白蛋白結(jié)合蛋白在腫瘤細(xì)胞中功能及抗腫瘤藥物中應(yīng)用的研究進(jìn)展

曹陽，高潔 綜述，王輝，翟麗麗 審校

華北制藥集團(tuán)新藥研究開發(fā)有限責(zé)任公司抗體藥物研制國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 052165

腫瘤細(xì)胞代謝活躍，需消耗大量能量和營養(yǎng)物質(zhì)以滿足自身的快速生長。有研究表明，腫瘤細(xì)胞是利用包漿蛋白提供營養(yǎng)物質(zhì)，如白蛋白通過與白蛋白結(jié)合蛋白（albumin-binding proteins，ABPs）結(jié)合進(jìn)入細(xì)胞，降解為氨基酸再被腫瘤細(xì)胞利用［1］。后續(xù)研究在各種組織細(xì)胞中陸續(xù)發(fā)現(xiàn)了7種ABPs，ABPs在腫瘤細(xì)胞中的功能和作用機(jī)制也逐漸成為研究熱點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，ABPs在癌細(xì)胞和腫瘤血管上皮細(xì)胞上呈高表達(dá)，負(fù)責(zé)白蛋白的攝取、轉(zhuǎn)運(yùn)、累積或再利用，與腫瘤形成、浸潤和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)［2-3］。因此，ABPs有望作為腫瘤治療或藥物開發(fā)的新靶點(diǎn)。本文就ABPs在腫瘤細(xì)胞中功能及抗腫瘤藥物中應(yīng)用的研究進(jìn)展作一綜述。

1 ABPs在腫瘤細(xì)胞中的功能

1.1 Gp60（glycoprotein 60）受體介導(dǎo)腫瘤細(xì)胞對白蛋白的攝取Gp60受體也稱為Albondin，是一種血管內(nèi)皮膜蛋白。白蛋白與內(nèi)皮細(xì)胞膜蛋白Gp60受體的結(jié)合激活了血管通透性調(diào)控蛋白Caveolin-1，從而誘導(dǎo)細(xì)胞膜小窩樣囊泡的形成。小窩樣囊泡在質(zhì)膜上富含各種受體和信號分子，可促進(jìn)細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。如白蛋白與其Gp60受體的結(jié)合在小窩樣囊泡中誘導(dǎo)Gp60聚集，引起Gp60受體和Caveolin-1的酪氨酸（Tyr）磷酸化，并伴隨著細(xì)胞Src激酶（cSrc）活化和白蛋白跨內(nèi)皮運(yùn)輸?shù)脑黾樱?-5］。在血管內(nèi)皮細(xì)胞中，Tyr14-caveolin-1的磷酸化與小窩的萌芽和融合有關(guān)，提示其在大分子跨細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)中具有重要作用［6］。白蛋白與Gp60受體的結(jié)合實(shí)現(xiàn)了自身的內(nèi)在化和轉(zhuǎn)胞吞作用，避免了被自身的溶酶體降解。Gp60受體與膜蛋白Caveolin-1的結(jié)合是白蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)的關(guān)鍵步驟［7］。表明Caveolin-1是基于白蛋白藥物的潛在分子標(biāo)記物。研究發(fā)現(xiàn)，Gp60受體在多種腫瘤細(xì)胞呈高表達(dá)，介導(dǎo)了腫瘤細(xì)胞對白蛋白的攝取，從而為腫瘤的快速增殖提供了氨基酸和能量。因此，越來越多的研究將Gp60受體作為腫瘤藥物的靶點(diǎn)［4，8-9］。

1.2 與酸性和富含半胱氨酸的分泌蛋白（secreted protein acidic and rich in cysteine，SPARC）結(jié)合對白蛋白及其藥物在腫瘤細(xì)胞內(nèi)累積的影響SPARC蛋白是一種由多種類型細(xì)胞分泌富含半胱氨酸的酸性蛋白，能夠與細(xì)胞外基質(zhì)中多種蛋白包括受體、生長因子和蛋白酶等結(jié)合［10］。有研究采用親和層析法鑒定證明，分泌蛋白SPARC與血清白蛋白具有高親和力，是通過結(jié)合和識別Gp60受體而發(fā)揮作用，推測SPARC可能介導(dǎo)了細(xì)胞對白蛋白的攝?。?1］。研究發(fā)現(xiàn)，SPARC蛋白在多種腫瘤組織細(xì)胞和腫瘤微環(huán)境中呈高表達(dá)，并參與了腫瘤形成的多個(gè)生物學(xué)過程，如細(xì)胞周期、細(xì)胞黏連、遷移、血管形成和代謝等［12-13］。有研究提示，SPARC蛋白與白蛋白的結(jié)合增強(qiáng)了腫瘤間質(zhì)內(nèi)白蛋白結(jié)合藥物的累積，作用機(jī)制為白蛋白可與細(xì)胞膜表面Gp60受體結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)蛋白-小窩蛋白-1，并誘發(fā)細(xì)胞膜內(nèi)陷形成胞轉(zhuǎn)小泡（caveolae），并將白蛋白通過內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入細(xì)胞間隙。同時(shí)，白蛋白與腫瘤細(xì)胞上高表達(dá)SPARC蛋白相互作用，提高腫瘤組織攝取白蛋白［14］。初步臨床數(shù)據(jù)表明，SPARC蛋白的表達(dá)水平與納米顆粒白蛋白結(jié)合紫杉醇藥物Abraxane?的敏感性相關(guān)，SPARC蛋白高表達(dá)的患者使用白蛋白結(jié)合紫杉醇藥物后的臨床效果較好［15］。但該項(xiàng)研究與敲除小鼠SPARC基因后藥物效果的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)不一致，可能是由于小鼠敲除SPARC后并不影響腫瘤間質(zhì)內(nèi)Abraxane?的藥物濃度。因此，SPARC蛋白與白蛋白的結(jié)合是否有助于白蛋白及其藥物的攝取和累積尚有待進(jìn)一步深入研究。

