新型冠狀病毒肺炎無(wú)癥狀感染者的臨床與免疫學(xué)特征分析

申 川，秦 浩，馬路園，李星宇，宋枚芳，張?jiān)茲?，高?huì)霞，王 洋，戴二黑，趙彩彥

新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019, COVID-19）是由嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2型（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2）引起的一種以病毒性肺炎為突出表現(xiàn)的全身感染性疾病。截至到2022年7月26日，已導(dǎo)致全球200個(gè)以上的國(guó)家和地區(qū)超過(guò)5.6億人感染，死亡人數(shù)達(dá)637萬(wàn)人[1]，嚴(yán)重影響了全球社會(huì)經(jīng)濟(jì)活動(dòng)與人類(lèi)的生活，也造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。COVID-19的疾病譜中除包括輕型、普通型、重型、危重型患者外，還存在一部分“無(wú)癥狀”感染者。這些感染者無(wú)明顯臨床癥狀，尤其在聚集性感染病例中較為常見(jiàn)，常通過(guò)密切接觸者篩查、聚集性疫情調(diào)查、傳染源追蹤調(diào)查發(fā)現(xiàn)，極易被忽視，且作為隱匿傳染源可造成疫情廣泛傳播。本研究通過(guò)分析河北省COVID-19救治定點(diǎn)醫(yī)院（石家莊市第五醫(yī)院）2020年1月22日—6月22日期間確診的COVID-19患者的臨床資料，初步探討COVID-19無(wú)癥狀感染者的臨床特征和宿主T淋巴細(xì)胞亞群、細(xì)胞因子/趨化因子譜的特征，完善對(duì)COVID-19疾病譜及致病機(jī)理的認(rèn)識(shí)，為疫情防控提供理論依據(jù)。

1 對(duì)象與方法

1.1 對(duì)象 選取2020年1月22日—6月22日石家莊市第五醫(yī)院收治的59例COVID-19患者作為研究對(duì)象，同時(shí)選取24例健康者作為對(duì)照組。本研究通過(guò)河北醫(yī)科大學(xué)第三醫(yī)院（科2020-009-1）、石家莊市第五醫(yī)院（2020013）倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，所有研究對(duì)象均知情同意并簽屬知情同意書(shū)。

1.2 方法

1.2.1 信息收集 收集59例COVID-19患者的人口學(xué)（年齡、性別等）資料、流行病學(xué)特征、臨床表現(xiàn)、胸部CT等臨床資料。

1.2.2 納入、排除標(biāo)準(zhǔn) 納入標(biāo)準(zhǔn)：參照《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第八版）》[2]，COVID-19患者須具有流行病學(xué)史，咽或鼻拭子SARS-CoV-2核酸檢測(cè)陽(yáng)性，伴或不伴臨床表現(xiàn)、COVID-19胸部CT特征。排除標(biāo)準(zhǔn)：①疑似患者；②由其他病原體導(dǎo)致的肺部或全身感染、自身免疫性疾病、惡性腫瘤者；③無(wú)癥狀感染者應(yīng)該排除入組時(shí)尚處于潛伏期而無(wú)癥狀，但隨疾病進(jìn)展出現(xiàn)相應(yīng)臨床表現(xiàn)的輕型、普通型、重型/危重型COVID-19患者。

1.2.3 患者分組 根據(jù)《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第八版）》[2]，將59例COVID-19患者分為4組：無(wú)癥狀感染組（n=28）、輕型組（n=6）、普通型組（n=19）、重型/危重型組（n=6）。無(wú)癥狀感染：核酸檢測(cè)陽(yáng)性至核酸轉(zhuǎn)陰，自始至終不出現(xiàn)任何癥狀、體征和影像學(xué)表現(xiàn)。輕型：臨床癥狀輕微，影像學(xué)檢查未見(jiàn)COVID-19表現(xiàn)。普通型：具有發(fā)熱、呼吸道等癥狀，影像學(xué)檢查可見(jiàn)COVID-19表現(xiàn)。重型：符合以下情況之一者，①出現(xiàn)氣促，呼吸頻率≥30 次/min；②靜息狀態(tài)下，吸氣時(shí)指氧飽和度≤93%；③動(dòng)脈氧分壓（PaO2）/吸氧濃度（FiO2）≤300 mmHg；④臨床癥狀進(jìn)行性加重，胸部影像學(xué)顯示24～48 h內(nèi)病灶明顯進(jìn)展（＞50%）。危重型：符合以下情況之一者，①出現(xiàn)呼吸衰竭，且需要機(jī)械通氣；②出現(xiàn)休克；③合并其他器官功能衰竭，需ICU監(jiān)護(hù)治療。因重型、危重型患者例數(shù)較少，故將其合并為重型/危重型組。

