五勝肽的合成研究

鄭 博

（渭南師范學(xué)院 化學(xué)與材料學(xué)院，陜西 渭南 714099）

五勝肽屬于短肽，被應(yīng)用于化妝品方面，它可促進肌膚膠原蛋白的生長，并提高肌膚鎖水能力，長期使用可增強細(xì)胞修復(fù)力，使肌膚年輕化，改善靜態(tài)紋[1]。現(xiàn)如今，人們已經(jīng)從一些短肽的合成延伸到人們理想的任意肽段。多肽還被廣泛應(yīng)用于醫(yī)療、衛(wèi)生、保健、食品等方面，從而擴大了多肽研究領(lǐng)域，使其對化學(xué)、生物學(xué)、醫(yī)藥學(xué)、免疫學(xué)等的研究具有巨大的推動作用和應(yīng)用價值。

五勝肽是具有生物活性的多肽，通過Fmoc去保護，利用賴氨酸、蘇氨酸、絲氨酸以及Pal為合成原料，采用合適的固體縮合劑TBTU和液體縮合劑DIEA，經(jīng)過反復(fù)的去保護-偶聯(lián)后，通過切割載體樹脂，最終合成了含有5個氨基酸偶聯(lián)成的一條Pal-Lys（Boc）-Thr（tbu）-Thr（tbu）-Lys（Boc）（Pal-L-TT-L）多肽。多肽是由多個氨基酸有次序地進行氨基和羧基的縮合，通過肽鍵共價連接成長短不一的鏈狀化合物。近年來，由于Fmoc固相合成法具有反應(yīng)條件溫和，產(chǎn)率高，在酸處理中不受影響，操作簡單，且Fmoc自身具有紫外吸收，易于監(jiān)測，便于實現(xiàn)自動化等優(yōu)點[2,3]而被廣泛應(yīng)用。Fmoc固相合成法的縮合劑大多采用TBTU/HOBt/DIEA[4-6]，這種縮合劑體系明顯縮短了接肽反應(yīng)時間，減少副反應(yīng)，也有利于抑制消旋反應(yīng)的發(fā)生。

Fmoc固相合成采用的載體由兩部分組成：高分子樹脂和連接分子。正確的選擇樹脂與連接分子決定了固相合成的效率。本實驗采用Wang樹脂作為載體。由于多肽固相合成的飛速發(fā)展，新型樹脂和縮合劑不斷被發(fā)現(xiàn)，合成技術(shù)不斷成熟，自動化程度不斷發(fā)展，使得多肽的合成效率明顯提高。

1 實驗部分

1.1 儀器和試劑

AUW120D型電子天平（島津儀器公司）；SHBIIIA型循環(huán)水式真空泵（林茂科技公司）；DHG-9023AS型鼓風(fēng)干燥箱（中新醫(yī)療儀器有限公司）；JX-10型干式恒溫器（上海凈信實業(yè)發(fā)展有限公司）；LCMS 1260-6430型液質(zhì)聯(lián)用儀（安捷倫公司）；TD-5R型臺式低速大容量離心機（濟南歐萊博技術(shù)有限公司）；VORTEX-1型旋渦混合器（濟南程騰生物技術(shù)有限公司）；PS-40A型超聲波清洗器（深圳市得康洗凈電器有限公司）。

所有試劑均為分析純。絲氨酸樹脂（Fmoc-Ser（tbu）-Wang.Resin）（S）（Wang樹脂）、賴氨酸（Fmoc-Lys（Boc）-OH）（K）、蘇氨酸（Fmoc-Thr（tbu）-OH）（T）（Fmoc）、棕櫚酸（Pal）、2,2-二甲基甲酰胺（2,2-dimethylformamide）（DMF）、甲醇、乙醚、無水乙醇、二氟甲烷（difluoromethane）（DCM）、乙腈、乙酸乙酯、茚三酮、吡啶、六氫吡啶（piperidine）（DBLK），北京化學(xué)廠；N-二異丙基乙胺（N-diisopropylethylamine）（DIEA）、1-氧-3-雙二甲胺羰基苯駢三氮唑四氟化硼鹽（1-oxygen-3-dimethylamine carbonyl benzotriazolium boron tetrafluoride salt）（TBTU）、六氟磷酸苯駢三唑-1-基-氟基三吡咯烷基（Hexafluo rophosphate benzotriazol-1-yl-fluoro-tripyrrole alkyl）（PyBOP）、1-羥基苯并三唑（1-hydroxybenzotriazole）（HOBT）、三氟乙酸（trifluoroacetic acid）（TFA），Alfa Aesar；苯酚（青島恒瑞廠）；實驗中使用的超純水（大于18MΩ·cm-1）；工業(yè)氮（青島魯東氣體有限公司）。

