沃爾巴克氏菌調(diào)控小茶尺蠖和灰茶尺蠖雜交卵孵化

王志博, 劉永健, 白家赫, 張欣欣, 肖 強(qiáng),*

(1. 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院茶葉研究所, 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部茶葉質(zhì)量安全控制重點實驗室, 杭州310008;2. 中國科學(xué)院分子植物卓越創(chuàng)新中心, 上海 200031)

Wolbachia是一類廣泛共生于節(jié)肢動物宿主細(xì)胞內(nèi)的革蘭氏陰性細(xì)菌，可通過多種方式調(diào)節(jié)宿主的生殖行為(Bi and Wang, 2019)，其中胞質(zhì)不親和現(xiàn)象(cytoplasmic incompatibility, CI)是最為普遍的表型(LePage and Bordenstein, 2013; Pance, 2018; Conteetal., 2019)。Wolbachia介導(dǎo)CI的機(jī)理研究一直是學(xué)術(shù)熱點，在細(xì)胞學(xué)水平對該過程有了較為清晰的描述(Tram and Sullivan, 2002)。而Werren(1997)和Bourtzis等(1998)提出的Wolbachia誘導(dǎo)CI的“修飾”和“拯救”機(jī)制，得到了廣泛的認(rèn)同和接受。該理論認(rèn)為精巢中的Wolbachia能夠修飾父本的精細(xì)胞，使其不能和卵細(xì)胞正常融合，但是當(dāng)母本感染相同的Wolbachia時，就能夠?qū)ⅰ靶揎棥边^的精子細(xì)胞“拯救”過來，使其恢復(fù)與卵細(xì)胞的正常融合(LePage and Bordenstein, 2013; 張艷凱等, 2015)?；谏鲜隼碚摶A(chǔ)，針對CI分子機(jī)制的研究多采用組學(xué)技術(shù)手段對攜帶和不攜帶Wolbachia的精巢和精子進(jìn)行比對研究以探索潛在的分子機(jī)制。Zheng等(2011)使用基因芯片技術(shù)比較了感染與不感染W(wǎng)olbachia的雄性黑腹果蠅Drosophilamelanogaster精巢中基因表達(dá)差異，發(fā)現(xiàn)了296個差異表達(dá)基因，這些基因主要參與宿主的生殖、新陳代謝及免疫等過程；Zhang等(2015)通過對感染和不感染W(wǎng)olbachia的二斑葉螨Tetranychusurticae轉(zhuǎn)錄組分析，發(fā)現(xiàn)Wolbachia主要影響了宿主氧化還原過程、消化及解毒過程、脂質(zhì)運載蛋白通路的基因表達(dá)。根據(jù)現(xiàn)有的研究可知Wolbachia介導(dǎo)CI作用機(jī)制修飾與拯救理論十分復(fù)雜，受多種因子的影響，進(jìn)一步表明關(guān)于該理論的分子機(jī)理仍不清楚，還需要進(jìn)一步在更多宿主中去探索和驗證。