1.2.4 標(biāo)本采集與處理 留取59例COVID-19患者EDTA-K2抗凝管靜脈血標(biāo)本用于檢測(cè)T細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)；留取59例COVID-19患者和24例健康對(duì)照者的促凝管靜脈血標(biāo)本，分離血清后，置于-80 °C冰箱保存，檢測(cè)細(xì)胞因子和趨化因子水平。首次血液標(biāo)本采集在入院48 h（治療前）內(nèi)完成，根據(jù)臨床診治需要，部分患者同時(shí)采集入院第（14±2）d（治療后）血液標(biāo)本。全部檢測(cè)均在符合生物安全要求的實(shí)驗(yàn)室完成。

1.2.5 T細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)檢測(cè) 取EDTA-K2抗凝血50 μl置于流式細(xì)胞管，加入 10 μl TriTESTCD3-PerCP/CD4-FITC/CD8-PE抗體，室溫避光溫育15 min，加入溶血素2 ml，溫育15 min后離心，PBS洗滌2次，用FACS-Canto II流式細(xì)胞儀（美國(guó)BD公司）檢測(cè)T細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)。

1.2.6 血清細(xì)胞因子和趨化因子檢測(cè) 用Procarta Plex多細(xì)胞因子檢測(cè)系統(tǒng)（美國(guó)Thermo Fisher公司）檢測(cè)血清中25種細(xì)胞因子：IFN-α、IFN-γ、TNF-α、TNF-β、IL-1α、IL-1RA、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-9、IL-10、IL-12p70、IL-13、IL-15、IL-17A、IL-18、IL-21、IL-22、IL-23、IL-27、IL-31、 粒 細(xì) 胞 -巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony stimulating factor, GM-CSF）及9種趨化因子：IL-8、干擾素誘導(dǎo)蛋白10（interferoninducible protein-10, IP-10）、嗜酸性粒細(xì)胞趨化因子（Eotaxin）、生長(zhǎng)調(diào)節(jié)致癌基因（growthrelated oncogene, GRO）-α、單核細(xì)胞趨化蛋白-1（monocyte chemotactic protein 1, MCP-1）、巨噬細(xì)胞炎性蛋白（macrophage inflammatory protein, MIP）-1α、MIP-1β、基質(zhì)細(xì)胞衍生因子（stromal cell derived factor, SDF）-1α、調(diào)節(jié)激活正常T細(xì)胞表達(dá)和分泌的趨化因子（regulated upon activation normal T-cell expressed and secreted, RANTES）的水平。具體方法為：將50 μl磁珠加入微孔板，離心棄去液體后，每孔加入25 μl緩沖液和25 μl樣品或標(biāo)準(zhǔn)品，室溫反應(yīng)60～120 min，清洗微孔板2次，加入25 μl檢測(cè)抗體混合液溫育30 min后洗滌，再加入鏈霉親和素-熒光色素偶聯(lián)物溫育30 min。采用LuminexTM200流式熒光檢測(cè)儀讀取數(shù)據(jù)。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 26.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)數(shù)資料以例數(shù)（%）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。呈正態(tài)分布的計(jì)量資料以±s 表示，呈偏態(tài)分布的計(jì)量資料以M（P25，P75）表示，多組間總體差異比較采用Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)，組間比較采用Bonferroni法校正。配對(duì)設(shè)計(jì)采用Wilcoxon符號(hào)秩和檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 人口學(xué)數(shù)據(jù)和臨床特征 59例COVID-19患者中，男性37例，女性22例，年齡31.0（22.0，49.0）歲；各組患者性別比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.716，P=0.869）。各組患者年齡比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（H=17.787，P=0.001），其中無(wú)癥狀感染組[23.0（19.3，34.8）歲]顯著低于普通型組[35.0（24.0，52.0）歲]和重型/危重型組[64.5（52.0，68.3）歲]（P均＜0.05），而與輕型組[25.0（21.0，46.3）歲]比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。無(wú)癥狀感染組患者均無(wú)臨床癥狀和特異性胸部CT病變，而普通型組、重型/危重型組具有不同程度的發(fā)熱、乏力及呼吸道癥狀等，且至少存在累及1個(gè)肺葉的影像學(xué)改變。所有COVID-19患者均康復(fù)出院，無(wú)死亡病例，見(jiàn)表1。