1.2 五勝肽的合成原理

（1）將Wang樹脂載體通過脫帽液去除Fmoc保護；（2）將要合成肽鏈的第一個氨基酸的羥末端的羥基以共價鍵的結(jié)構(gòu)同該高分子樹脂相連，即第一個氨基酸偶聯(lián)完成，見圖1。

圖1 第一個氨基酸的偶聯(lián)合成路線Fig.1 Coupling synthetic route of the first amino acid

第一個氨基酸合成后，將此結(jié)合在固相載體上的氨基酸作為氨基組分，再經(jīng)過脫去氨基保護基，并同第二個氨基酸的羥基組分反應(yīng)。重復(fù)“縮合→洗滌→去保護→中和洗滌→下一步縮合”操作，達到所要合成的肽鏈長度，最后將肽鏈從樹脂上裂解下來，即得到所要合成的多肽粗品。

1.3 五勝肽的合成過程

1.3.1 準(zhǔn)備工作

（1）肽序列的核對 從右往左，最右邊第一個是樹脂。

（2）樹脂的選擇 肽序列長度越長，選擇的樹脂替代度越低，反之則長度越短，選擇的樹脂替代度越高。一般2～50肽為短肽，50肽以上為長肽。該肽是五肽，屬于短肽，用的是Fmoc-Ser（tbu）-Wang.Resin樹脂（純度為0.35mol·g-1）。

（3）樹脂的稱取 產(chǎn)品中多肽含量設(shè)為0.1mmol，由樹脂純度計算可知，需稱量Wang樹脂的質(zhì)量約為0.29mg。

1.3.2 溶脹樹脂 把稱好的樹脂倒進反應(yīng)柱里，加入DCM溶脹30min，使樹脂溶脹完全。

1.3.3 洗滌 樹脂溶脹完全后，抽掉反應(yīng)柱里的溶劑，向其加入DMF溶劑，不停旋轉(zhuǎn)活塞，并在其中充入不同壓強的N2洗滌，旋轉(zhuǎn)時間大約10s左右，抽掉溶劑。重復(fù)操作，再用DMF洗兩遍，共用DMF洗滌3遍。

1.3.4 去保護 抽干反應(yīng)柱里的溶劑，向其加入脫帽液，鼓氣，脫帽5min后，用DMF洗一遍抽干，再加入脫帽液，脫帽10min。第二次脫帽結(jié)束后，用DMF洗滌6次（不能少于6次）。

1.3.5 偶聯(lián) 按多肽序列，依次稱取各氨基酸的質(zhì)量，由于反應(yīng)過程中會受溫度、壓強、副反應(yīng)、反應(yīng)時間等各種因素的影響，造成反應(yīng)不完全，引起多肽不能完全偶聯(lián)。所以稱取氨基酸的質(zhì)量一般在標(biāo)準(zhǔn)量的3倍，目的是為了保證多肽能夠完全偶聯(lián)（見表1）。

表1 各氨基酸的稱取質(zhì)量Tab.1 Weight of each amino acid

氨基酸完成稱量后，把反應(yīng)柱里的溶液抽干,將藥品投入反應(yīng)柱，加入DMF溶劑，再加入液體激活劑DIEA 0.1mL，鼓入N2反應(yīng)30min。

1.3.6 檢測 反應(yīng)后，用滴管移取少量反應(yīng)液置于小試管中，再向其中分別加入3D 50%苯酚、3D吡啶、3D茚三酮，搖勻，放入檢測器中檢測150s。取出小試管放在透明的白紙上進行對照，若溶液出現(xiàn)亮黃色，沿著試管壁倒掉溶液，試管壁上會附有樹脂；再次在透明的白紙上對照，樹脂呈透明狀，則說明該氨基酸已經(jīng)完成偶聯(lián)。抽掉溶液，重復(fù)步驟3～6，依次偶聯(lián)兩個蘇氨酸和賴氨酸以及Pal，由于Pal呈牛奶狀，會附在試管壁上，所以偶聯(lián)Pal時，要進行加熱攪拌。