小茶尺蠖Ectropisobliqua和灰茶尺蠖E.grisescens是我國茶園最為重要的食葉類茶樹害蟲，發(fā)生嚴(yán)重時可將整片茶園全部吃光，給茶葉的生產(chǎn)帶來嚴(yán)重影響(Wangetal., 2019; Panetal., 2021)。前期研究表明，兩種茶尺蠖是一對近緣種茶樹害蟲，均隸屬鱗翅目(Lepidoptera)尺蛾科(Geometridae)埃尺蛾屬Ectropis，二者食性相同，外形極為相近，COI基因遺傳距離的差異在3.2%～4.0%，生產(chǎn)上常被混淆(姜楠等, 2014)。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，兩近緣種在生物學(xué)特征(白家赫等, 2018a)、對茶尺蠖病毒敏感性(李紅等, 2020)、性信息素成份和體內(nèi)共生菌群落組成等方面存在明顯差異(Maetal., 2016; Luoetal., 2017; Wangetal., 2020)，且具有相對獨立的地理分布?；也璩唧斗植紖^(qū)域更加廣泛，幾乎遍布我國各大茶葉生產(chǎn)區(qū)域；小茶尺蠖在我國主要分布于江蘇、浙江、安徽三省部分茶葉生產(chǎn)區(qū)域，二者在江蘇、浙江、安徽三省交叉地帶混合發(fā)生(席羽等, 2014; 白家赫等, 2018b; Wangetal., 2019)。上述的分布特征也預(yù)示著區(qū)域性的同域混發(fā)可能導(dǎo)致了自然交配和種群競爭的存在，這樣的假設(shè)在室內(nèi)試驗中也得到了驗證。小茶尺蠖和灰茶尺蠖可以交配產(chǎn)卵但雜交后代無法續(xù)代，二者依然存在生殖隔離現(xiàn)象(Zhangetal., 2014, 2016; Wangetal., 2019)。前期的研究顯示，野生種群灰茶尺蠖攜帶Wolbachia而小茶尺蠖不攜帶(Wangetal., 2020)，這一現(xiàn)象滿足了Wolbachia介導(dǎo)CI的前提條件。同時，茶尺蠖兩近緣種表現(xiàn)出的生殖隔離現(xiàn)象與共生菌Wolbachia調(diào)控宿主生殖方式相吻合，那么Wolbachia是否能夠通過CI作用介導(dǎo)茶尺蠖兩近緣種間的生殖隔離？是值得探索的科學(xué)問題。針對上述科學(xué)問題需要以Wolbachia作為單因素控制條件驗證Wolbachia在茶尺蠖兩近緣種間的生殖隔離的功能，對于自然攜帶Wolbachia的灰茶尺蠖而言，建立不攜帶Wolbachia的灰茶尺蠖種群就顯得尤為重要。因此，我們參照相關(guān)文獻(xiàn)(謝蓉蓉等, 2013)，采用四環(huán)素喂飼方法處理灰茶尺蠖，進(jìn)而獲得不攜帶Wolbachia的灰茶尺蠖種群(王志博等, 2021)，這為開展Wolbachia與茶尺蠖兩近緣種間的相關(guān)研究奠定了基礎(chǔ)。

本研究利用攜帶和不攜帶Wolbachia的灰茶尺蠖分別與小茶尺蠖進(jìn)行雜交試驗，明確Wolbachia是否介導(dǎo)了兩近緣種茶尺蠖種間的生殖隔離，進(jìn)一步采用iTRAQ技術(shù)檢測分析了攜帶和不攜帶Wolbachia灰茶尺蠖精子蛋白的差異，以期闡明Wolbachia介導(dǎo)茶尺蠖兩近緣種間CI的分子機(jī)制。這對于揭示物種分化和進(jìn)化具有重要的科學(xué)意義，同時也將為采用遺傳防治和基因工程手段防治茶尺蠖提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試蟲來源

小茶尺蠖采自浙江杭州市余杭(30.39°N, 119.90°E)，灰茶尺蠖采自江蘇省揚州市儀征青峰生態(tài)農(nóng)業(yè)有限公司茶園基地(32.33°N, 119.06°E)。人工野外采集茶尺蠖幼蟲后帶回實驗室飼養(yǎng)。飼養(yǎng)條件：溫度控制在(25±1)℃，光周期設(shè)置為13L∶11D，相對濕度保持在75%～80%。每天采摘新鮮茶樹嫩葉(迎霜品種)飼喂尺蠖幼蟲直至化蛹。在解剖鏡下將蛹按雌雄分開置于養(yǎng)蟲瓶中，待成蟲羽化后，隨機(jī)挑選雌雄成蟲各2對置于500 mL養(yǎng)蟲瓶中配對，同時在養(yǎng)蟲瓶中放入2個產(chǎn)卵條及一片新鮮茶葉便于保濕(白家赫等, 2018)。本研究所用不同種群實驗材料均在上述相同條件下飼養(yǎng)以保持一致性。