表1 COVID-19患者的臨床特征（例）Table 1 Clinical characteristics of patients with COVID-19 (cases)

2.2 各組COVID-19患者治療前T細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)的比較 所有COVID-19患者入院首次T細(xì)胞亞群檢測(cè)結(jié)果顯示：無(wú)癥狀感染組10例（35.7%）、輕型組0例、普通型組13例（68.4%）、重型/危重型組6例（100%）患者的CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)低于正常值下限（參考范圍：550～1440個(gè)/μl）；無(wú)癥狀感染組3例（10.7%）、輕型組0例、普通型組2例（10.5%）、重型/危重型組5例（83.3%）患者的CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)低于正常值下限（參考范圍：320～1250個(gè)/μl）。無(wú)癥狀感染組外周血CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)均顯著高于重型/危重型組（P均＜0.05），與輕型組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），無(wú)癥狀感染組CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著高于普通型組（P＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 各組COVID-19患者治療前T細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)的比較[M（P25，P75）]Table 2 Comparison of T-cell subsets in patients with various types of COVID-19 before treatment [M (P25, P75)]

2.3 各組COVID-19患者治療前與治療后T細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)差值的比較 無(wú)癥狀感染組14例、普通型組13例、重型/危重型組6例患者在入院后第（14±2）d進(jìn)行了第2次外周血T細(xì)胞亞群檢測(cè)。與治療前相比，治療后無(wú)癥狀感染組4例（28.6%）、普通型組11例（84.6%）、重型/危重型組4例（66.7%）患者CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)升高；無(wú)癥狀感染組8例（57.1%）、普通型組10例（76.9%）、重型/危重型組5例（83.3%）患者CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)升高。14例無(wú)癥狀感染組患者治療前與治療后CD4+T細(xì)胞和CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05），見(jiàn)表3。普通型組、重型/危重型組治療后CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)均較治療前有不同程度的回升，但僅CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)在上述2組中的上升幅度顯著高于無(wú)癥狀感染組的變化幅度，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＜0.05），見(jiàn)表4。

表3 14例無(wú)癥狀感染者治療前和治療后T細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)的變化[M（P25，P75）]Table 3 Changes of T cell subsets in 14 asymptomatic infected patients before and after treatment [M (P25, P75)]

表4 各組COVID-19患者治療前后T細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)差值的比較[M（P25，P75）]Table 4 Comparison of T cell subpopulation count differences between patients with various types of COVID-19 before and after treatment [M (P25, P75)]

2.4 各組COVID-19患者治療前細(xì)胞因子和趨化因子表達(dá)譜的比較 無(wú)癥狀感染組24例、普通型組15例、重型/危重型組6例患者和24例健康對(duì)照者進(jìn)行了外周血細(xì)胞因子和趨化因子的檢測(cè)。統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，在34種細(xì)胞因子和趨化因子中，23種在COVID-19患者及健康對(duì)照者中不能被檢測(cè)到，故未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。不同臨床分型COVID-19患者及健康對(duì)照者的血清細(xì)胞因子和趨化因子水平見(jiàn)圖1。無(wú)癥狀感染組血清IL-7水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），雖低于普通型組、重型/危重型組患者，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。無(wú)癥狀感染組血清IP-10水平均顯著低于普通型組、重型/危重型組（P均＜0.05），但與對(duì)照組相比，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

圖1 各組COVID-19患者和對(duì)照組血清11種細(xì)胞因子和趨化因子水平直條矩形柱代表中位數(shù)，誤差線(xiàn)代表四分位數(shù)間距；Kruskal-Wallis H檢驗(yàn)比較多組間總體差異，IL-7：H=10.230，P=0.017；IL-8：H=1.101，P=0.777；IL-18：H=2.293，P=0.514；Eotaxin：H=2.152，P=0.411；GRO-α：H=2.797，P=0.424；IP-10：H=18.355，P=0.001；MCP-1：H=2.703，P=0.440；MIP-1α：H=2.271，P=0.518；MIP-1β：H=3.777，P=0.287；SDF-1α：H=7.393，P=0.060；RANTES：H=2.002，P=0.672；a. 與對(duì)照組比較，P＜0.05；b. 與普通型組比較，P＜0.05；c. 與重型/危重型組比較，P＜0.05Figure 1 Serum levels of 11 cytokines and chemokines in patients with COVID-19 in each group and control group

