漢灘病毒糖蛋白免疫反應(yīng)性表位研究進(jìn)展

孫報(bào)增，秦聰聰，康文龍，陳隆宇，謝明陽，毛自蕊，姜東伯，楊 琨

1 概 述

漢坦病毒（Hantaviruses, HV）是屬于布尼亞病毒科正漢坦病毒屬的負(fù)性RNA病毒，同時(shí)分為新、舊世界HV，前者包括引起腎綜合征出血熱（hemorrhagic fever with renal syndrome, HFRS（又稱流行性出血熱）的漢灘病毒（Hantaan virus,HTNV）、首爾病毒（Seoul virus, SEOV）、多布拉瓦-貝爾格萊德病毒、普馬拉病毒（Puumala virus, PUUV）; 后者包括引起漢坦病毒肺綜合征（Hantavirus pulmonary syndrome, HPS）的安第斯病毒和辛諾伯病毒[1]。HFRS的主要臨床特征是腎功能障礙和出血，而HPS的特征是急性呼吸衰竭。在中國，HFRS仍然被認(rèn)為是嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題，每年約有20 000～50 000例患者，病死率約為3%～10%[2]。

HTNV基因組由3個(gè)負(fù)鏈RNA片段組成：大（L）、中（M）和?。⊿）片段，分別編碼依賴RNA的RNA聚合酶、包膜糖蛋白（glycoprotein,GP）和核衣殼蛋白[3]。漢坦病毒GP是一個(gè)保守序列，宿主蛋白酶切割該序列產(chǎn)生N-末端糖蛋白（glycoprotein N-terminal, Gn）和C-末端糖蛋白（glycoproteinC-terminal, Gc）[4]，而Gn和Gc已被證明是保護(hù)性中和抗體反應(yīng)的主要靶標(biāo)[5]。HTNV滅活疫苗存在免疫反應(yīng)不理想、保護(hù)作用不足等問題，甚至可能引起各種安全問題[6]。如今，研究更多基于HTNV GP的免疫反應(yīng)性，借此來設(shè)計(jì)出強(qiáng)保護(hù)效力的新型HTNV疫苗。

表位是存在于抗原表面的、決定抗原特異性的特殊性結(jié)構(gòu)的化學(xué)基團(tuán)，又稱為抗原決定簇?？乖ㄟ^抗原表位與相應(yīng)淋巴細(xì)胞表面抗原受體結(jié)合，從而激活淋巴細(xì)胞，引起免疫應(yīng)答。因此，表位是被免疫細(xì)胞識(shí)別的靶結(jié)構(gòu)，也是免疫反應(yīng)特異性的基礎(chǔ)，其數(shù)量、性質(zhì)和空間構(gòu)型決定著抗原的特異性。近年來，國內(nèi)外學(xué)者發(fā)現(xiàn)了HTNV GP上表位的重要性，對(duì)其展開了充分且有意義的研究。在此，本文對(duì)近年來國內(nèi)外關(guān)于HTNV GP表位的研究進(jìn)展進(jìn)行簡(jiǎn)要總結(jié)。