1.3 白蛋白與Gp18和Gp30受體結(jié)合對細(xì)胞自我保護(hù)的影響1988年，GHINEA等［1］在脂肪組織微血管和肺組織內(nèi)皮細(xì)胞表面發(fā)現(xiàn)了與白蛋白結(jié)合的兩個(gè)多肽，相對分子質(zhì)量分別為30 000和18 000，命名為Gp30和Gp18。研究表明，與Gp60結(jié)合細(xì)胞內(nèi)天然白蛋白不同，Gp18和Gp30受體并不優(yōu)先與天然白蛋白結(jié)合，而是與構(gòu)象修飾后的白蛋白相互作用［16］。細(xì)胞正常老化、保護(hù)性或病理性的反應(yīng)會對白蛋白進(jìn)行氧化、非酶糖化或馬來酰胺化等修飾，而Gp18和Gp30受體可結(jié)合此類白蛋白并導(dǎo)致其降解。因此，與Gp18和Gp30受體的結(jié)合是細(xì)胞清除受損或有害白蛋白的有效途徑［17-18］。但目前，對Gp18和Gp30受體的研究較少，在腫瘤細(xì)胞中的功能尚未明確，白蛋白修飾藥物是否可與Gp18和Gp30受體結(jié)合從而發(fā)揮細(xì)胞自我保護(hù)作用也還有待進(jìn)一步研究。

1.4 與新生兒Fc受體（neonatal Fc receptor，F(xiàn)cRn）結(jié)合對白蛋白及相關(guān)藥物半衰期的影響FcRn是MHC-Ⅰ類相關(guān)分子，由于可將抗體IgG從母體轉(zhuǎn)運(yùn)到胎兒或新生兒而命名［19］。FcRn具有調(diào)節(jié)免疫球蛋白IgG、白蛋白穩(wěn)態(tài)和轉(zhuǎn)胞吞作用，在自身免疫疾病、黏膜免疫及腫瘤免疫監(jiān)視中發(fā)揮重要作用［19-21］。研究證實(shí)，F(xiàn)cRn主要以pH依賴的方式結(jié)合白蛋白，生理pH條件下兩者不結(jié)合；酸性低pH（6.0～6.5）條件下兩者結(jié)合，白蛋白經(jīng)內(nèi)體囊泡返回至細(xì)胞外空間，與FcRn分離而釋放，避免了經(jīng)溶酶體途徑被降解，從而延長了半衰期［22-23］。人類內(nèi)源性白蛋白的半衰期約為19 d，嚙齒動(dòng)物則為1.5～2.5 d［24］?；谠撎匦?，將治療性多肽或蛋白藥物與白蛋白結(jié)合結(jié)構(gòu)域（albumin-binding domain，ABD）融合，可有效提高藥物在血液循環(huán)系統(tǒng)中的半衰期和穩(wěn)定性。

FcRn在機(jī)體抗腫瘤機(jī)制中發(fā)揮著一定作用。與正常上皮細(xì)胞比較，F(xiàn)cRn在多種類型的腫瘤細(xì)胞系均呈低表達(dá)，因此在腫瘤細(xì)胞中過表達(dá)FcRn可抑制細(xì)胞增殖和移植瘤的形成。在腫瘤移植小鼠中敲低FcRn，小鼠出現(xiàn)低白細(xì)胞血癥，而細(xì)胞內(nèi)的白蛋白和谷氨酰胺水平增高［25］。FcRn與大腸癌細(xì)胞中CD8+T細(xì)胞的激活也有相關(guān)性，根據(jù)表達(dá)FcRn的樹突狀細(xì)胞的數(shù)目可預(yù)測大腸癌的預(yù)后情況。還有研究表明，肺癌組織中的FcRn表達(dá)水平與非小細(xì)胞肺癌的預(yù)后相關(guān)［26］。上述研究表明，F(xiàn)cRn可能不參與腫瘤細(xì)胞對白蛋白的攝取，另一方面也提示了FcRn可作為預(yù)后診斷指標(biāo)和腫瘤治療靶點(diǎn)。