1.2 不攜帶Wolbachia灰茶尺蠖種群建立

1.2.1灰茶尺蠖Wolbachia去除：配制質(zhì)量濃度為2.5 mg/mL四環(huán)素(麥克林公司, 上海)溶液對新鮮茶樹葉片進(jìn)行浸液處理1 min。四環(huán)素處理過的葉片置于溫度25℃、相對濕度為50%～60%條件下進(jìn)行攤晾，待葉片表面溶液完全干后，取適量處理過的茶葉對灰茶尺蠖幼蟲進(jìn)行喂食。連續(xù)飼喂四環(huán)素處理茶葉3個世代后，對羽化2日齡的成蟲隨機(jī)取樣進(jìn)行Wolbachia檢測(王志博等, 2021)。

1.2.2Wolbachia去除效果檢測：使用血液/組織DNA提取試劑盒(天根生物技術(shù)有限公司, 北京)提取樣品DNA。將樣品成蟲翅用剪刀除去，剩余部分裝入2 mL的滅菌EP管中并加入1粒4 mm的滅菌鋼珠，置于震蕩研磨器上研磨2 min。待樣品研磨完成后按照試劑盒操作手冊逐步提取樣品DNA，并保存于-20℃冰箱中備用。使用Wolbachia的特異性引物(wsp_F1：5′-GTCCAATARSTGATGARGAA AC-3′；wsp_R1：5′-CYGCACCAAYAGYRCTRTAAA-3′)擴(kuò)增wsp基因進(jìn)行Wolbachia去除效果檢測。擴(kuò)增條件：95℃預(yù)變性3 min； 95℃變性1 min， 59℃退火1 min， 72℃延伸90 s， 35個循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用2%的瓊脂糖凝膠檢測(王志博等, 2021)。

1.3 遺傳雜交實驗

挑選羽化1日齡的兩種茶尺蠖成蟲進(jìn)行配對。每個養(yǎng)蟲瓶放置1對成蟲、1個產(chǎn)卵條和1片茶樹老葉，每天更換新鮮的茶樹老葉以保持瓶內(nèi)濕度，并為每個養(yǎng)蟲瓶標(biāo)注交配組合基本信息(交配親本種類、配對日期及編號)，每個交配組合30對重復(fù)。配對3 d后將成蟲取出，后續(xù)每天檢查養(yǎng)蟲瓶內(nèi)是否有卵孵化，每個交配組合隨機(jī)選取5個孵化個體對產(chǎn)卵量和孵化率進(jìn)行統(tǒng)計分析。交配組合如下(表1)：①自交GG組合：灰茶尺蠖♀×灰茶尺蠖♂；②自交OO組合：小茶尺蠖♀×小茶尺蠖♂；③正交GO組合：灰茶尺蠖♀×小茶尺蠖♂；④反交OG組合：小茶尺蠖♀×灰茶尺蠖♂；⑤試驗反交OS組合：小茶尺蠖♀×灰茶尺蠖♂(不攜帶Wolbachia);⑥試驗正交SO組合：灰茶尺蠖♀(不攜帶Wolbachia)×小茶尺蠖♂。

1.4 精子蛋白差異分析

1.4.1蛋白提?。航馄视鸹?日齡雄蟲取精囊(30頭為一混樣)置于1.5 mL EP管中液氮冷凍處理后-80℃保存?zhèn)溆茫拷M處理3個重復(fù)。樣品中加入PASP蛋白裂解液(100 mmol/L碳酸氫銨、8 mol/L尿素, pH 8)，置于冰上超聲裂解處理5 min，離心取上清液。上清液中加入10 mmol/L DTT 56℃水浴處理1 h，再加入碘乙酰胺，室溫避光條件反應(yīng)1 h后加入4倍體的丙酮于-20℃條件下沉淀至少2 h，于4℃ 12 000 g離心15 min，收集沉淀，待充分干燥后加入適量蛋白溶解液(8 mol/L尿素, 100 mmol/L TEAB, pH 8.5)溶解蛋白沉淀(Gilletteetal., 2020)。