2 HTNV GP優(yōu)勢(shì)表位的研究方法

2.1 通過鑒定T細(xì)胞抗原表位多肽活性來篩選表位 近年來，為了篩選鑒定HTNV GP上的T細(xì)胞表位，常用酶聯(lián)免疫斑點(diǎn)試驗(yàn)（enzyme linked immunospot assay, ELISpot）來檢測(cè)T細(xì)胞表位多肽活性，從而確定活性較高的表位即優(yōu)勢(shì)表位。ELISpot可以在單細(xì)胞水平對(duì)抗體分泌細(xì)胞（antibody secreting cell, ASC）及細(xì)胞因子（cytokines, CK）分泌細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，是細(xì)胞免疫學(xué)研究中高敏感性的檢測(cè)方法，可以從20萬～30萬細(xì)胞中檢岀1個(gè)分泌該蛋白的細(xì)胞。同時(shí)，該方法能夠?qū)乖碳ず蟮幕罴?xì)胞進(jìn)行功能性檢測(cè)。因其具有較髙的特異性、直觀可信度，并且易操作，所以被廣泛用于CK分泌細(xì)胞檢測(cè)或ASC測(cè)定中，在國際學(xué)術(shù)界也獲得了廣泛的認(rèn)可[7]。Ma等[8]將HTNV GP上全部氨基酸序列合成281個(gè)表位，并且根據(jù)順序分成28個(gè)肽庫，用來刺激HFRS患者的外周血單個(gè)核細(xì)胞，然后對(duì)高活性肽庫中15肽表位進(jìn)行單個(gè)表位的ELISpot分析，進(jìn)一步篩選出20個(gè)免疫表位，即優(yōu)勢(shì)表位。Jiang等[9-11]通過ELISpot對(duì)其新型靶向DNA疫苗細(xì)胞保護(hù)性免疫效力進(jìn)行評(píng)價(jià)，同時(shí)鑒定出aa470-484 等多個(gè)9肽和15肽表位為優(yōu)勢(shì)表位。

另一方面，對(duì)于免疫信息法篩選得出的表位，同樣可以鑒定其多肽活性來進(jìn)行實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。Sun等[12]及Tang等[13]使用ELISpot對(duì)預(yù)測(cè)的優(yōu)勢(shì)表位進(jìn)行了驗(yàn)證，證明了方法的可靠性以及細(xì)胞免疫反應(yīng)性表位的有效性。Ma等[14]通過對(duì)不同表位肽疫苗組進(jìn)行ELISpot來鑒定表位肽作為疫苗的有效性。

2.2 應(yīng)用免疫信息學(xué)預(yù)測(cè)法來篩選T細(xì)胞表位 由于生物信息學(xué)的飛速發(fā)展，其在免疫表位上的應(yīng)用研究更多的被開發(fā)出來。T細(xì)胞表位的預(yù)測(cè)研究始于對(duì)輔助性T細(xì)胞（helper T cell, Th）表位的預(yù)測(cè)，但對(duì)細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞（cytotoxic T lymphocyte, CTL）表位預(yù)測(cè)的探索進(jìn)展最快，研究最深入，預(yù)測(cè)最成功[15]。

目前，對(duì)Th表位和CTL表位親和力的預(yù)測(cè)，均有多個(gè)預(yù)測(cè)網(wǎng)站根據(jù)不同算法對(duì)HTNV GP表位的親和力進(jìn)行預(yù)測(cè)評(píng)估。其中，CTL表位的預(yù)測(cè)多使用IEDB-recommended[16]（http://tools.iedb.org/mhci/）、SMMPMBEC[17]（http://tools.immuneepitope.org/mhci/）、NetMHCpan4.1[18]（http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/）、SYFPEITHI[19]（http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm） 以 及Rankpep[20-21]（http://imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.html）等預(yù)測(cè)網(wǎng)站進(jìn)行親和力分析；Th表位的親和力預(yù)測(cè)多使用IEDB[16]（http://tools.iedb.org/mhcii/）、NetMHCIIpan3.2[22]（https://services.healthtech.dtu.dk/service.php?NetMHCIIpan-3.2）、SYFPEITHI[19]（http://www.syfpeithi.de/bin/MHCServer.dll/EpitopePrediction.htm） 和Rankpep[20-21]（http://imed.med.ucm.es/Tools/rankpep.html）等預(yù)測(cè)網(wǎng)站。Sun等[12]預(yù)測(cè)在高頻人群HLA基因型中GP全長(zhǎng)中9肽和15肽的免疫親和力，使用上述多個(gè)網(wǎng)站多種算法評(píng)估親和力，選擇共有的高親和力表位，從而增加親和力預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性。

