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    山奈酚抑制軟骨凋亡延緩小鼠膝骨關節(jié)炎的實驗研究

    2022-09-17 07:10:16米倚林易南星許曉彤楊烙堅李佳賓陳樹源鄺高艷
    海南醫(yī)學院學報 2022年17期
    關鍵詞:山奈靶點軟骨

    米倚林,易南星,許曉彤,楊烙堅,李佳賓,陳樹源,鄺高艷,盧 敏

    (湖南中醫(yī)藥大學第一附屬醫(yī)院,湖南長沙 410007)

    膝骨關節(jié)炎(knee osteoarthritis,KOA)是常見的關節(jié)慢性退行性疾病,主要表現(xiàn)為關節(jié)軟骨退變、軟骨下骨硬化和滑膜炎癥[1]。隨著人口老齡化和肥胖人口的增加,KOA 的患病率正在上升,已成為中國乃至世界面臨的重要社會健康問題[2]。臨床主要以非甾體抗炎藥(NSAIDs)緩解KOA 癥狀。目前尚缺乏能夠有效治療KOA 的藥物,晚期的關節(jié)置換是唯一的治療方式[3]。因此,亟需研究治療KOA 的藥物。

    中藥是藥物研究的寶庫,本研究擬基于網(wǎng)絡藥理分析結(jié)果和實驗驗證結(jié)合的方法探究山奈酚對KOA 的作用。已有研究表明多酚可能有益于骨關節(jié)炎,而黃酮類化合物是多酚家族的主要成員[4]。山奈酚是一種生物黃酮類化合物,廣泛存在于杜仲、牛膝、獨活等中藥中。研究證實山奈酚具有抗凋亡、抗炎和抗氧化等多種藥理活性[5]。有文獻證明山奈酚可通過抑制NF-κB 通路減輕IL-1β 誘導的軟骨細胞炎癥[6];也能夠抑制MAPK 相關的ERK 和p38 信號通路及IL-1β 刺激的基質(zhì)金屬蛋白酶的產(chǎn)生[7]。

    網(wǎng)絡藥理學是基于生物信息學和系統(tǒng)生物學發(fā)展起來的新型學科,為揭示中藥復雜機理的研究提供了新的方法[8]。本研究通過網(wǎng)絡藥理學探討山奈酚治療KOA 的分子機制,借助分子對接驗證山奈酚與其干預KOA 的關鍵靶基因(BCL-2、BAX和CASP3)的結(jié)合情況,并結(jié)合體內(nèi)實驗驗證山奈酚對膝關節(jié)組織形態(tài)學的影響以及對軟骨凋亡信號通路相關基因表達的影響。

    1 材料與方法

    1.1 山奈酚相關靶點篩選

    借助中藥系統(tǒng)藥理數(shù)據(jù)庫和分析平臺TCMSP(https://tcmspw.com/tcmsp.php)得到山奈酚藥物作用靶點,利用蛋白標準化Uniprot 數(shù)據(jù)庫(https://www.uniprot.org/)對山奈酚相關靶點進行統(tǒng)一轉(zhuǎn)化。

    1.2 KOA 相關靶點篩選

    以“knee osteoarthritis”為檢索和篩選KOA 相關靶基因的關鍵詞,通過GeneCards 數(shù)據(jù)庫(https://www. genecards. org/)、OMIM 數(shù) 據(jù) 庫(https://omim.org/)、PharmGKB 數(shù)據(jù)庫(https://www. pharmgkb. org)、TTD 數(shù) 據(jù) 庫(http://db.idrblab.net/ttd/)、Drugbank 數(shù) 據(jù) 庫(https://www.drugbank.ca/)得到KOA 相關靶基因。合并5 個疾病數(shù)據(jù)庫靶點,刪除重復基因得到與KOA 相關的靶基因。