3 討 論

COVID-19無(wú)癥狀感染者是指沒(méi)有可以自覺(jué)感知的相關(guān)臨床表現(xiàn)如發(fā)熱、咳嗽、咽痛或可以臨床識(shí)別的癥狀和體征，而從呼吸道等標(biāo)本中檢測(cè)出SARS-CoV-2核酸陽(yáng)性的一組人群[3-4]。研究發(fā)現(xiàn)，2020年COVID-19疫情早期時(shí)無(wú)癥狀感染者的占比在1.6%～59.0%之間[5-6]；2021年廣州暴發(fā)的德?tīng)査儺愔暌咔椋瑹o(wú)癥狀感染者占比為4.6%[7]；2022年上海奧密克戎變異株疫情中，無(wú)癥狀感染者高達(dá)90%以上[8]。這提示隨著SARS-CoV-2病毒株的不斷進(jìn)化，病毒毒力下降，加之疫苗的廣泛接種后形成免疫屏障，無(wú)癥狀感染者成為最主要的感染類(lèi)型。無(wú)癥狀感染者因具有高度的隱匿性，早期識(shí)別困難，常在密切接觸者篩檢、聚集性疫情調(diào)查、對(duì)有境內(nèi)外SARS-CoV-2持續(xù)傳播地區(qū)旅行或居住史的人員開(kāi)展主動(dòng)核酸檢測(cè)時(shí)發(fā)現(xiàn)，因此探索無(wú)癥狀感染者的臨床及免疫學(xué)特征，有助于及時(shí)發(fā)現(xiàn)和遏制疫情傳播。

本研究顯示，COVID-19無(wú)癥狀感染者主要集中在青年人群，較少伴有基礎(chǔ)疾病，而普通型主要為中青年患者，重型/危重型更多見(jiàn)于老年患者，提示COVID-19的嚴(yán)重程度有年齡分布差異，這與其他一些研究的結(jié)果一致[9-11]。老年患者因免疫防御功能障礙、免疫衰老、發(fā)生免疫病理?yè)p傷的風(fēng)險(xiǎn)增高，使其發(fā)生重型、危重型COVID-19病例的比例顯著增高，并導(dǎo)致較高的病死率[12]。而年輕患者的T細(xì)胞和B細(xì)胞功能較強(qiáng)，能更好地控制病毒復(fù)制，同時(shí)減輕機(jī)體的炎癥反應(yīng)，使得患者未出現(xiàn)臨床癥狀[13]。世界衛(wèi)生組織的報(bào)告顯示全球70萬(wàn)例COVID-19患者的男女比例為1.03:1，而本研究也未發(fā)現(xiàn)COVID-19嚴(yán)重程度存在性別差異。

既往研究證實(shí)，潛伏期無(wú)癥狀感染者與持續(xù)無(wú)癥狀感染者具有不同的免疫表型，如CD8+初始T細(xì)胞、CD107alow經(jīng)典單核細(xì)胞、過(guò)渡型單核細(xì)胞等亞群比例降低，并存在單核細(xì)胞過(guò)渡活化和分化抑制現(xiàn)象，提示2種“無(wú)癥狀”具有截然不同的進(jìn)展方向[14]。本研究在納入無(wú)癥狀感染者作為研究對(duì)象時(shí)，排除了處于潛伏期的COVID-19輕型、普通型、重型/危重型患者，只納入屬于持續(xù)無(wú)癥狀感染者，因此能真實(shí)反映該類(lèi)型患者的免疫狀態(tài)。