然而，高親和力表位不一定具有強(qiáng)免疫原性，Vaxijen-2.0[23]（http://www.ddg-pharmfac.net/vaxijen/VaxiJen/VaxiJen.html）工具可以對(duì)腫瘤、病毒和細(xì)菌抗原進(jìn)行免疫原性的預(yù)測(cè)。通過使用該工具，篩選出一批強(qiáng)免疫原性的抗原表位。

HTNV自從被發(fā)現(xiàn)以來，在歐亞大陸的不同地區(qū)已經(jīng)發(fā)現(xiàn)眾多變異株。BLASTP （https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ Blast.cgi）工具可以對(duì)給定抗原在一定范圍內(nèi)進(jìn)行種間種內(nèi)保守性評(píng)估。ClustalX2.1工具也可以對(duì)不同毒株的糖蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，通過WebLogo對(duì)結(jié)果進(jìn)行呈現(xiàn)。Sun等[12,24]在其研究中將HTNV 76-118株與137種變異株的高親和力區(qū)段進(jìn)行比對(duì)，展現(xiàn)了部分GP表位上的高頻率突變位點(diǎn)。

通過以上免疫生物信息學(xué)的分析，最終獲得高親和力、強(qiáng)免疫原性和種間種內(nèi)保守的優(yōu)勢(shì)表位。免疫原性分析及保守性分析，成功篩選出高親和力、強(qiáng)免疫原性和種間種內(nèi)保守的HTNV GP上9肽和15肽優(yōu)勢(shì)表位[12，24]。使用該預(yù)測(cè)分析程序，能夠降低單一親和力算法所帶來的誤差，免疫原性分析使篩選出的抗原肽具有強(qiáng)免疫原性，同時(shí)保守性分析能夠使篩選的表位具有廣泛變異株適用性，從而篩選出具有廣泛地區(qū)人群適用性的HTNV GP表位。

2.3 表位肽掃描技術(shù)和噬菌體展示肽庫技術(shù)用于探索B細(xì)胞表位 上述方法在發(fā)現(xiàn)HTNV GP的T細(xì)胞表位中已得到充分使用及推廣。由于HTNV的清除依賴于細(xì)胞免疫的功能，因此過去數(shù)十年間大多數(shù)研究注重于針對(duì)T細(xì)胞表位。而體液免疫功能在長(zhǎng)期免疫中起著重要的作用[25]。因此，早期部分學(xué)者將研究方向放在B細(xì)胞表位上以探究增強(qiáng)HTNV感染后的體液免疫，從而達(dá)到對(duì)HTNV感染長(zhǎng)期免疫的效果。

表位肽掃描技術(shù)（peptide scanning technique,Pepscan）是研究B細(xì)胞表位的主要方法，利用合成肽對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行表位作圖，即已知蛋白質(zhì)抗原分子的基因序列，合成或表達(dá)連續(xù)的重疊短肽，通過與相應(yīng)的單克隆抗體（單抗）或多克隆抗體（多抗）反應(yīng)，分析檢測(cè)結(jié)果以確定相應(yīng)的抗原表位[26]。Yan等[27]使用Pepscan方法繪制了3D8單克隆抗體識(shí)別的GP表位，并且通過競(jìng)爭(zhēng)性ELISA方法進(jìn)一步證實(shí)了與3D8單克隆抗體結(jié)合的特異性。