    1.3 山奈酚-KOA 網(wǎng)絡構建

    基于篩選出的山奈酚潛在靶點,借助Cytoscape3.8.0 構建山奈酚靶點網(wǎng)絡圖。利用R 4.0.3 Venn 工具包繪制山奈酚與KOA 相關靶點Venn 圖,取其交集,得到共同靶點,再利用Cytoscape3.8.0 構建山奈酚與KOA 的共有靶點網(wǎng)絡圖。

    1.4 共同靶點GO 分析與KEGG 富集分析

    為進一步了解得到的交集網(wǎng)絡在基因功能和相關信號通路上的具體作用,運用DAVID 6.8(https://david.ncifcrf.gov/)數(shù)據(jù)庫對篩選出的靶點蛋白進行GO 功能富集分析與KEGG 通路富集分析(P值過濾條件及校正后的過濾條件均小于0.05),并借助R 4.0.3 中的clusterProfiler 包結(jié)合enrichplot包對富集分析結(jié)果及通路進行可視化處理。

    1.5 分子對接

    為進一步了解山奈酚和所篩選體內(nèi)受體靶點的結(jié)合模式和親和力,進入PubChem 數(shù)據(jù)平臺(https://pubchem.ncbi.nlm.nih,gov/)下載山奈酚的2D 結(jié)構,將其導入Chem3D 14.0.0.117 軟件進行結(jié)構優(yōu)化并轉(zhuǎn)換為3D 結(jié)構。利用RCSB 數(shù)據(jù)平臺(https://www.rcsb.org/)下載靶點蛋白的3D PDB格式文件;運用PYMOL 2.5.0 對蛋白進行去水分子和小分子配體等處理后導入Auto Dock Tools1.5.6軟件對關鍵靶點進行加氫、計算電荷等處理。并加極性氫,加載電荷,構建活性口袋;利用Vina1.1.2 軟件將目標靶點與山奈酚進行分子對接,以結(jié)合能作為對接評價指標,導入PYMOL 2.5.0 軟件進行可視化處理。

    1.6 山奈酚干預KOA 驗證性實驗

    1.6.1 實驗動物及分組 SPF 級8 周齡C57BL 雄性小鼠18 只,由湖南中醫(yī)藥大學動物實驗中心提供。將小鼠隨機分為假手術組、模型組、山奈酚組。各組小鼠在相同條件下自由飲水、攝食,由湖南中醫(yī)藥大學實驗動物中心飼養(yǎng)。本實驗方案由湖南中醫(yī)藥大學倫理委員會審核(倫理編號:LL2020 121601)。

    1.6.2 造模及給藥 使用小動物呼吸麻醉機,2%異氟烷麻醉小鼠,右側(cè)膝關節(jié)脫毛膏脫毛,碘伏消毒小鼠膝關節(jié)部位,半月板內(nèi)側(cè)失穩(wěn)手術(destabilization of the medial meniscus,DMM)手術誘導KOA模型[9]。模型組:右膝關節(jié)內(nèi)側(cè)髕韌帶與內(nèi)側(cè)副韌帶間切約0.5 cm 切口,顯微鏡下用顯微剪切斷內(nèi)側(cè)半月板脛骨韌帶,縫合皮膚切口;假手術組:行假手術造模,在右膝關節(jié)內(nèi)側(cè)髕韌帶與內(nèi)側(cè)副韌帶中間開0.5 cm 切口,縫合皮膚切口。傷口處碘伏擦拭,放回籠內(nèi),等待小鼠蘇醒。山奈酚組每日予以50 mg/kg 山奈酚灌胃[10],假手術組和模型組每日予以同體積生理鹽水灌胃;持續(xù)8 周。