1.4.2蛋白檢測：蛋白檢測使用Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒。首先按照說明書配制濃度梯度范圍為0～0.5 μg/μL的BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液，分別取不同濃度梯度的BSA標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液及不同稀釋倍數(shù)的待測樣品溶液加入96孔板中，補足體積至20 μL，每個梯度重復(fù)3次。使用G250染色液染色處理5 min，測定595 nm吸光度，并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線、計算待測樣品的蛋白濃度。各取20 μg蛋白待測樣品進(jìn)行12% SDS-PAGE凝膠電泳，其中濃縮膠電泳和離膠電泳條件分別為80 V 20 min和120 V 90 min。電泳結(jié)束后進(jìn)行考馬斯亮藍(lán)R-250染色，脫色至條帶清晰(葛晨玲等, 2019)。

1.4.3蛋白酶切及標(biāo)記：取蛋白樣品加入DB蛋白溶解液補足體積至100 μL，加入100 mmol/L TEAB緩沖液和胰酶，混勻后于37℃酶切4 h，再加入胰酶和CaCl2酶切過夜。加入甲酸調(diào)節(jié)pH小于3，混勻后于室溫、離心取上清緩慢通過C18除鹽柱，使用清洗液(0.1%甲酸和3%乙腈)連續(xù)清洗3次，再加入適量洗脫液(0.1%甲酸和70%乙腈)收集濾液，凍干。加入20 μL 1 mol/L TEAB緩沖液復(fù)溶，并加入足量iTRAQ標(biāo)記試劑(溶于異丙醇)，室溫下顛倒混勻反應(yīng)2 h。之后加入100 μL 50 mmol/L Tris-HCl(pH 8)終止反應(yīng)，取等體積標(biāo)記后的樣品混和，除鹽后凍干(馬曉聰?shù)? 2019)。

1.4.4肽段組分分離：混和后的標(biāo)記肽段通過Waters BEH C18柱經(jīng)L-3000 HPLC系統(tǒng)分離，使用流動相液進(jìn)行梯度洗脫分離，收集肽段流出組分進(jìn)行組分質(zhì)譜鑒定(馬曉聰?shù)? 2019)。

1.4.5肽段質(zhì)譜鑒定：樣品采用液質(zhì)聯(lián)用進(jìn)行檢測，每個餾分上樣量以信號達(dá)到1×1010為準(zhǔn)，液相使用EASY-nLCTM1200納升級UHPLC系統(tǒng)。質(zhì)譜系統(tǒng)使用Q ExactiveTMHF-X質(zhì)譜儀，Nanospray FlexTM(ESI)離子源設(shè)定離子噴霧電壓為2.1 kV，離子傳輸管溫度為320℃，質(zhì)譜采用數(shù)據(jù)依賴型采集模式。

1.4.6質(zhì)譜分析與數(shù)據(jù)處理：采用Proteome Discoverer 2.2(PD2.2, Thermo)軟件基于Uniprot蛋白數(shù)據(jù)庫分別搜索每個run的結(jié)果譜圖，篩選可信度在99%以上的譜肽(peptide spectrum matches, PSMs)為可信PSMs，進(jìn)一步通過FDR驗證獲得高度可信的結(jié)果(葛晨玲等, 2019)。

1.4.7生物信息學(xué)分析：采用PD 2.2軟件進(jìn)行蛋白差異分析，將每個蛋白在比較樣品對中的所有生物重復(fù)定量值的均值的比值作為差異倍數(shù)(fold change, FC)，以差異倍數(shù)大于1.2倍(FC≥1.2篩選上調(diào)蛋白，F(xiàn)C≤0.83篩選下調(diào)蛋白)且P值≤0.05作為標(biāo)準(zhǔn)篩選差異蛋白。使用interproscan軟件參照數(shù)據(jù)GO數(shù)據(jù)庫(http:∥amigo.geneontology.org/amigo)進(jìn)行GO功能蛋白家族分析，分別從分子功能、細(xì)胞組成和生物學(xué)過程對差異蛋白進(jìn)行描述。并通過參考KEGG數(shù)據(jù)庫(http:∥www.genome.jp/kegg/)進(jìn)行KEGG通路分析，確定蛋白質(zhì)參與的最主要的生化代謝通路和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