早期研究還使用噬菌體展示肽庫技術(shù)來研究HTNV GP 中表位的體液免疫反應(yīng)。其基本原理是將外源蛋白或多肽的基因與噬菌體外殼蛋白基因融合，以融合蛋白的形式在噬菌體表面表達(dá)出多肽序列，并保持特定的空間構(gòu)象，利用特異性親和作用來篩選特異性蛋白或多肽的一項(xiàng)新技術(shù)[15]。具體過程為將單抗包被至聚乙烯平皿后，加入噬菌體展示肽庫，使其與單抗充分反應(yīng)后，洗去未結(jié)合的游離噬菌體，再用洗脫液將結(jié)合狀態(tài)的噬菌體洗脫下來。將其浸染宿主大腸桿菌進(jìn)一步擴(kuò)增后回收，再進(jìn)行下一輪篩選。通常經(jīng)過3～4輪的篩選，并且每次增加篩選強(qiáng)度，這樣就可獲得與單抗結(jié)合較緊密的噬菌體克隆。通過序列測(cè)定和分析，即能推知該噬菌體克隆所攜帶的外源短肽序列，從而確定該單抗所針對(duì)的抗原表位。該方法已得到Wang等[28]的充分驗(yàn)證，證明其能夠模擬HTNV抗原的表位，且表位的體液免疫反應(yīng)性顯著增強(qiáng)。 Xin等[29]從噬菌體展示肽庫中鑒定出HTNV GP受體結(jié)合域的寡肽3G1。Larson等[30]使用該方法鑒定出中和表位，證明其通過β3整聯(lián)蛋白抑制HTNV的進(jìn)入從而起到抗病毒作用。

2.4 肽-MHC四聚體技術(shù) 指將生物素標(biāo)記在底物肽的賴氨酸殘基上，使得一個(gè)標(biāo)記熒光素的鏈親和素與4個(gè)生物素標(biāo)記的肽-MHC復(fù)合物結(jié)合形成四聚體，肽-MHC四聚體與抗原特異性的T細(xì)胞上的T細(xì)胞受體（T cell receptor, TCR）結(jié)合后，即可以通過流式細(xì)胞儀定量檢出體內(nèi)抗原特異性CTL。這項(xiàng)技術(shù)通過對(duì)表位與T細(xì)胞特異性識(shí)別結(jié)合從而完成對(duì)表位的驗(yàn)證，具有高靈敏性、高特異性和高穩(wěn)定性等優(yōu)點(diǎn)。Tang等[13]通過預(yù)測(cè)優(yōu)勢(shì)表位后，合成表位肽-HLA-A*0201四聚體。染色結(jié)果發(fā)現(xiàn)，各表位特異性CD8+T細(xì)胞頻率在輕度HFRS患者中較高，提示HTNV感染后預(yù)測(cè)的表位可誘導(dǎo)保護(hù)性免疫反應(yīng)。

3 HTNV GP優(yōu)勢(shì)表位的應(yīng)用研究進(jìn)展

3.1 鑒定出具有細(xì)胞或體液免疫反應(yīng)性/免疫反應(yīng)性的表位 通過上述方法與研究，鑒定出一批具有強(qiáng)反應(yīng)性、T/B細(xì)胞特異性的HTNV GP優(yōu)勢(shì)表位，將T、B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位的氨基酸序列及鑒定方法進(jìn)行整理匯總，如表1和表2所示。由此發(fā)現(xiàn)關(guān)于B細(xì)胞表位的研究較T細(xì)胞少，這可能與下面幾點(diǎn)相關(guān)：①約90% B細(xì)胞表位是構(gòu)象表位，同時(shí)構(gòu)象B細(xì)胞表位不一定來自連續(xù)的肽段[31-32]；②線性B細(xì)胞表位通常引發(fā)不與天然抗原交叉反應(yīng)的抗體[32]；③ T、B細(xì)胞在發(fā)育過程中經(jīng)過V、D、J基因片段的重排從而形成TCR庫和B細(xì)胞受體（B cell receptor repertoire,BCR）庫[33]，肽-MHC的結(jié)合形成了TCR庫，個(gè)體攜帶的特定MHC等位基因組成為TCR庫多樣性的來源[34]；而B細(xì)胞必須對(duì)大量外來抗原產(chǎn)生反應(yīng)并且無TCR相似的限制性[35]，因此BCR庫進(jìn)化出相當(dāng)大的數(shù)量。