    1.6.3 藥物、試劑、儀器 山奈酚(純度≥98.0%,HPLC 分析,江蘇永健醫(yī)藥科技有限公司),脫毛膏(利潔時公司,印度),異氟烷氣體麻醉劑(瑞沃德,Batch NO.217140901),多聚甲醛(國藥試劑有限公司,80096618),無水乙醇(國藥試劑有限公司,10009218),番紅O-固綠染液(北京雷根生物技術有限公司,生產(chǎn)批號DB0082),氨水(國藥試劑有限公司,10002118),二甲苯(國藥試劑有限公司,10023418),氫 氧 化 鈉(General-Reagent,G19852 H),世泰組織包埋盒(江蘇世泰實驗器材有限公司,REF31050102W),世泰黏附載玻片(江蘇世泰實驗器材有限公司)。全蛋白提取試劑盒(南京建成),BCA 蛋白濃度檢測試劑盒(南京建成),兔抗小鼠CASP3 、BAX、BCL-2 抗體(Abcam,1∶500),HRP標記的山羊抗兔二抗IgG(CST,1∶1 000),小動物麻 醉 機(Matrx VMR 美 國),脫 水 機(LEICA,TP1020),包埋機(LEICA,EG1150C)等。

    1.6.4 膝關節(jié)組織形態(tài)學觀察 持續(xù)灌胃8 周后使用小動物呼吸麻醉機,2%異氟烷深度麻醉小鼠后脫頸處死并取膝關節(jié),4% 多聚甲醛固定;10%EDTA 脫鈣4 周,組織脫水,石臘包埋,5 μm 矢狀位連續(xù)切片,進行番紅O-固綠染色,并用國際骨關節(jié)炎研究協(xié)會(osteoarthritis research society international,OARSI)評分系統(tǒng)分析軟骨退變程度[11],利用Image-J v1.50i 軟件統(tǒng)計小鼠脛骨軟骨面積。

    1.6.5 Western blot 檢測 采用Western blot 法檢測軟骨中BCL-2、BAX、CASP3 蛋白水平。將軟骨組織與RIPA 裂解液混合,研磨10~15 min,在冰上攪拌30 min 收集上清。BCA 法測定蛋白濃度,經(jīng)凝膠電泳轉(zhuǎn)膜封閉后,孵育相應一抗和二抗,顯影并采集圖像。

    1.7 統(tǒng)計學處理

    實驗數(shù)據(jù)采用GraphPad Prism7.0 軟件處理,結(jié)果采用均數(shù)±標準差(±s)表示。滿足正態(tài)分布,且方差齊時用單因素方差分析(one-way ANOVA);當方差不齊時,采用Dunnett's T3 檢驗。不滿足正態(tài)分布時,則采用非參數(shù)檢驗;兩兩比較采用LSD 法。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計學意義。

    2 結(jié)果

    2.1 山奈酚干預KOA 的潛在靶點網(wǎng)絡圖

    TCMSP 數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)山奈酚共有作用靶點63個,包括BAX、PTGS2、MMP1 等,見圖1A。檢索Gene-Cards、OMIM、PharmGKB、TTD、Drugbank 5個疾病基因相關數(shù)據(jù)庫,共得到與KOA 疾病發(fā)生密切相關的1 637 個靶基因。其中,GeneCards 1 579 個、OMIM 6 個、PharmGKB 9 個、TTD 2 個、Drugbank 71 個,將5 個數(shù)據(jù)庫的結(jié)果繪制Venn 圖,如圖1B 所示。將上述篩選得到的山奈酚63 個靶點與KOA 疾病相關的1 637 個靶點取交集,得到35 個共同靶點,其中包括BCL2、BAX、CASP3 等,如圖1C 所示。

    圖1 山奈酚治療KOA 的潛在靶點網(wǎng)路圖Fig 1 Network of potential targets for the treatment of KOA with kaempferol