宿主免疫功能是決定感染性疾病臨床轉(zhuǎn)歸的決定性因素之一。與前期一些研究結(jié)果相同，本研究也觀察到CD4+和CD8+T細(xì)胞計(jì)數(shù)在COVID-19患者中隨疾病進(jìn)展明顯降低，尤其是CD4+T細(xì)胞更為顯著[11，15]。在SARS-CoV-2感染后，適應(yīng)性免疫系統(tǒng)的輔助性T細(xì)胞、殺傷性T細(xì)胞及體液免疫的協(xié)同作用對(duì)疾病的預(yù)后和轉(zhuǎn)歸具有重要作用[16]?？乖禺愋訡D4+T細(xì)胞較CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的免疫應(yīng)答對(duì)早期的病毒控制更為關(guān)鍵，無(wú)癥狀感染者被發(fā)現(xiàn)擁有更多具有功能性的抗原特異性CD4+T細(xì)胞[17]，因此與較快的病毒清除和較輕的臨床癥狀密切相關(guān)。同時(shí)，無(wú)癥狀感染者存在豐富的T細(xì)胞受體克隆，以及效應(yīng)T細(xì)胞中干擾素刺激基因、細(xì)胞毒活性相關(guān)基因等的表達(dá)上調(diào)也對(duì)病毒的控制發(fā)揮重要作用[17-18]。本研究還發(fā)現(xiàn)，無(wú)癥狀感染者在治療前后外周血CD4+T細(xì)胞計(jì)數(shù)差值未見(jiàn)明顯上升甚至部分患者略有下降，這可能與免疫細(xì)胞上鞘氨醇-1及趨化因子受體的表達(dá)升高，促進(jìn)免疫細(xì)胞向次級(jí)淋巴組織及肺組織遷移有關(guān)，從而有利于肺部SARS-CoV-2的清除同時(shí)避免嚴(yán)重的免疫炎癥損傷[17]。

COVID-19危重型患者常出現(xiàn)免疫的過(guò)度激活、細(xì)胞因子風(fēng)暴，表現(xiàn)為血清中多種細(xì)胞因子水平的顯著增加，如IL-2、IL-6、IP-10、IP-10/CXC-10、MCP-1/CCL-2、GM-CSF、MIP1α/CCL3和TNF-α等[19]。這種過(guò)度的免疫反應(yīng)導(dǎo)致免疫損傷，引起多器官功能障礙甚至衰竭死亡。但無(wú)癥狀感染者的細(xì)胞因子表達(dá)譜的特點(diǎn)在不同研究中差異較大[20]。本研究共檢測(cè)34種細(xì)胞因子和趨化因子，發(fā)現(xiàn)COVID-19患者外周血IL-7和IP-10水平明顯升高，且變化趨勢(shì)隨疾病嚴(yán)重程度遞增。IL-7的產(chǎn)生相對(duì)恒定，其水平主要由T細(xì)胞消耗控制，外周血IL-7水平的升高預(yù)示著T細(xì)胞庫(kù)的消耗，實(shí)質(zhì)是對(duì)淋巴細(xì)胞減少產(chǎn)生的負(fù)反饋[21]，故重型/危重型患者升高幅度最大。IP-10屬于趨化因子CXC家族，可以通過(guò)激活機(jī)體免疫系統(tǒng)抵抗病毒抑制病毒復(fù)制。IP-10在單核巨噬細(xì)胞、活化的成纖維細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞表達(dá)，具有趨化炎癥細(xì)胞、促進(jìn)炎癥因子釋放、參與機(jī)體免疫調(diào)節(jié)等功能。與既往的研究結(jié)果一致，IP-10在COVID-19重型/危重型患者中顯著升高，但在無(wú)癥狀感染者中未見(jiàn)明顯變化，提示IP-10與COVID-19疾病嚴(yán)重程度相關(guān)，是反映疾病進(jìn)展的一種重要趨化因子[22]。

本研究尚具備一定的局限性，如樣本量偏小，尤其是輕癥、重癥、危重癥患者例數(shù)較少，可能使研究結(jié)果對(duì)上述臨床分型的代表性下降，同時(shí)因隨訪(fǎng)時(shí)間相對(duì)較短，未能觀察到SARS-COV-2不同分型感染者的遠(yuǎn)期預(yù)后和轉(zhuǎn)歸。其次，因傳染病標(biāo)本檢測(cè)的特殊性，本研究未能進(jìn)一步對(duì)其他免疫細(xì)胞亞群（如B細(xì)胞、NK細(xì)胞、單核細(xì)胞等）、活化標(biāo)記、效應(yīng)功能等進(jìn)行檢測(cè)。上述問(wèn)題有待于更深入的研究進(jìn)一步闡明。

綜上，COVID-19無(wú)癥狀感染者以青年為主，但未發(fā)現(xiàn)與性別因素相關(guān)。外周血T細(xì)胞亞群計(jì)數(shù)、細(xì)胞因子和趨化因子水平隨COVID-19嚴(yán)重程度而變化，但在無(wú)癥狀感染者中未見(jiàn)顯著改變，提示COVID-19無(wú)癥狀感染者通過(guò)適度的免疫應(yīng)答實(shí)現(xiàn)SARS-CoV-2清除與避免免疫病理?yè)p傷的平衡。