PI3K和Notch信號(hào)途徑對(duì)尋常型銀屑病患者外周血CD4+T細(xì)胞的增殖和活化發(fā)揮協(xié)同調(diào)控作用

劉佳, 魏明

鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科,河南 鄭州 450052

銀屑病是一種由免疫細(xì)胞異常導(dǎo)致的慢性炎性疾病，特別是CD4+T細(xì)胞和諸多相關(guān)炎性因子在其致病過程中發(fā)揮著主要作用[1-4]。有關(guān)銀屑病相關(guān)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及細(xì)胞調(diào)控信號(hào)的研究是目前熱點(diǎn)和關(guān)注點(diǎn)[5]。磷酯酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol 3 kinase,PI3K)在尋常型銀屑病患者外周血單個(gè)核細(xì)胞的表達(dá)較正常對(duì)照者顯著增加，且其活性在尋常型銀屑病患者皮損表皮表達(dá)較正常對(duì)照皮膚表皮升高明顯[6-7]。也有研究顯示尋常型銀屑病患者骨髓造血干細(xì)胞Notch1表達(dá)較健康對(duì)照組顯著升高，且Notch信號(hào)途徑下游靶基因Hes-1蛋白水平顯著增加[8]。這些研究結(jié)果均提示PI3K和Notch信號(hào)傳導(dǎo)途徑廣泛參與了T細(xì)胞的表達(dá)[9-10]。為進(jìn)一步了解PI3K和Notch信號(hào)途徑與尋常型銀屑病患者外周血CD4+T細(xì)胞極化和增殖關(guān)系，本研究以PI3K信號(hào)途徑和Notch信號(hào)途徑對(duì)尋常型銀屑病患者外周血CD4+T細(xì)胞周期調(diào)節(jié)蛋白(Cyclin)D1、Cyclin A及P27kipl為切入點(diǎn)，探討PI3K和Notch信號(hào)途徑在尋常型銀屑病患者外周血中CD4+T細(xì)胞增殖、分化及活化中的調(diào)控作用。

1 對(duì)象與方法

1.1 臨床資料

1.2 標(biāo)本采集

于就診次日清晨空腹使用肝素抗凝試管抽取所有受試者外周血10 mL，抗凝血用于分離CD4+T細(xì)胞。

1.3 使用試劑

主要抗體：兔抗鼠Cyclin D1-PE、兔抗鼠P27kipl-PE、兔抗鼠CyclinA、羊抗兔IgG-PE(美國(guó)Santa Cruz)；Trizol(美國(guó)Invitrogen)；兔抗鼠CD4+T細(xì)胞-FITC(美國(guó)eBioscience)；引物Primer 5.0(上?；?；RT-聚合酶鏈反應(yīng)試劑(美國(guó)Fermentas)；小鼠CD4+T細(xì)胞陰性篩選試劑(挪威Dynal)；改良型RPMI 1640(美國(guó)Hyclone)；FBS(杭州四季青生物科技有限公司)。

1.4 細(xì)胞分離

應(yīng)用聚蔗糖-泛影葡胺密度梯度離心法分離外周血單個(gè)核細(xì)胞；采用免疫磁珠法將單個(gè)核細(xì)胞中的CD4+T細(xì)胞進(jìn)行分離,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD4+T細(xì)胞純度；采用0.4%錐蟲藍(lán)對(duì)CD4+T淋巴細(xì)胞染色，以便觀察存活細(xì)胞百分率。

1.5 實(shí)驗(yàn)分組和處理

10% FBS的RPMI1640培養(yǎng)基混懸細(xì)胞，CD4+T細(xì)胞含量稀釋為1×106個(gè)/mL，分成4組：空白對(duì)照組(磷酸鹽緩沖液+患者CD4+T細(xì)胞)，LY294002組(10 μmol/L LY294002+患者CD4+T細(xì)胞)，DAPT組(25 μmol/L DAPT+患者CD4+T細(xì)胞)，LY294002+DAPT組(10 μmol/L LY294002+25 μmol/L DAPT+患者CD4+T細(xì)胞)，各組每個(gè)孔均以PHA 10 μg/L和IL-2 1 000 U/mL刺激增殖6 h后進(jìn)行干預(yù)，置于5% CO2、37 ℃恒溫箱培養(yǎng)2 d，取出備用。

1.6 CD4+ T細(xì)胞Cyclin A、Cyclin D1和P27kipl蛋白水平的檢測(cè)

每組各取3管，磷酸鹽緩沖液清洗1次，4% PAF固定液固定10 min，用85%酒精溶液固定2 h，清洗后置入0.3% TritonX-100的磷酸鹽緩沖液10 min以破壞細(xì)胞膜，向各組試管中分別加入0.1 mL稀釋度為1∶60的兔抗鼠P27kipl、Cyclin A、Cyclin D1抗體，4 ℃過夜；加入稀釋度為1∶50的羊抗兔IgG-PE熒光抗體0.1 mL，暗室孵育30 min；陰性對(duì)照加入正常兔IgG克隆抗體替代一抗，其余方法同上；清洗后加入0.2 mL 4% PAF固定液固定混懸細(xì)胞暗室保存，30 min內(nèi)用FCM測(cè)定，每份樣本檢測(cè)細(xì)胞1×104個(gè)，F(xiàn)lowJo軟件包對(duì)檢測(cè)數(shù)據(jù)處理，用CD4+T細(xì)胞中PE激發(fā)的陽(yáng)性細(xì)胞百分率計(jì)算Cyclin A、CyclinD1和P27kipl蛋白表達(dá)水平。

