錐下方，沿小眼縱軸11個視網(wǎng)膜細胞內(nèi)側(cè)細胞膜特化形成細絲狀微絨毛，這些微絨毛整齊緊湊地排列在一起組成視小桿，呈放射狀排列，組合呈融合型視桿(圖5: A)。另一個視網(wǎng)膜細胞可見于近基膜端，故稱為基底視網(wǎng)膜細胞。中央融合的視桿，全長約125.98±5.18 μm，從晶錐的下方延伸至基底，遠端視桿的視網(wǎng)膜細胞數(shù)目變化為±1，視桿通過錐形微氣管絨氈層彼此隔離，與次級色素細胞不同，相鄰小眼之間不共用微氣管，因此小眼間可見雙層微氣管(圖5: B)。透明區(qū)消失于視桿遠端和近端交界處。次級色素細胞填充相鄰視網(wǎng)膜細胞之間的空間，但在視桿近端，該細胞逐漸變細，接近基底時末端膨大(圖5: B, D)。視網(wǎng)膜細胞色素顆粒多集中于基膜近端，直徑約0.43±0.05 μm的色素顆粒，且該區(qū)域圍繞視網(wǎng)膜細胞的微氣管明顯變大，并呈現(xiàn)出更加復(fù)雜嵴結(jié)構(gòu)(圖5: C)?；滓暰W(wǎng)膜細胞被其余11個視網(wǎng)膜細胞的軸突完全包裹，細胞核幾乎充滿整個細胞質(zhì)空間，并且細胞質(zhì)中分布線粒體和高爾基體等細胞器(圖5: D)。

圖5 柚木野螟雌成蟲小眼視網(wǎng)膜細胞近心端橫切透射電子顯微鏡觀察

小眼最底部為柵欄狀的基底膜，厚度約1.03±0.27 μm，是一種高度特化的規(guī)則細胞外基質(zhì)變體，排列在上皮細胞的底部上，將眼部感光層與神經(jīng)層分隔(Fischeretal., 2012)。基底膜上方，基底視網(wǎng)膜細胞變成以擁有線粒體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為特征的軸突，同其他視網(wǎng)膜細胞和次級色素細胞的軸突一起穿過基底膜上小孔進入視葉(圖6: A, B)。一些膜下色素細胞參與基底膜的形成，可看到其細胞核和色素顆粒(圖6: C)?；ど系男】孜挥诿總€小眼的基底中央，并和基膜下方氣管細胞產(chǎn)生的膜間間隙，是視網(wǎng)膜細胞軸突向內(nèi)神經(jīng)投射的開口(圖6: D)。

圖6 柚木野螟雌成蟲小眼基膜透射電子顯微鏡觀察

3 討論

柚木野螟復(fù)眼呈橢球形，屬對稱性復(fù)眼，占據(jù)頭部大部分空間，視野較大而小眼間角較小，對目標(biāo)物體的敏銳度高。其雌、雄成蟲復(fù)眼在小眼數(shù)量和大小上表現(xiàn)出差異： 雌性成蟲復(fù)眼有2 300～2 755個小眼，雄性成蟲有1 950～2 316個小眼，并且雌蟲小眼面積略小于雄蟲的。昆蟲視覺能力受復(fù)眼大小、空間位置及小眼數(shù)量等諸多因素的影響(Land, 1997; 張勝杰等, 2015)，一般情況下復(fù)眼中小眼數(shù)量越多，面積越大，成像越清晰(文超等, 2019)。由此推測，柚木野螟雌性成蟲的復(fù)眼分辨能力稍強于雄性，更利于定位寄主或產(chǎn)卵場所等。這種復(fù)眼性二態(tài)的現(xiàn)象也表現(xiàn)在其他昆蟲中，像二點委夜蛾Athetislepigone和Operophterabrumata雄蛾小眼數(shù)均多于雌蛾，雄蛾有更發(fā)達的視力尋找雌蛾交配(Meyer-Rochowetal., 2008; 楊心月, 2015)；鞘翅目(Coleoptera)大場雌光螢Rhagophthalmusohbai雌、雄成蟲小眼數(shù)量差異極大，雄蟲小眼個數(shù)約3 000個，而雌性小眼個數(shù)僅35個(Lauetal., 2007)；膜翅目(Hymenoptera)紅火蟻Solenopsisinvicta復(fù)眼的形狀、小眼數(shù)目和形狀、表面被物隨性別和品級不同均有較大差異，生殖蟻顯示出更為發(fā)達的視覺能力(范凡, 2008)。

