C2H2鋅指轉(zhuǎn)錄因子FpCzf7參與假禾谷鐮孢的生長和致病性

趙靜雅 彭夢雅 張時雨 單藝軒 邢小萍 施艷 李海洋 楊雪李洪連 陳琳琳

（河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院 小麥玉米作物學(xué)國家重點實驗室 河南省糧食作物協(xié)同創(chuàng)新中心，鄭州 450002）

假禾谷鐮孢（Fusarium pseudograminearum）引起的小麥莖基腐病是一種世界范圍內(nèi)廣泛發(fā)生的土傳病害，每年造成非常嚴(yán)重的產(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)損失［1-2］。2012年Li等［2］首次在中國河南省發(fā)現(xiàn)假禾谷鐮孢引起的小麥莖基腐病，近年來由于秸稈還田造成菌源積累和品種抗性差等原因，導(dǎo)致該病在中國黃淮和華東麥區(qū)廣泛蔓延分布，尤其是在黃淮麥區(qū)已成為威脅小麥生產(chǎn)的主要病害［3-4］。與其他鐮孢菌類似，假禾谷鐮孢產(chǎn)生的脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（DON）等毒素嚴(yán)重影響人和家畜的身體健康［5］，假禾谷鐮孢侵染小麥穂部引起赤霉病，引發(fā)食品安全問題。但是目前關(guān)于假禾谷鐮孢致病相關(guān)基因的研究報道還比較少。

轉(zhuǎn)錄因子（transcription factors）能夠結(jié)合特定的DNA位點，通過DNA-蛋白互作、蛋白-蛋白互作或者染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的改變來激活或抑制基因的轉(zhuǎn)錄。其中，C2H2鋅指（Cys2/His2 Zinc-Finger，CZF）轉(zhuǎn)錄因子是真核生物中普遍存在的一類龐大的轉(zhuǎn)錄因子家族，在人類中有700多個C2H2鋅指轉(zhuǎn)錄因子［6］，擬南芥（Arabidopsis thaliana）中有176個C2H2鋅指轉(zhuǎn)錄因子［7-8］，稻瘟菌（Magnaporthe oryzae）和禾谷鐮孢中分別鑒定到89和91個C2H2鋅指轉(zhuǎn)錄因子［9-10］。C2H2鋅指轉(zhuǎn)錄因子的生物學(xué)功能涉及廣泛，Cao等［11］分析了稻瘟菌中的47個C2H2基因的功能，發(fā)現(xiàn)有44個基因參與病原菌的生長、分生孢子產(chǎn)生、附著胞的形成或者致病性［9］；受Pmk1絲裂原活化蛋白激酶途徑調(diào)控的C2H2鋅指轉(zhuǎn)錄因子ZNF1通過參與脂滴和糖原的調(diào)動和降解影響稻瘟菌附著胞的發(fā)育，從而影響致病性［11］。

Son等［10］分析了禾谷鐮孢中91個C2H2鋅指轉(zhuǎn)錄因子的功能，鑒定到16個與赤霉病的發(fā)生相關(guān)；C2H2基因pcs1正調(diào)控禾谷鐮孢的無性和有性孢子的產(chǎn)生，基因微陣列實驗發(fā)現(xiàn)G蛋白相關(guān)途徑、過氧化物酶激活、核糖體生物合成以及RNA結(jié)合等途徑的基因依賴于pcs1大量富集［12］。此外，在其他鐮孢菌中也有多種C2H2鋅指轉(zhuǎn)錄因子的功能進(jìn)行報道，例如，C2H2轉(zhuǎn)錄因子FolCzf1對尖孢鐮孢番茄?；偷姆稚咦赢a(chǎn)生、次級代謝以及早期侵染是必須的［13］；C2H2鋅指轉(zhuǎn)錄因子對輪枝鐮孢孢子囊的產(chǎn)生非常關(guān)鍵，并通過調(diào)控下游的FvSTUA基因影響分生孢子的產(chǎn)生［14］。

前期，我們報道了C2H2鋅指轉(zhuǎn)錄因子FpCzf14對假禾谷鐮孢分生孢子的產(chǎn)生非常關(guān)鍵［15］。本研究在假禾谷鐮孢中鑒定到一個編碼C2H2鋅指轉(zhuǎn)錄因子的基因FpCzf7，其參與了假禾谷鐮孢的菌絲生長、分生孢子產(chǎn)生和致病性，相關(guān)研究結(jié)果將為進(jìn)一步解析C2H2鋅指轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控假禾谷鐮孢致病過程的分子機(jī)理提供基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