1.7 逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)檢測(cè)CD4+ T細(xì)胞Cyclin A、Cyclin D1和P27kipl的mRNA表達(dá)水平

采用Trizol法對(duì)細(xì)胞勻漿RNA進(jìn)行提取，按照PCR試劑說明書進(jìn)行操作。聚合酶鏈反應(yīng)體系容積25 μL，具體參數(shù)為：94 ℃預(yù)變性5 min后，94 ℃ 30 s，退火30 s，72 ℃延伸1 min，循環(huán)40次，72 ℃ 10 min；以Gel-pro32軟件進(jìn)行圖像處理，以產(chǎn)物熒光強(qiáng)度與β-actin產(chǎn)物熒光強(qiáng)度比值來(lái)計(jì)算目的基因相對(duì)表達(dá)。逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)相關(guān)引物序列見表1。

表1 引物序列

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0處理分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。兩組間Cyclin A、Cyclin D1、P27kipl蛋白、mRNA水平等比較采用t檢驗(yàn)，多組間比較以O(shè)ne-way ANOVA分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 實(shí)驗(yàn)獲得CD4+ T細(xì)胞分析

流式細(xì)胞儀檢測(cè)干預(yù)后CD4+T細(xì)胞純度為(90.00±5.20)%；采用0.4%錐蟲藍(lán)對(duì)干預(yù)后CD4+T細(xì)胞進(jìn)行染色，CD4+T細(xì)胞存活率為(94.80±4.10)%，符合實(shí)驗(yàn)要求。

2.2 CD4+ T細(xì)胞Cyclin A、Cyclin D1和P27kipl蛋白和mRNA表達(dá)

與健康對(duì)照組比較，尋常型銀屑病患者組Cyclin A和Cyclin D1 mRNA水平及蛋白水平均明顯升高(均P<0.05)，而P27kiplmRNA水平及蛋白水平均明顯降低(均P<0.05,表2)。

表2 健康對(duì)照組與患者組外周血CD4+T細(xì)胞Cyclin A、Cyclin D1和P27kipl表達(dá)水平 (mean±SD)

2.3 PI3K和Notch信號(hào)通路對(duì)尋常型銀屑病患者外周血CD4+ T淋巴細(xì)胞Cyclin A、Cyclin D1、P27kipl mRNA表達(dá)水平的影響

與空白對(duì)照組CD4+T細(xì)胞Cyclin D1 mRNA表達(dá)比較，LY294002組、DAPT組和LY294002+DAPT組明顯降低(均P<0.01)，與LY294002組、DAPT組比較，LY294002+DAPT組CD4+T細(xì)胞Cyclin D1 mRNA水平降低更為明顯(P值分別為0.022、0.002)；與空白對(duì)照組CD4+T細(xì)胞P27kiplmRNA水平比較，LY294002組、DAPT組和LY294002+DAPT組表達(dá)明顯升高(P值分別為0.018、0.002、0.003)，且LY294002+DAPT組P27kiplmRNA表達(dá)水平較LY294002組、DAPT組更高(均P<0.01)；空白對(duì)照組、LY294002組、DAPT組和LY294002+DAPT組CD4+T細(xì)胞Cyclin A mRNA表達(dá)無(wú)明顯差異(P=0.059,表3)。

2.4 PI3K和Notch信號(hào)途徑對(duì)尋常型銀屑病患者外周血CD4+ T細(xì)胞Cyclin A、Cyclin D1、P27kipl蛋白的影響

與空白對(duì)照組CD4+T細(xì)胞Cyclin D1的蛋白表達(dá)比較，LY294002組、DAPT組和LY294002+DAPT組明顯降低(P分別為0.005、0.006、0.001)，與LY294002組、DAPT組比較，LY294002+DAPT組CD4+T細(xì)胞Cyclin D1的蛋白水平降低更為明顯(P分別為0.031、0.024)。與空白對(duì)照組CD4+T細(xì)胞P27kipl的蛋白比較，LY294002組、LY294002+DAPT組表達(dá)明顯升高(P分別為0.018、0.004)，與LY294002組、DAPT組CD4+T細(xì)胞P27kipl的蛋白比較，LY294002+DAPT組顯著升高(均P<0.01)。空白對(duì)照組、LY294002組、DAPT組和LY294002+DAPT組CD4+T細(xì)胞Cyclin A蛋白表達(dá)無(wú)差異(P=0.087)，詳見表3。

表3 聯(lián)合干預(yù)后各組外周血CD4+T細(xì)胞Cyclin A、Cyclin D1和P27kipl的表達(dá)水平 (mean±SD)