1.5 鈣網(wǎng)蛋白（calreticulin，CRT）對腫瘤細(xì)胞凋亡的影響FRITZSCHE等［27］研究顯示，CRT可能是白蛋白結(jié)合蛋白。CRT位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，相對分子質(zhì)量約為46 000，是一種具有保守結(jié)構(gòu)的Ca2+結(jié)合蛋白，其作用機(jī)制是通過干預(yù)MHC-Ⅰ分子及裝配因子的加工折疊，影響抗原呈遞細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞，促進(jìn)吞噬細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的攝取和吞噬，從而加速腫瘤細(xì)胞的凋亡［28］，還可調(diào)控細(xì)胞間黏附分子（intercellular adhesion molecule，ICAM-1）和血管細(xì)胞黏附分子（vascular cell adhesion molecule-1，VCAM-1）的表達(dá)，從而增強(qiáng)白細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的相互作用，促進(jìn)淋巴細(xì)胞向腫瘤中的浸潤［29］。在腫瘤疫苗方面，使用與靶抗原（如人乳頭瘤病毒16 E7）連接的CRT DNA疫苗，可顯著增強(qiáng)抗原特異性免疫反應(yīng)［30］。因此，CRT在增強(qiáng)腫瘤免疫治療和腫瘤疫苗的研發(fā)中具有重要意義。白蛋白作為靶向腫瘤的藥物載體可能與CRT的結(jié)合有一定相關(guān)性。

1.6 真核細(xì)胞異質(zhì)核核糖核蛋白（heterogeneous nuclear ribonucleoproteins，hnRNPs）作為早期腫瘤分子標(biāo)記的潛力 研究表明，除CRT外，hnRNPs也能夠與白蛋白相結(jié)合［27］。hnRNPs家族是一組由RNA聚合酶Ⅱ產(chǎn)生的與前體轉(zhuǎn)錄物結(jié)合的核蛋白，目前已發(fā)現(xiàn)有20余種hnRNPs類蛋白質(zhì)，其可與前體RNA結(jié)合形成RNP復(fù)合物。hnRNPs參與調(diào)控染色質(zhì)重塑、mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)、RNA剪接、RNA編輯和翻譯后修飾等生物學(xué)功能，并在腫瘤發(fā)生中起重要作用［31］。研究發(fā)現(xiàn)，hnRNPs主要結(jié)合位于外顯子或內(nèi)含子中稱為剪接沉默子的序列，誘導(dǎo)剪接沉默作用，該蛋白家族還可通過翻譯后修飾作用，影響上皮間充質(zhì)細(xì)胞轉(zhuǎn)變，并參與腫瘤血管生成，改變細(xì)胞外基質(zhì)和成纖維細(xì)胞等腫瘤微環(huán)境，進(jìn)而影響腫瘤的轉(zhuǎn)移和代謝［32］。hnRNPs在腫瘤組織中的高表達(dá)常作為早期腫瘤的分子標(biāo)記物［31］，如hnRNP A2／B1作為肝癌的早期診斷分子［33］，hnRNP K作為結(jié)直腸癌和口鱗狀細(xì)胞癌患者預(yù)后的分子標(biāo)記［32，34］。與腫瘤免疫相關(guān)的hnRNPs見表1［32-33，35-39］。

表1 與腫瘤免疫相關(guān)的hnRNPs作用機(jī)制及作用結(jié)果Tab.1 Mechanism and result of action of hnRNP sassociated with tumor immunity