1.5 數(shù)據(jù)分析

實驗數(shù)據(jù)使用EXCEL軟件進(jìn)行錄入，使用SPSS 16.0軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行處理和分析。使用T檢驗對差異蛋白結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計分析。使用單因素方差分析(one-way ANOVA)，并用Tukey氏檢驗法對雜交實驗結(jié)果進(jìn)行顯著性分析，P<0.05即認(rèn)為有顯著性差異。 統(tǒng)計結(jié)果均為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤(SE)，同列內(nèi)具有相同字母的表示相互間差異不顯著。

2 結(jié)果

2.1 不攜帶Wolbachia灰茶尺蠖種群建立

使用四環(huán)素連續(xù)處理灰茶尺蠖3個世代后，隨機(jī)挑選四環(huán)素處理組、未經(jīng)四環(huán)素處理的灰茶尺蠖對照組以及茶尺蠖組樣品各8頭，基于wsp分子標(biāo)記檢測其Wolbachia攜帶情況，同時以COI基因作為內(nèi)參對照，結(jié)果顯示，未經(jīng)四環(huán)素處理灰茶尺蠖組均檢測出條帶而四環(huán)素處理組和茶尺蠖組均沒有條帶(圖1)，表明使用四環(huán)素處理灰茶尺蠖已成功建立了不攜帶Wolbachia的灰茶尺蠖種群。進(jìn)一步，通過室內(nèi)連續(xù)多代飼養(yǎng)顯示該種群依然能穩(wěn)定正常繁殖繼代。

圖1 四環(huán)素處理灰茶尺蠖去除Wolbachia效果檢測

2.2 遺傳雜交實驗

選取攜帶與不攜帶Wolbachia灰茶尺蠖與小茶尺蠖進(jìn)行種間雜交試驗并以種內(nèi)自交作為對照。結(jié)果顯示自然種群茶尺蠖兩近緣種正交和反交均能交配，并且兩種雜交組合均有部分卵能夠孵化成幼蟲(表1)。自交組合GG和OO及雜交組合GO和OG卵孵化率分別為89.65%，91.88%，79.17%和3.92%。雜交組合卵孵化率低于自交對照組，但正交組合GO與對照組并未呈現(xiàn)顯著差異(P>0.05)；而反交OG組合卵孵化率與正交GO組合及自交對照組相比均呈現(xiàn)顯著降低(P<0.05)。不攜帶Wolbachia的灰茶尺蠖種群與小茶尺蠖進(jìn)行雜交試驗結(jié)果顯示，灰茶尺蠖♂去除掉Wolbachia后與小茶尺蠖♀雜交，卵孵化率達(dá)到56.20%，與自然種群雜交的卵孵化率3.92%存在極顯著差異(P<0.01)；而灰茶尺蠖♀去除掉Wolbachia后與小茶尺蠖♂雜交，卵孵化率為67.21%，與自然種群雜交的卵孵化率差異不顯著(P>0.05)。結(jié)果表明，Wolbachia能夠?qū)Σ璩唧秲山壏N雜交卵孵化率起到調(diào)控作用(圖2)。進(jìn)一步分析表明，Wolbachia對茶尺蠖兩近緣種雜交卵的調(diào)控作用與胞質(zhì)不親和現(xiàn)象一致，主要體現(xiàn)在攜帶了Wolbachia的灰茶尺蠖♂與不攜帶Wolbachia小茶尺蠖♀雜交卵孵化異常，而攜帶Wolbachia的灰茶尺蠖♀與不攜帶Wolbachia小茶尺蠖♂雜交卵孵化正常，二者間的胞質(zhì)不親和現(xiàn)象屬于單向不親和類型(Dobzhansky, 1970)(圖3)。