假禾谷鐮孢菌株WZ2-8A由河南農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院植物病害監(jiān)測與防控課題組分離自田間病株，經(jīng)鑒定后保存。小麥品種矮抗58由國家小麥工程技術(shù)研究中心提供，大麥品種啤酒大麥購自秋樂種業(yè)。大腸桿菌感受態(tài)菌株DH5α和質(zhì)粒pKOV21（含有潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因HPH），質(zhì)粒pKNTG，均由本實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1FpCzf7基因的鑒定與其在侵染階段的表達(dá)（實時熒光定量PCR） 根據(jù)禾谷鐮孢中已知的轉(zhuǎn)錄因子［10］，利用Blastp的方法在假禾谷鐮孢中鑒定編碼C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子的基因FPSE_08586，并在NCBI上下載其在F. pseudograminearumCS3096菌株中的基因與蛋白序列。利用SMART及Pfam數(shù)據(jù)庫預(yù)測其蛋白的結(jié)構(gòu)域。采用實時熒光定量PCR方法檢測FpCzf7在侵染階段的表達(dá)水平，F(xiàn)pTEF1基因作為內(nèi)參，所用引物在表1中列出。在PDA培養(yǎng)基中將野生型菌株培養(yǎng)3 d，在菌落邊緣取兩個5 mm的菌餅放置在CMC液體培養(yǎng)基中，25℃、150 r/min搖培4 d獲得分生孢子。用10 μL分生孢子懸浮液（1×107/mL）侵染小麥幼苗的胚芽鞘，分別取侵染18 h、30 h、2 d、3 d、5 d、7 d的發(fā)病區(qū)，立即放于液氮中凍存，研磨后用RNAprep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（天根，北京）提取總RNA。利用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒（寶生物，大連）進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。

將反轉(zhuǎn)錄獲得的cDNA進(jìn)行熒光定量PCR，根據(jù)目的基因序列用軟件primer5.0和DNAMEN設(shè)計引物RTF和RTR，引物列于表1中，以FpTEF1為內(nèi)參。反應(yīng)體系為：TB Green Premix Ex Taq Ⅱ 6 μL，引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 4 μL。反應(yīng)程序：95℃/2 min；在95℃ /15 s，60℃/ 15 s，68℃/20 s，40個循環(huán)；在95℃/15 s，60℃/15 s和95℃/15 s得到融解曲線。

表1 本研究用到的引物Table 1 Primers used in this study

1.2.2FpCzf7基因敲除、回補(bǔ)及檢測 假禾谷鐮孢野生型WZ2-8A菌株在PDA培養(yǎng)基上、25℃活化，用CTAB法提取基因組DNA。用Split-PCR方法，以假禾谷鐮孢野生型基因組DNA為模板，經(jīng)過3輪PCR擴(kuò)增構(gòu)建同源重組序列進(jìn)行基因敲除。所用引物列于表1中。第一輪PCR，以假禾谷鐮孢野生型基因組DNA為模板，分別用引物F1+R1和F2+R2擴(kuò)增，得到964 bp的FpCzf7上游片段A1和997 bp的下游片段A2，以質(zhì)粒pKOV21為模版，用引物HYG/F+HYG/R擴(kuò)增1 350 bp的潮霉素片段H。PCR體系中含有25 μL Premix Taq，正反向引物各1 μL，100 ng假禾谷鐮孢基因組DNA，ddH2O補(bǔ)足50 μL。PCR反應(yīng)條件如下：在94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸1 min（根據(jù)片段大小不同延伸時間不同，1 000 bp/min），循環(huán)35次；72℃再延伸10 min。第二輪PCR，以第一輪PCR產(chǎn)物為模板，按照片段濃度比例A1∶A2∶HPH=1∶1∶3混合。反應(yīng)體系為5 μL 10×LA Taq buffer，2 μL dNTPs，0.2 μL LA Taq，2 μL上游片段A1，2 μL下游片段A2，6 μLHPH基因片段，32.8 μL ddH2O。PCR反應(yīng)條件如下：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸3 min 30 s，15個循環(huán)。第三輪PCR，以第二輪PCR產(chǎn)物為模板，用引物F1+HY/R和YG/F+R2，分別獲得1 762 bp的FpCzf7和HPH上游融合片段A1H1及1 928 bp的HPH和FpCzf7下游融合片段H2A2。PCR反應(yīng)體系：25 μL Premix Taq，2 μL引物，2 μL第二輪產(chǎn)物，ddH2O補(bǔ)足50 μL。PCR反應(yīng)程序如下：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s、58℃退火30 s、72℃延伸2 min，35個循環(huán)；72℃再延伸10 min。利用PCR產(chǎn)物純化回收試劑盒（諾唯贊，南京）對PCR產(chǎn)物純化回收，通過PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法將A1H1和H2A2導(dǎo)入假禾谷鐮孢野生型菌株中［17］。

利用潮霉素抗性篩選陽性轉(zhuǎn)化子，提取基因組DNA進(jìn)行PCR檢測。引物H850F+H852R檢測潮霉素基因；F3+H855R和H856F+R3分別用于FpCzf7上游、下游與潮霉素的融合；G1+G2用于FpCzf7基因的檢測。擴(kuò)增去掉終止密碼子的FpCzf7基因及其上游約1 500 bp左右的啟動子序列，構(gòu)建到pKNTG載體上，通過PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入Δfpczf7-T1中，通過PCR檢測回補(bǔ)轉(zhuǎn)化子。