    2.2 共同靶點GO 與KEGG 富集分析

    借助DAVID 6.8 數(shù)據(jù)庫對山奈酚治療KOA 相關靶點進行信號通路與生物學過程(biological process,BP)、細胞組分(cell component,CC)和分子功能(molecular functions,MF)富 集 分 析,并 利 用R4.0.3 工具包制作氣泡圖。結(jié)果顯示:山奈酚主要參與的生物學過程包括外源性凋亡信號通路(extrinsic apoptotic signaling pathway)、凋亡信號通路的負調(diào)控(negative regulation of apoptotic signaling pathway)、氧化應激反應(response to oxidative stress)等,見圖2A。參與的通路主要有細胞凋亡(apoptosis)、腫瘤壞死因子信號通路(TNF signaling pathway)等,見圖2B。

    圖2 山奈酚-KOA 靶點與通路的KEGG 與GO 富集分析Fig 2 GO analysis and KEGG pathway enrichment analysis of kaempferol-KOA

    2.3 山奈酚與BCL-2、BAX、CASP3 對接良好

    通過分子對接來評估蛋白質(zhì)與配體的結(jié)合潛能以進一步了解藥物與所篩選作用靶點的相關性。利用Auto Dock1.5.6 對山奈酚治療KOA 的3 個靶點(BCL-2、BAX、CASP3)進行結(jié)合能預測。根據(jù)參考文獻[12]表明配體與受體的結(jié)合能力為-7.0 kcal/mol 具有明顯結(jié)合活性,-5.0 kcal/mol 具有較好結(jié)合活性,-4.0 kcal/mol 有一定結(jié)合活性。結(jié)果表示,3 個靶點均存在較好結(jié)合能力,山奈酚與BCL-2 受 體 結(jié) 合 能 力 為-8.3 kcal/mol,與BAX 受體結(jié)合能力為-6.6 kcal/mol,與CASP3 受體結(jié)合能力為-6.8 kcal/mol,結(jié)合活性明顯。將山奈酚與BCL-2、BAX、CASP3 的 對 接 結(jié) 果 導 入PYMOL 2.5.0,如圖3 所示。

    圖3 山奈酚與BCL-2、BAX、CASP3 的分子對接圖Fig 3 Visualization of kaempferol-targets(BCL-2,BAX,CASP3)docking

    2.4 山奈酚能夠減輕關節(jié)軟骨損傷

    通過番紅O-固綠染色發(fā)現(xiàn),假手術組小鼠膝關節(jié)關節(jié)軟骨完整,軟骨表面光滑,無粗糙與缺損,半月板完整,無明顯病理表現(xiàn)。模型組與山奈酚組脛骨側(cè)關節(jié)軟骨厚度明顯降低,軟骨面粗糙、缺損。統(tǒng)計分析發(fā)現(xiàn),與假手術組比較,模型組小鼠膝關節(jié)關節(jié)軟骨OARSI 評分(5.20±0.57)顯著升高(P<0.001),脛骨軟骨面積[(1 408.00±174.00)mm2]顯 著 減 少(P<0.001)。山奈酚干預后,與模型組比較,山奈酚組小鼠關節(jié)軟骨OARSI 評分(3.00±0.61)明顯改善(P<0.001),軟骨面積[(2 522.40±439.10)mm2]較 模 型 組 明 顯 增 加(P<0.01)。 如 圖4所示。

    圖4 小鼠膝關節(jié)番紅O-固綠染色(40×,200×)、OARSI 評分和軟骨面積Fig 4 Mice knee joints stained with safranin O-fast green and determination of OARSI score and cartilage area

    2.5 山奈酚能夠調(diào)控BCL-2、BAX、CASP3 蛋白表達

    Western blot 檢測發(fā)現(xiàn),模型組小鼠膝關節(jié)軟骨中BAX、CASP3 蛋 白 表 達 量[(0.46±0.04),(0.54±0.06)]較假手術組[(0.15±0.02),(0.24±0.08)]顯著升高(P<0.01~0.001),而BCL-2 表達則顯著降低[(0.05±0.01),(P<0.001)];經(jīng)山奈酚干預,小鼠軟骨BAX、CASP3 蛋白表達量顯著降低[(0.31±0.04),(0.37±0.06)(P<0.05~0.01)],而BCL-2 蛋白表 達則顯著升高[(0.17±0.02),P<0.05]。表明山奈酚對軟骨細胞凋亡具有顯著抑制作用,見圖5。