1.3.7 收縮 因Pal沒有保護基，不用去保護再收縮，直接進行收縮。但若最后一個偶聯(lián)的是其它氨基酸或帶有保護基的物質(zhì)，則要先去保護再收縮。收縮的過程是先用DMF洗3次，再用DCM洗3次，最后用甲醇洗3次。取出試管將水分完全抽干。

1.3.8 切割與沉淀 各氨基酸完成偶聯(lián)后，需將樹脂切割掉，才能得到五勝肽。首先，需在50mL圓底燒瓶中加入5mL暗黃色切割液（86%TFA+4%苯甲硫醚+5%EDT+3%蒸餾水+2%苯酚），封好圓底燒瓶口，置于30℃的干式恒溫器中振蕩2h。隨后，將燒瓶中的液體倒入50mL離心管中，緩慢加入乙醚，此時有發(fā)煙現(xiàn)象，將離心管口封住放入臺式低速大容量離心機（2800r·min-1）中離心2min，倒掉上層渾濁液，得到下層白色固體。再向其中加滿乙醚封口，放于旋渦混合器中，將50mL離心管中的白色固體振散，放入臺式低速大容量離心機（2800r·min-1）中離心2min。此操作重復(fù)兩次。用2mm毛細(xì)玻璃管蘸取少量液體，移入5mL離心管，用膠頭滴管滴入1D乙腈和1D蒸餾水，放入超聲波清洗器中振蕩5s，使其充分溶解。將其置于小型臺式離心機中離心2min（1200r·min-1）。用液質(zhì)聯(lián)用儀進行檢測，將所合成的肽粗品半封口，放入干燥器中干燥。

1.3.9 鑒定多肽 經(jīng)過上述操作，合成的多肽粗品通過質(zhì)譜分析是否含有所需目標(biāo)產(chǎn)物。取少量該多肽粗品，經(jīng)過ESI-MS方法鑒定。設(shè)置的條件為：樣品溶解于甲醇，通過注射泵打入電噴霧質(zhì)譜。電噴霧質(zhì)譜條件：噴霧器壓力7.0，流速4.0或8.0L·min-1，溫度300℃。噴霧針電壓為4.0kV，N2干燥。通過對比質(zhì)譜圖所得的分子量與最高峰的理論值，確定是否得到目標(biāo)產(chǎn)物。

2 結(jié)果與討論

2.1 樹脂溶脹不完全影響反應(yīng)的合成

樹脂中加入DCM后，溶脹時間越長，樹脂溶脹越完全。溶液隨加入DCM時間的變化，見表2。

表2 樹脂的溶脹時間與變化現(xiàn)象Tab.2 Resin swelling time and change phenomenon

由表2可以看出，剛加入DCM時，樹脂沉在底部，與DCM溶液完全分層，通過延長反應(yīng)時間，樹脂慢慢被DCM溶脹開，溶液開始變得渾濁，30min后樹脂完全溶脹。

2.2 影響氨基酸偶聯(lián)的因素

標(biāo)準(zhǔn)的檢測現(xiàn)象應(yīng)為溶液亮黃，樹脂透明。若檢測時出現(xiàn)溶液暗黃、紅色、綠色，或樹脂出現(xiàn)藍雜、綠雜、黃等情況，說明氨基酸沒有偶聯(lián)上，需要重新偶聯(lián)。出現(xiàn)這些情況的原因可能是：

（1）反應(yīng)時間較短，氨基酸沒有完全偶聯(lián)，可通過延長一定的反應(yīng)時間，然后再檢測。檢測結(jié)果隨氨基酸偶聯(lián)時間的變化見表3。

表3 某個氨基酸偶聯(lián)時間的變化所產(chǎn)生的檢測結(jié)果Tab.3 Test result produced by the change of the coupling time of a certain amino acid

由表3可以得出，投料到反應(yīng)進行10min和20min時，檢測結(jié)果都不符合標(biāo)準(zhǔn)，說明該氨基酸沒有完全偶聯(lián)。當(dāng)反應(yīng)進行30min時，檢測結(jié)果符合標(biāo)準(zhǔn)，說明該氨基酸已經(jīng)完成偶聯(lián)，可以進行下一個氨基酸的偶聯(lián)。