1.7 與Cubilin和Megalin受體的結(jié)合對白蛋白在近端小管中重吸收的影響 由腎小球過濾的血清白蛋白可通過受體介導(dǎo)的內(nèi)吞作用在近端小管中被重吸收，目前鑒定到兩種參與該過程的細(xì)胞受體，即Cubilin和Megalin［40-41］。Megalin是一種大的跨膜蛋白（相對分子質(zhì)量約600 000），屬于低密度脂蛋白受體家族；Cubilin也稱為內(nèi)在因子鈷胺素受體，是一種外周膜蛋白（相對分子質(zhì)量約460 000）。研究發(fā)現(xiàn)，Megalin以高親和力結(jié)合Cubilin，這可能有助于Cubilin-配體復(fù)合物的內(nèi)化［42］。有研究采用親和層析和表面等離子共振分析的方法，發(fā)現(xiàn)在腎近端小管上皮細(xì)胞中高表達(dá)的Cubilin可與白蛋白結(jié)合［43］。具有Cubilin功能缺陷的犬可在幾乎完全消除近端小管再吸收的情況下，排泄大量白蛋白，表明Cubilin在近端小管攝取白蛋白中具有重要作用。另外，研究還發(fā)現(xiàn)，缺乏內(nèi)吞受體Megalin的小鼠白蛋白的尿排泄改變，小管重吸收減少［44］。最新研究采用Cubilin和Meganlin單獨(dú)敲除及兩者同時(shí)敲除的小鼠進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)Cubilin的結(jié)合對近端小管細(xì)胞的重吸收至關(guān)重要，Megalin驅(qū)動(dòng)Cubilin-白蛋白復(fù)合物的內(nèi)化［45］。Cubilin在腎癌細(xì)胞高度特異表達(dá)，且腎癌患者預(yù)后不良與Cubilin的缺失相關(guān)，但尚無數(shù)據(jù)表明Cubilin在腎癌形成中的具體功能［46-47］。腎細(xì)胞癌對化學(xué)療法和放射療法不敏感，尚未鑒定到有效的早期診斷分子，Cubinlin是否可作為腎癌診斷分子還有待進(jìn)行深入研究。

2 基于白蛋白的腫瘤靶向藥物

腫瘤病灶靶點(diǎn)的藥物濃度對其療效至關(guān)重要。治療性藥物尤其是小分子藥物進(jìn)入人體后常出現(xiàn)非特異性分布，當(dāng)相對分子質(zhì)量低于腎臟過濾閾值時(shí)，由于腎臟快速清除而降低了藥物在血液中的循環(huán)時(shí)間。為延長藥物半衰期，可采用將聚乙二醇多肽或蛋白質(zhì)分子融合，即將藥物聚乙二醇化，如Adagen?和Pegasys?。由于聚乙二醇化必需的化學(xué)偶聯(lián)和大分子聚乙二醇在肝臟中累積等缺點(diǎn)，開發(fā)不良反應(yīng)少且半衰期長的藥物愈發(fā)重要?；趯Π椎鞍准捌浣Y(jié)合蛋白的分析，白蛋白是理想的藥物運(yùn)輸開發(fā)靶點(diǎn)，可有效改善藥物尤其是抗癌藥物的藥代動(dòng)力學(xué)。

2.1 與白蛋白直接偶聯(lián) 該策略適用于小分子藥物。針對腫瘤微環(huán)境的變化，藥效分子與白蛋白之間需通過對腫瘤微環(huán)境敏感的偶聯(lián)分子進(jìn)行連接，使藥物特異且快速地在腫瘤部位進(jìn)行釋放，如阿霉素（doxorubicin）白蛋白藥物Aldoxorubicin和甲氨蝶呤（MTX）-白蛋白藥物［48-49］。

2.2 與白蛋白融合 該策略適用于蛋白或多肽藥物。將白蛋白通過基因工程的方法與藥物分子進(jìn)行融合，在酵母或哺乳動(dòng)物細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行表達(dá)，如重組白蛋白與人表皮受體HER的融合有效抑制了腫瘤細(xì)胞的增殖［9，50］。采用該方法進(jìn)行藥物開發(fā)時(shí)需關(guān)注靶基因?qū)Π椎鞍渍_折疊的影響。

2.3 白蛋白納米顆粒藥物 該方法是將單克隆抗體功能化片段與白蛋白結(jié)合，延長藥物半衰期，同時(shí)增強(qiáng)抗原的免疫應(yīng)答。單克隆抗體能夠特異性靶向腫瘤部位，但由于傳統(tǒng)抗體結(jié)構(gòu)較大，腫瘤滲透能力差，影響單抗的功能發(fā)揮。單抗的功能化片段即納米抗體與白蛋白融合的方法可較好地解決上述問題。由于該藥物具有高親和力、良好的耐受性，且無嚴(yán)重的不良反應(yīng)，受到廣泛關(guān)注。如白蛋白紫杉醇藥物及發(fā)腫瘤靶向的白蛋白納米顆粒藥物均取得了較好的臨床效果［51-52］。

3 小結(jié)與展望

白蛋白是一種多功能蛋白質(zhì)分子，其能夠結(jié)合和運(yùn)輸多種內(nèi)源性和外源性復(fù)合物。ABPs于各類細(xì)胞廣泛表達(dá)，對白蛋白的細(xì)胞攝取、物質(zhì)運(yùn)輸、細(xì)胞內(nèi)累積及循環(huán)再利用均具有至關(guān)重要的作用。ABPs在腫瘤細(xì)胞中的過度表達(dá)，提示其可能在腫瘤形成過程發(fā)揮重要功能，對該觀點(diǎn)進(jìn)行深入研究將促進(jìn)腫瘤靶向藥物的研發(fā)。