    圖5 小鼠膝關節(jié)軟骨的BAX、BCL-2、CASP3 表達Fig 5 BAX,BCL-2 and CASP3 protein expression by Western blot assay

    3 討論

    KOA 是中老年人常見的關節(jié)疾病,不僅可以導致關節(jié)疼痛、畸形和功能障礙,還可顯著升高心血管事件、下肢深靜脈血栓栓塞、髖部骨折以及全因死亡率的風險[13]。中華醫(yī)學會骨科學分會[13]、國際骨關節(jié)炎研究協(xié)會(OARSI)[14]等均推薦首選基礎治療。本研究擬尋求治療KOA 的潛力藥物,山奈酚是一種廣泛存在于天然藥品中的黃酮醇,被證實是重要的天然抗炎化合物之一,在關節(jié)炎、癌癥、心血管等疾病中均發(fā)揮改善病情的作用,這與其降低炎癥相關疾病的風險密切相關[15,16]。山奈酚廣泛存在于多種中草藥和復方制劑中,已有報道說明山奈酚等黃酮醇類化合物是經(jīng)典名方獨活寄生湯的有效化學成分之一,獨活寄生湯多年來廣泛應用于臨床治療KOA 等骨科疾病,并且取得了較好療效[17]。本課題組前期已證實加味獨活寄生合劑含藥血清能通過調(diào)控Wnt 信號通路改善IL-1β 誘導的軟骨細胞病理表現(xiàn)[18],并且該藥可以通過降低OA 患者關節(jié)液中IL-1,TNF-α 及NO 水平改善關節(jié)功能及疼痛[19]。本研究首次系統(tǒng)地闡述了山奈酚通過調(diào)控BAX、BCL-2、CASP3 干預KOA 的作用機制。

    作為天然食品藥品的化學活性成分,山奈酚的副作用較小而作用廣泛,受到了越來越多的關注,此前已有多項研究證實山奈酚對KOA 有積極作用。已有研究發(fā)現(xiàn)山奈酚通過調(diào)控NF-κB 和MAPK 通路表現(xiàn)出很強的抗炎和抗關節(jié)炎作用[6,7]。此外,Jiang 等[20]的研究發(fā)現(xiàn)山奈酚可能通過下調(diào)miR-146a、抑制Decorin 的表達而干預脂多糖誘導的軟骨ATDC5 細胞凋亡和炎癥反應。近期研究發(fā)現(xiàn)山奈酚可通過調(diào)節(jié)軟骨細胞XIST/miR-130a/STAT3 軸抑制炎癥和細胞外基質(zhì)降解[21]。也有臨床試驗證實山奈酚在減輕KOA 疼痛和癥狀方面療效顯著[22]。網(wǎng)絡藥理學作為藥物研究的一種方法,融合了藥理學和生物學的多重優(yōu)勢,以藥物-成分-靶點-通路的網(wǎng)絡模式為特點,為藥物與疾病之間的聯(lián)系提供研究方法,并能反映藥物多靶點、多通路的作用關系[8]。本研究通過網(wǎng)絡藥理學方法闡述山奈酚治療KOA 的作用機制。筆者通過挖掘山奈酚和KOA 疾病發(fā)生、發(fā)展密切相關的靶基因,并構建了山奈酚與KOA 之間靶基因的網(wǎng)絡關系,發(fā)現(xiàn)BCL2、BAX、CASP3、NOS2 和JUN 等是山奈酚干預KOA 的重要靶點。通過GO 和KEGG 富集分析,山奈酚參與外源性凋亡信號通路、凋亡信號通路的負調(diào)控和氧化應激反應等生物學過程干預KOA,且與細胞凋亡、腫瘤壞死因子信號通路等通路有關。細胞凋亡是一種受基因調(diào)控的程序性細胞死亡方式[23],對軟骨發(fā)育和維持適當?shù)膭討B(tài)平衡至關重要[24]。軟骨退變是KOA 的關鍵特征,許多實驗研究均表明軟骨細胞凋亡在KOA 的進展中起著關鍵作用[25]。在KOA 病程中,軟骨細胞在多種原因?qū)е碌难装Y微環(huán)境刺激下發(fā)生凋亡,導致軟骨功能受損[26]。因此,抑制軟骨細胞凋亡可作為治療KOA的重要方法。細胞凋亡機制非常復雜,與一系列的信號分子相關,其中BCL-2、BAX 和CASP3 是細胞凋亡通路中3 個關鍵的分子[27]。本實驗分子對接驗證了山奈酚與BCL-2、BAX 和CASP3 的結(jié)合能力,發(fā)現(xiàn)其不僅具有明顯的結(jié)合能力,而且結(jié)合活性強。