表3 柚木野螟成蟲復(fù)眼內(nèi)部形態(tài)結(jié)構(gòu)

柚木野螟復(fù)眼的小眼角膜表面被有無數(shù)微小的角膜乳突，Bernhard等(1970)根據(jù)角膜乳突高度進行了分類：Ⅰ類(高度低于50 nm)，Ⅱ類(高度50-200 nm)、Ⅲ類(高度約250 nm)。角膜乳突通常出現(xiàn)在夜行型昆蟲復(fù)眼表面，在其復(fù)眼光學(xué)系統(tǒng)中發(fā)揮防反射作用，類別編號(Ⅰ-Ⅲ)越高，抗反射功能越有效(Stavengaetal., 2006)。其中Ⅱ類和Ⅲ類，有效減少眼睛表面的光線反射，為夜行型昆蟲提供偽裝，并且在空氣和角膜材料之間提供折射率的分級轉(zhuǎn)換，顯著增加進入角膜晶錐的光量效率(Meyer-Rochowetal., 1979)。柚木野螟復(fù)眼的角膜乳頭高度為255.95±35.05 nm，屬于Ⅲ類，具有多波段抗反射的作用。此外柚木野螟小眼間偶見感覺毛，但是否利于其感知風(fēng)速和進行飛翔調(diào)控還需進一步研究。

圖7 柚木野螟成蟲小眼結(jié)構(gòu)示意圖

在許多夜行性昆蟲的重疊像眼中，主要通過瞳孔反應(yīng)來適應(yīng)明暗環(huán)境的變化(Warrantetal., 1996)，主要表現(xiàn)為初級和次級色素細胞內(nèi)的色素顆粒在光適應(yīng)條件下向近側(cè)遷移以減少視網(wǎng)膜處的光通量，在暗適應(yīng)條件下向遠側(cè)遷移以增加光通量，如雙翅目(Diptera)黑帶食蚜蠅Episyrphusbalteatus、橘小實蠅Bactroceradorsalis(張勝杰等, 2015; 劉歡等, 2017)和脈翅目(Neuroptera)大草蛉Chrysopapallens(張海強等, 2007)等。通常重疊像眼小眼數(shù)量越多、焦距越短、瞳孔和視桿的直徑越大，其光學(xué)靈敏度越高(楊小凡等, 2021)。電生理學(xué)研究表明，色素顆粒的縱向遷移可使重疊像眼靈敏度提升3個量級單位，極暗環(huán)境下，重疊像眼感光細胞的光傳導(dǎo)具有級聯(lián)反應(yīng)，最大可提高6個量級單位(Bernhardetal., 1960a, 1960b; Warrantetal., 1996)。同時，夜蛾類復(fù)眼不僅通過色素顆粒移動調(diào)節(jié)和適應(yīng)明暗條件，而且其明暗適應(yīng)的狀態(tài)可隨光暗環(huán)境強度變化而轉(zhuǎn)化。近來對草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda的研究結(jié)果，證明了昆蟲復(fù)眼明暗適應(yīng)狀態(tài)轉(zhuǎn)化與趨光性的關(guān)系(蔣月麗等, 2021)。本研究中，柚木野螟試蟲是在光適應(yīng)下解剖，可觀察到色素顆粒均勻分布于透明區(qū)、視網(wǎng)膜細胞和色素細胞中(圖4: B)，但柚木野螟是否也是通過色素顆粒的縱向移動來適應(yīng)不同明暗環(huán)境尚待深入研究，后期可進一步探索柚木野螟趨光行為的發(fā)生和調(diào)控機制。