表1 B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位匯總Table 1 Summary of dominant B cell epitopes

表2 T細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位匯總Table 2 Summary of dominant T cell epitopes

續(xù)表2

用不同方法得到的優(yōu)勢(shì)表位結(jié)果存在部分氨基酸序列交叉，提示各種研究方法可互相證明其有效性。在T細(xì)胞表位研究中，生物信息學(xué)法分析表位結(jié)合ELISpot驗(yàn)證所得到的優(yōu)勢(shì)表位具有較高的可信度。同時(shí)，由于優(yōu)勢(shì)表位并不是均勻分布的，由此可以得到GP免疫反應(yīng)性熱點(diǎn)區(qū)域：B細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位GP免疫反應(yīng)性熱點(diǎn)區(qū)域?yàn)椋篴a443-466；T細(xì)胞優(yōu)勢(shì)表位GP免疫反應(yīng)性熱點(diǎn)區(qū)域?yàn)椋篴a21-39、aa145-180、aa193-211、aa257-303、aa445-484、aa622-632、aa737-765、aa781-799、aa805-851、aa933-947、aa961-979 和 aa1082-1098。每個(gè)熱點(diǎn)區(qū)域至少包含2個(gè)優(yōu)勢(shì)表位，提示對(duì)熱點(diǎn)區(qū)域進(jìn)行研究能夠更快速的分析出強(qiáng)免疫反應(yīng)性表位。

3.2 表位的保守性研究 近期有研究報(bào)道了中國不同地區(qū)HTNV的遺傳多樣性和系統(tǒng)發(fā)育特征[36-37]，并且HTNV變異株的增加和傳播受嚙齒動(dòng)物的數(shù)量和活動(dòng)影響[38-39]。而表位的保守與否直接關(guān)系著其免疫效力的發(fā)揮，引起病毒免疫反應(yīng)的保守表位可以增加保護(hù)性免疫的范圍。因此，表位特異性種間和種內(nèi)保守性研究不僅檢查其對(duì)HTNV的反應(yīng)性，還檢查了對(duì)不同種HV的交叉反應(yīng)性[24]。Sun等[24]將保守性分析納入分析優(yōu)勢(shì)表位的內(nèi)容之一，對(duì)HTNV 76-118株的GP表位種間和種內(nèi)保守情況進(jìn)行探究。發(fā)現(xiàn)9肽表位的保守性較差，而15肽表位的保守性較為良好[12]。這可能與15肽表位與MHC-II類分子結(jié)合的靈活性有關(guān)。在此基礎(chǔ)上，通過比對(duì)HTNV 147種變異株GP氨基酸序列，對(duì)高親和力區(qū)域進(jìn)行進(jìn)一步的保守性分析，推導(dǎo)出在眾多HTNV 變異株中存在高頻率變異位點(diǎn)的表位的親和力更好，提示變異使表位的免疫反應(yīng)性增強(qiáng)[12]。

3.3 種屬交叉反應(yīng)性的探究 對(duì)HTNV 研究只能在感染病例和實(shí)驗(yàn)動(dòng)物之間進(jìn)行，因此人們探究病毒抗原的種屬交叉免疫反應(yīng)性旨在尋求一種可模擬出人體免疫反應(yīng)的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物。通過對(duì)親和力數(shù)據(jù)進(jìn)行聚類分析后，有研究分別探索了15肽和9肽抗原的跨種屬交叉免疫反應(yīng)性，均發(fā)現(xiàn)Balb/c小鼠對(duì)HTNV GP的免疫親和力和人的更相近，提示缺乏人源化HLA轉(zhuǎn)基因小鼠的情況下，Balb/c小鼠可能是研究實(shí)驗(yàn)的有效替代物[12，24]。