    Caspase 家族作為細胞凋亡的核心,最早發(fā)現(xiàn)于1985 年[28],根據(jù)其結(jié)構和功能可分為啟動型和執(zhí)行型,其中啟動型Caspases 可以激活執(zhí)行型CASP3,放大凋亡信號通路,激活的CASP3 可觸發(fā)凋亡的級聯(lián)反應,導致細胞快速死亡[29]。BCL-2 蛋白家族調(diào)節(jié)線粒體膜通透性,既可以促進凋亡又可以抗凋亡,其中抗凋亡蛋白包括BCL-2、BCL-X、BAG 等,促凋亡蛋白包括BAX、BCL-10、BID 等,這些蛋白具有特殊的意義,因為它們可以決定細胞凋亡還是終止凋亡[30]。因此抑制BAX、CASP3 的表達,促進BCL-2 的表達對降低軟骨細胞凋亡至關重要[27]。研究表明,氧化應激與細胞凋亡密切相關,是機體內(nèi)自由基產(chǎn)生的一種負面效應,在KOA 的發(fā)展中起著重要作用,活性氧的積累會對軟骨細胞合成代謝的相關進程產(chǎn)生干擾,導致軟骨細胞功能紊亂和變性,進而導致細胞凋亡[31]。而細胞外激刺激可通過TNF 受體基因家族激活外源性凋亡途徑[32]。這些生物學過程和信號通路與本研究的GO和KEGG 富集結(jié)果一致,因此,細胞凋亡是山奈酚治療KOA 的潛在分子機制。

    本研究還對山奈酚治療KOA 的療效以及其對細胞凋亡關鍵靶點BCL-2、BAX 和CASP3 的調(diào)控進行了實驗驗證。實驗結(jié)果表明,番紅O-固綠染色發(fā)現(xiàn)DMM 誘導的小鼠膝關節(jié)軟骨的退變,而山奈酚對軟骨退變有明顯的改善作用,且調(diào)控了軟骨中BCL-2、BAX 和CASP3 蛋 白 水 平,與GO 和KEGG富集結(jié)果一致,本研究表明山奈酚組軟骨凋亡水平受到抑制,通過降低KOA 小鼠軟骨BAX、CASP3和增加BCL-2 蛋白水平發(fā)揮了延緩KOA 疾病進程的作用。

    綜上所述,本研究借助網(wǎng)絡藥理學及動物實驗對山奈酚治療KOA 潛在分子機制進行研究。研究結(jié)果證實山奈酚是一種潛在的治療KOA 的有效藥物,而抑制細胞凋亡是其可能的機制。

    作者貢獻度說明:

    論文設計:盧敏,鄺高艷;文獻檢索:米倚林,許曉彤;數(shù)據(jù)統(tǒng)計:米倚林,易南星,許曉彤,楊烙堅;圖表制作:米倚林,易南星,李佳賓,陳樹源;文稿撰寫:米倚林,易南星;基金獲取:盧敏,鄺高艷。

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