表1 茶尺蠖兩近緣種雜交卵孵化率

圖2 Wolbachia調(diào)控茶尺蠖兩近緣種雜交卵孵化率

圖3 Wolbachia介導(dǎo)茶尺蠖兩近緣種胞質(zhì)不親和示意圖

2.3 灰茶尺蠖精子蛋白定量分析

灰茶尺蠖四環(huán)素處理組和灰茶尺蠖對照組提取的精子蛋白進(jìn)行了質(zhì)量檢測，蛋白濃度分別為4.88和3.92 μg/μL，電泳條帶清晰，符合質(zhì)譜分析要求。進(jìn)一步采用Q Exactive TM HF-X質(zhì)譜儀分析獲得的原始數(shù)據(jù)經(jīng)Proteome Discoverer 2.2軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)庫檢索，譜肽、蛋白定量。本研究共鑒定到612 823個二級譜圖數(shù)，其中有效譜圖67 752個，鑒定到肽段數(shù)量28 849個，鑒定到蛋白數(shù)量5 177種，其中可定量蛋白5 172種。質(zhì)譜數(shù)據(jù)質(zhì)控結(jié)果顯示，離子峰均一集中，雜質(zhì)干擾較少(圖4: A)，肽段長度主要集中在8～16肽(圖4: B)，分離出的蛋白相對分子質(zhì)量主要集中在10～30 kDa。綜上所述，樣品成分均一、 可信度高。測定的精子蛋白組數(shù)據(jù)已上傳ProteomeXchange數(shù)據(jù)庫中(http:∥proteomecentral.proteomexchange.org)，對應(yīng)的上傳序號為PXD029622。

2.4 攜帶和不攜帶Wolbachia的灰茶尺蠖精子蛋白差異分析

灰茶尺蠖四環(huán)素處理組和灰茶尺蠖正常飼養(yǎng)對照組(每個組3個重復(fù))共6個樣品，經(jīng)iTRAQ標(biāo)記串聯(lián)質(zhì)譜分析后，基于每個樣品分析得到的蛋白定量數(shù)據(jù)進(jìn)行樣品相似度分析，結(jié)果顯示，兩個組別分布相對獨立，其中，四環(huán)素處理組3個樣品相對對照組具有更高的相似度，均分布于第3象限；對照組3個樣品分布于1, 2和4象限，說明二者蛋白組成具有較為明顯的差異(圖4: C)。兩個組別共同鑒定到的蛋白共5 172個，對照組與四環(huán)素處理組相比具有顯著差異表達(dá)蛋白共128個(圖4: D)，其中顯著上調(diào)蛋白94個，涉及功能包括促生型細(xì)胞因子、保幼激素相關(guān)蛋白和抗菌活性蛋白等；顯著下調(diào)蛋白34個，涉及功能包括抗菌及解毒相關(guān)蛋白等。

圖4 灰茶尺蠖精子蛋白數(shù)據(jù)質(zhì)量檢測分析

2.5 攜帶和不攜帶Wolbachia的灰茶尺蠖精子差異蛋白的GO功能注釋分析

通過GO數(shù)據(jù)比對分析，本研究差異蛋白共得到85個功能注釋，其中分子功能(molecular function)占44.71%(38/85)，細(xì)胞組分(cellular component)占14.12%(12/85)，生物學(xué)過程(biological process)占41.1%(35/85)(圖5)。分子功能方面，差異蛋白主要參與水解酶活性(hydrolase activity)、肽酶活性(peptidase activity)、鋅離子結(jié)合(zinc ion binding)等生物過程。在細(xì)胞組分方面，這些蛋白主要位于胞外區(qū)(extracellular region)和細(xì)胞外液(extracellular space)區(qū)域。在生物學(xué)過程方面，差異蛋白主要參與碳水化合物代謝過程(carbohydrate metabolic process)、氨基聚糖代謝過程(aminoglycan metabolic process)和幾丁質(zhì)代謝過程(chitin metabolic process)。