（2）稱取氨基酸的量不夠，導(dǎo)致多肽不能完全偶聯(lián)。由于反應(yīng)過程可能伴隨副反應(yīng)發(fā)生，受反應(yīng)時間、縮合劑等因素的影響，會導(dǎo)致氨基酸沒有完全偶聯(lián)。即使偶聯(lián)上了，最終得到多肽的量并沒有達到目標(biāo)產(chǎn)物的量，即合成多肽的量不夠，因此，我們一般按氨基酸理論值的3倍進行投料。

（3）固體激活劑和液體激活劑選擇不正確。在發(fā)生反應(yīng)偶聯(lián)時，如果固體激活劑和液體激活劑沒有進行合理搭配或投料時所加的激活劑種類不同，都會導(dǎo)致氨基酸不能完成偶聯(lián)。激活劑的搭配和反應(yīng)時間的控制見表4。

表4 激活劑的搭配與反應(yīng)時間Tab.4 Activator mix and reaction time

在稱取氨基酸時，若所用的固體激活劑為TBTU和PyBOP，則需添加的液體激活劑為DIEA；若所采用的固體激活劑為HOBT，則所用的液體激活劑為DIC，且使用該激活劑時必須加熱。由于反應(yīng)時間過長會破壞多肽結(jié)構(gòu)，所以固定的固體激活劑和液體激活劑混合時需嚴(yán)格控制反應(yīng)時間。

（4）溶液里出現(xiàn)大量泡沫或沉底。這與N2閥門所開的大小有關(guān)，閥門開的太大或太小都會影響反應(yīng)結(jié)果，所以應(yīng)調(diào)節(jié)閥門，使N2通入量適中。

（5）未按照檢測標(biāo)準(zhǔn)進行檢測。添加檢測液的量適中，不能多加或少加。且必須正確把握檢測時間，一般檢測時間為150min，若超過150min，溶液會變黃或黑。則在氨基酸沒有偶聯(lián)上時，不能進行脫帽連接下一步反應(yīng)，應(yīng)用DMF清洗3遍，重新稱取沒有偶聯(lián)上的氨基酸的質(zhì)量，進行再次偶聯(lián)，直到該氨基酸偶聯(lián)上，再進行下一步反應(yīng)。

若檢測結(jié)果顯示氨基酸并沒有偶聯(lián)上，就進行了脫帽，那么，所合成的多肽就不是目標(biāo)肽。

2.3 質(zhì)譜鑒定分析

采用質(zhì)譜法對合成的多肽進行鑒定，得到該多肽的實際分子量，見圖2。

圖2 五勝肽質(zhì)譜檢測分析結(jié)果Fig.2 Analysis of matrixyl mass spectrometry

圖2為合成的五勝肽粗品的質(zhì)譜檢測分析結(jié)果。樣品中含有一個主成分、兩個次要成分及多個微量成分。

由圖2可知，樣品中主成分的分子量為802.26，而五勝肽理論分子量為802.1，相差了0.16（如果理論上的分子量和實際的分子量相差不超過1，則表示已合成多肽粗品）。該實驗結(jié)果與理論值基本相符。通過質(zhì)譜檢測分析得出，已成功制備五勝肽粗品，要得到五勝肽精產(chǎn)品，還需進行純化等處理。

3 結(jié)論

該實驗在氨基酸的偶聯(lián)過程中，使用了TBTU固體激活劑和DIEA液體激活劑，此類激活劑反應(yīng)速率快，無副反應(yīng)發(fā)生，操作簡單，無需加熱。且按標(biāo)準(zhǔn)稱料，正確把握反應(yīng)時間，嚴(yán)格按照多肽的合成過程進行，每一步反應(yīng)的結(jié)果都符合溶液亮黃，樹脂透明的檢測標(biāo)準(zhǔn)，使氨基酸完全偶聯(lián)。通過切割后，將樹脂切掉，再經(jīng)過離心沉淀，成功制得了五勝肽粗產(chǎn)品。最后經(jīng)過液質(zhì)聯(lián)用儀質(zhì)譜表征，為氨基酸保護及多肽的合成提供了實驗依據(jù)和理論參考。最終測得五勝肽的分子量為802.26，與理論值相一致。

該五勝肽的合成方法簡單方便，合成率高，可應(yīng)用于更多短肽的合成。人們可以按照想要合成的多肽次序和長度，探究更多肽的種類，使多肽的研究領(lǐng)域更為廣闊。