3.4 優(yōu)勢(shì)表位 用來疫苗研究以增強(qiáng)特異性體液或細(xì)胞免疫滅活HFRS疫苗已在亞洲廣泛用于人群接種，然而，在中和抗體效價(jià)、細(xì)胞免疫應(yīng)答和長(zhǎng)效免疫記憶方面存在不足，不能完全防止人類感染HTNV[40-42]。已有研究利用所發(fā)現(xiàn)的表位進(jìn)行疫苗研究以特異性增強(qiáng)機(jī)體抗HTNV的能力。

Zhao等[43]構(gòu)建了抗HTNV、SEOV和PUUV感染的多表位嵌合DNA疫苗，該合成基因編碼了25個(gè)顯性B細(xì)胞和T細(xì)胞表位，證明可誘導(dǎo)顯著的體液免疫和細(xì)胞免疫。Ma等[44]利用表位肽直接作為疫苗，對(duì)小鼠進(jìn)行免疫后評(píng)價(jià)免疫保護(hù)效力，發(fā)現(xiàn)肽疫苗可誘導(dǎo)強(qiáng)烈的IFN-γ應(yīng)答和有效的細(xì)胞毒性T細(xì)胞應(yīng)答，證明肽免疫小鼠對(duì)HTNV的攻擊具有部分保護(hù)作用。Tang等[13]也利用發(fā)現(xiàn)的表位輔以佐劑形成疫苗，對(duì)HLA-A2.1/KbTg轉(zhuǎn)基因小鼠進(jìn)行免疫程序，成功地建立了保護(hù)性CTL應(yīng)答。上述研究有效的解決了現(xiàn)有滅活HFRS疫苗存在的問題，同時(shí)為新疫苗的研發(fā)提供了新的思路。

4 結(jié) 語

抗原表位是機(jī)體特異性免疫反應(yīng)的基礎(chǔ)，利用抗原表位來設(shè)計(jì)疫苗已被認(rèn)為是一種可行、有效且安全的策略。近年來，生物信息學(xué)策略得到充分運(yùn)用，不僅在HTNV等出血熱病毒上得到充分運(yùn)用[45-48]，對(duì)于廣泛流行的新型冠狀病毒也已有文章發(fā)表[49-52]。然而，由于機(jī)體內(nèi)免疫應(yīng)答機(jī)制的復(fù)雜性，使得鑒定的抗原表位不能完全反應(yīng)體內(nèi)的實(shí)際情況。同時(shí)，各個(gè)研究方法并沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，以及每個(gè)生物信息學(xué)算法上存在的缺陷[53]，使得獲得的優(yōu)勢(shì)表位的免疫反應(yīng)性結(jié)果還有待商榷，“新抗原的發(fā)現(xiàn)和驗(yàn)證仍然是一個(gè)令人生畏的問題”[54]；而對(duì)于優(yōu)勢(shì)表位發(fā)現(xiàn)后續(xù)的研究，似乎進(jìn)入了一個(gè)“死胡同”，并沒有將表位展開進(jìn)一步應(yīng)用?，F(xiàn)有另外多項(xiàng)新型表位研究方法在其他領(lǐng)域已得到廣泛應(yīng)用，如基于流式細(xì)胞術(shù)的細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子染色法，已應(yīng)用于SARS-CoV-2表位[55]和癌細(xì)胞表位[56]等研究。因此，建立一套行之有效的用于生物安全防護(hù)和公共衛(wèi)生領(lǐng)域的病原體表位評(píng)價(jià)體系迫在眉睫。利用各種預(yù)測(cè)評(píng)價(jià)方法獲得具有免疫反應(yīng)性的優(yōu)勢(shì)表位，可充分應(yīng)用于疫苗研制、藥品開發(fā)、臨床診斷等領(lǐng)域。相信在各個(gè)領(lǐng)域的協(xié)同配合下，HTNV GP表位終將在預(yù)防和治療漢坦病毒上發(fā)揮出巨大價(jià)值。