圖5 攜帶和不攜帶Wolbachia的灰茶尺蠖精子中差異蛋白GO功能注釋

2.6 攜帶和不攜帶Wolbachia的灰茶尺蠖精子差異蛋白的KEGG富集分析

根據(jù)KEGG數(shù)據(jù)庫共注釋到45個差異蛋白富集到106個通路中，其中主要富集的通路為：鞘脂類代謝(sphingolipid metabolism)(4個)、唾液分泌(salivary secretion)(5個)、溶酶體(lysosome)(7個)、鞘脂信號通路(sphingolipid signaling pathway)(4個)、鞘糖脂生物合成-紅細(xì)胞和異紅細(xì)胞系列(glycosphingolipid biosynthesis-globo and isoglobo series)(2個)(圖6)。其中最顯著富集的鞘脂類代謝通路中與神經(jīng)酰胺合成直接相關(guān)的神經(jīng)酰胺酶和鞘磷酯酶顯著上調(diào)(圖7)。

圖6 攜帶和不攜帶Wolbachia的灰茶尺蠖精子中差異蛋白KEGG富集散點圖

圖7 攜帶和不攜帶Wolbachia的灰茶尺蠖精子中差異蛋白的鞘脂類代謝通路分析

3 討論與結(jié)論

本研究通過對灰茶尺蠖體內(nèi)Wolbachia共生菌控制條件下的遺傳雜交實驗，明確了Wolbachia具有調(diào)控茶尺蠖兩近緣種雜交卵孵化的作用，這種生殖調(diào)控機(jī)制源于Wolbachia介導(dǎo)的CI作用(Sicardetal., 2014)。Wolbachia介導(dǎo)的CI作用一直以來都是關(guān)注的熱點，其最為熟知的應(yīng)用案例是CI導(dǎo)致的胚胎不育，通過釋放感染W(wǎng)olbachia雄蚊到未感染W(wǎng)olbachia的種群造成雌性不育，實現(xiàn)了利用Wolbachia對蚊媒病的防治，從而阻止登革熱和寨卡病毒的傳播(Fordetal., 2019; Sicardetal., 2019)。利用Wolbachia介導(dǎo)CI作用這一機(jī)制可以實現(xiàn)對害蟲種群的控制，但單從Wolbachia和宿主二者互作的角度，Wolbachia是利用CI機(jī)制實現(xiàn)了自我生存，同時也有利于宿主種群的生存和拓殖，這在一定程度上加速了宿主的種群分化，甚至能促進(jìn)新物種的形成(Sioziosetal., 2018; Chenetal., 2019; Shropshireetal., 2020)。目前，針對Wolbachia介導(dǎo)物種生殖隔離的研究，多數(shù)集中在具有Wolbachia差異的不同地理種群的同一物種，這是物種分化過程中的初期階段。本研究選擇了具有Wolbachia差異的兩個近緣種茶尺蠖開展研究，證明了在物種分化后Wolbachia介導(dǎo)CI作用在二者間依然存在，這一結(jié)果為Wolbachia可能參與茶尺蠖兩近緣種物種形成提供了參考和依據(jù)。