3 討論

目前普遍認(rèn)為，銀屑病是一種發(fā)病機(jī)制復(fù)雜的慢性炎癥性皮膚疾病，T淋巴細(xì)胞異常增殖、分化和活化及相關(guān)炎性細(xì)胞因子的釋放在慢性炎癥反應(yīng)中起著重要作用[12]。CD4+T細(xì)胞周期時(shí)相的變化反映了銀屑病CD4+T淋巴細(xì)胞活化、增殖的情況，對(duì)維持細(xì)胞周期的正常運(yùn)行、細(xì)胞周期蛋白的調(diào)控具有重要作用[13]。

細(xì)胞周期是細(xì)胞增殖的最終途徑，細(xì)胞周期能否順利進(jìn)行依賴細(xì)胞周期調(diào)控蛋白調(diào)控，Cyclin A和Cyclin D1是調(diào)節(jié)G1期的一種細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，可與細(xì)胞周期蛋白依賴激酶結(jié)合形成復(fù)合物，在細(xì)胞周期蛋白依賴激酶作用下發(fā)生磷酸化，可促使細(xì)胞通過G1-S調(diào)控點(diǎn)，使CD4+T細(xì)胞進(jìn)入分裂程序，而P27kipl作為細(xì)胞周期蛋白依賴激酶抑制因子，通過抑制Cyclin A和Cyclin D1與細(xì)胞周期蛋白依賴激酶結(jié)合形成復(fù)合物的活性，從而抑制CD4+T細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果顯示，與健康對(duì)照組比較，尋常型銀屑病患者外周血中CD4+T細(xì)胞內(nèi)相關(guān)正向調(diào)節(jié)物質(zhì)Cyclin A和Cyclin D1的mRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)顯著升高，而負(fù)向調(diào)節(jié)物質(zhì)P27kiplmRNA表達(dá)及蛋白表達(dá)顯著降低。研究顯示，由體內(nèi)干預(yù)和基因敲除研究顯示，在P27kipl表達(dá)缺陷小鼠體內(nèi)，外周血CD4+T細(xì)胞水平明顯升高[18]。因此推測(cè)尋常型銀屑病患者CD4+T細(xì)胞Cyclin A、Cyclin D1水平升高，同時(shí)P27kipl蛋白表達(dá)下降，可能加快了外周血CD4+T細(xì)胞周期，引起尋常型銀屑病患者外周血CD4+T細(xì)胞異常增殖、分化及活化。

有研究表明，阻滯PI3K信號(hào)途徑能加速誘導(dǎo)Treg細(xì)胞產(chǎn)生[7]。Notch信號(hào)途徑活化后可影響T淋巴細(xì)胞的增殖、分化及活化，異常活化的Notch信號(hào)途徑可引起機(jī)體免疫系統(tǒng)的紊亂[14-15]。Hes-1是Notch信號(hào)途徑的靶向蛋白，在CD4+T細(xì)胞活化、分化進(jìn)程中發(fā)揮重要影響[16]。當(dāng)Notch信號(hào)途徑異常誘導(dǎo)CD4+T細(xì)胞活化時(shí)，Hes-1通過調(diào)節(jié)CD4+T細(xì)胞活化基因的轉(zhuǎn)錄，從而對(duì)CD4+T細(xì)胞活化起到負(fù)反饋調(diào)節(jié)影響[17]。因此PI3K和Notch信號(hào)途徑與CD4+T細(xì)胞的活化、增殖密切相關(guān)。

本研究采用LY294002和DAPT對(duì)尋常型銀屑病患者外周血CD4+T細(xì)胞進(jìn)行聯(lián)合干預(yù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，與LY294002組、DAPT組比較，細(xì)胞周期正向調(diào)節(jié)物質(zhì)Cyclin D1水平明顯下降，同時(shí)負(fù)向調(diào)節(jié)物質(zhì)P27kipl水平明顯升高。因此可推測(cè)PI3K和Notch信號(hào)途徑對(duì)尋常型銀屑病患者外周血CD4+T細(xì)胞增殖、分化及活化具有協(xié)同作用，其作用機(jī)制可能是通過協(xié)同介導(dǎo)CD4+T細(xì)胞內(nèi)的正向調(diào)節(jié)物質(zhì)Cyclin D1蛋白和基因水平升高，負(fù)向調(diào)節(jié)物質(zhì)P27kipl蛋白和基因水平降低，而促使細(xì)胞增殖、分化及活化的進(jìn)程中G1期向S期這一重要節(jié)點(diǎn)跨越，實(shí)現(xiàn)對(duì)CD4+T細(xì)胞增殖的協(xié)同調(diào)控。

綜上所述，細(xì)胞周期蛋白Cyclin A、Cyclin D1、P27kipl可能參與了尋常型銀屑病CD4+T細(xì)胞異常增殖、分化及活化的調(diào)控，Notch和PI3K信號(hào)途徑對(duì)其具有協(xié)同調(diào)節(jié)作用。下一步尚需深入研究其具體作用機(jī)制，以便為相關(guān)靶向治療尋常型銀屑病的研究提供新思路。