在明確了Wolbachia能夠通過CI作用實現(xiàn)對雜交卵孵化調(diào)控的同時，本研究基于目前公認(rèn)的“修飾”和“拯救”理論進(jìn)一步對Wolbachia介導(dǎo)CI的機(jī)制進(jìn)行了研究。通過蛋白組學(xué)技術(shù)對攜帶和不攜帶Wolbachia灰茶尺蠖精子蛋白進(jìn)行了比較分析，明確了Wolbachia對灰茶尺蠖精子蛋白具有修飾作用，二者蛋白組成呈現(xiàn)顯著差異。進(jìn)一步通過GO分析顯示，在分子功能方面差異蛋白主要參與水解酶活性、鋅離子結(jié)合等過程；生物學(xué)過程方面，差異蛋白主要參與碳水化合物代謝過程、氨基聚糖代謝過程和幾丁質(zhì)代謝過程等過程(圖5)，這表明Wolbachia對精子的修飾可能對其能量供應(yīng)方面起到了重要的作用從而影響到了精子活性及精子細(xì)胞形態(tài)的構(gòu)成(楊月紅和奚耕思, 1999; 葛晨玲等, 2019)。前期關(guān)于Wolbachia介導(dǎo)CI機(jī)制的相關(guān)研究表明，組蛋白基因Hira、編碼錨定蛋白ANK基因等可能參與CI調(diào)控過程并涉及到生殖、新陳代謝及免疫等通路(Zhengetal., 2011; Zhangetal., 2015)。但在本研究中KEGG分析結(jié)果顯示，差異蛋白主要富集在與鞘脂類相關(guān)通路中，其中鞘脂類代謝通路中4個差異蛋白也同時富集在了鞘脂信號通路中(圖6)，說明鞘脂類通路可能參與了Wolbachia介導(dǎo)CI機(jī)制。進(jìn)一步對顯著富集的鞘脂類代謝通路分析發(fā)現(xiàn)，與神經(jīng)酰胺合成直接相關(guān)的兩個酶(神經(jīng)酰胺酶和鞘磷酯酶)顯著上調(diào)(圖7)，這表明Wolbachia可能對神經(jīng)酰胺具有調(diào)控作用。神經(jīng)酰胺是一類重要的鞘脂類物質(zhì)，處于整個鞘脂類代謝通路的核心位置，是各種復(fù)雜鞘脂類的前體，也是細(xì)胞膜的重要組成成分(Chaurasia and Summers, 2021)?，F(xiàn)有的研究顯示神經(jīng)酰胺作為第二信使具有調(diào)控昆蟲卵孵化的功能。例如果蠅中神經(jīng)酰胺酶在生殖系統(tǒng)中表達(dá)量最高，中性神經(jīng)酰胺酶的缺失會導(dǎo)致胚胎的死亡(Yuanetal., 2011)；灰飛虱中性鞘磷脂酶在雌蟲卵巢和雄蟲精巢中表達(dá)最高，說明中性鞘磷脂酶對灰飛虱生殖系統(tǒng)的發(fā)育有重要的作用(Zhouetal., 2013)。褐飛虱中沉默了神經(jīng)酰胺酶基因會導(dǎo)致神經(jīng)酰胺物質(zhì)升高，進(jìn)而誘導(dǎo)卵巢發(fā)生細(xì)胞凋亡，出現(xiàn)產(chǎn)卵量降低，卵孵化率降低等現(xiàn)象；而沉默了神經(jīng)酰胺合成酶基因，會引起神經(jīng)酰胺物質(zhì)含量降低，也會抑制褐飛虱卵巢生長發(fā)育(Shietal., 2018)。由此可見，神經(jīng)酰胺類物質(zhì)在生物體生殖系統(tǒng)中大量富集并具有調(diào)節(jié)生物體的生殖功能。而Wolbachia介導(dǎo)CI現(xiàn)象的主要表型也是胚胎致死，直接體現(xiàn)的現(xiàn)象是卵孵化率降低(Biwotetal., 2020)，與神經(jīng)酰胺的調(diào)控作用表現(xiàn)出相似的現(xiàn)象。這表明Wolbachia可能通過對神經(jīng)酰胺類物質(zhì)的調(diào)控介導(dǎo)了茶尺蠖兩近緣種間的生殖隔離，其作用機(jī)制值得后續(xù)作進(jìn)一步的深入研究。

本研究以去除Wolbachia灰茶尺蠖種群、自然攜帶Wolbachia灰茶尺蠖種群與不攜帶Wolbachia的小茶尺蠖種群作為研究材料開展了種群間的雜交試驗，結(jié)果表明去除Wolbachia灰茶尺蠖與小茶尺蠖雜交卵孵化率顯著提升，明確了Wolbachia通過胞質(zhì)不親和作用調(diào)控了茶尺蠖兩近緣種雜交卵的孵化。進(jìn)一步對攜帶和不攜帶Wolbachia灰茶尺蠖精子蛋白分析顯示，二者精子蛋白存在顯著差異，差異蛋白主要富集在與鞘脂類相關(guān)通路中，其中與神經(jīng)酰胺合成相關(guān)的神經(jīng)酰胺酶和磷酸酯酶的顯著上調(diào)。本研究為深入開展Wolbachia介導(dǎo)茶尺蠖兩近緣種生殖隔離機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。