1.2.3 生長測定 為了檢測FpCzf7對假禾谷鐮孢菌絲生長和菌落特征的影響，將突變體Δfpczf7、回補(bǔ)菌株Δfpczf7-cp和野生型菌株WT在PDA平板上活化。然后，用打孔器在菌落邊緣打孔（直徑5 mm），取菌餅接種在裝有15 mL新鮮PDA平板的中央，放置在25℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)，3 d后測量菌落大小，并拍照。在顯微鏡（Nikon Eclipse Ti-S）下觀察菌絲體形態(tài)。

1.2.4 分生孢子的產(chǎn)生及萌發(fā) 在PDA培養(yǎng)基上將Δfpczf7、Δfpczf7-cp和WT菌株培養(yǎng)3 d，分別在菌落邊緣取兩個直徑5 mm的菌餅接種在60 mL CMC中，25℃、150 r/min搖培4 d。通過一層miracloth濾布過濾獲得分生孢子，用血球計數(shù)板計數(shù)并拍照。取適量無菌水將孢子稀釋至相同濃度（~5×105個/mL），在25℃條件下萌發(fā)3 h，然后在顯微鏡下分別觀察孢子的萌發(fā)情況，每個生物學(xué)重復(fù)數(shù)1 000個分生孢子，以100個孢子為一組，總共10組，計算分生孢子的萌發(fā)率并拍照。

1.2.5 致病性測定 為了研究假禾谷鐮孢對大麥葉片和小麥胚芽鞘的致病性，分別在Δfpczf7、Δfpczf7-cp和WT菌株的菌落邊緣取兩個直徑5 mm的菌餅放置在大麥葉片上，黑暗保濕培養(yǎng)24 h后去掉菌餅，然后在16 h光照、8 h黑暗中培養(yǎng)2 d后記錄葉片病斑直徑并拍照。分別在菌落邊緣取一個5 mm的菌餅放置在小麥胚芽鞘上，黑暗保濕培養(yǎng)24 h后去掉菌餅，繼續(xù)培養(yǎng)2 d記錄病斑長度并拍照。盆栽接種試驗方法，將活化好的Δfpczf7、Δfpczf7-cp和WT菌絲塊接入到小米培養(yǎng)基上進(jìn)行擴(kuò)繁，按0.5%的比例將長滿菌絲的小米培養(yǎng)基混合在無菌土中，每缽種10粒小麥種子。16 h光照、8 h黑暗中培養(yǎng)10 d后記錄小麥的生長狀況和發(fā)病程度。小麥莖基腐病采用Poole等［18］的分級標(biāo)準(zhǔn)，0級：植株未發(fā)??；1級：地中莖明顯變褐或第一葉鞘出現(xiàn)輕微癥狀；3級：第一葉鞘明顯變褐，但葉鞘未變黑；5級：第一葉鞘變黑或者第二葉鞘變褐；7級：第三葉鞘出現(xiàn)變褐癥狀，或植株因發(fā)病而發(fā)育遲緩或接近死亡；9級：植株因發(fā)病而死亡。病情指數(shù)=∑（病情等級×各病級發(fā)病株數(shù)）/（調(diào)查總株數(shù)×分級標(biāo)準(zhǔn)中最高級別數(shù)）×100，使用t檢驗分析數(shù)據(jù)。

為測定假禾谷鐮孢對小麥穂部的致病性，用分生孢子懸浮液侵染揚花期的小麥穗。用CMC液體培養(yǎng)基搖培獲得Δfpczf7、Δfpczf7-cp和WT菌株的分生孢子，將孢子濃度調(diào)至5×106個/mL備用。將小麥穗中上部的穎殼剪傷，每穗剪傷兩處，取10 μL孢子懸浮液接種至剪傷處，每個假禾谷鐮孢菌株接種30穗。接種后噴灑滅菌蒸餾水并套袋保濕3 d，并在接種20 d后調(diào)查發(fā)病情況。

1.2.6 DON毒素測定 在小米培養(yǎng)基上擴(kuò)繁Δfpczf7和WT菌株，25℃黑暗培養(yǎng)10 d至小米表面完全長滿菌。以接種無菌PDA塊培養(yǎng)相同時間的小米培養(yǎng)基作為空白對照（CK）。取5 g小米樣品研磨至粉末狀，利用北京華安麥科生物技術(shù)有限公司的嘔吐毒素ELISA檢測試劑盒（HEM0896），參照說明書操作，檢測DON即嘔吐毒素的含量。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 數(shù)據(jù)采用Excel工作表和SPSS軟件分析。表型及致病性測定實驗至少進(jìn)行3次，每次3-5個重復(fù)，利用方差分析和t檢驗分析數(shù)據(jù)，P<0.05具有統(tǒng)計意義。

2 結(jié)果

2.1 FpCzf7基因的鑒定與轉(zhuǎn)錄分析

根據(jù)禾谷鐮孢中已知的轉(zhuǎn)錄因子［10］，利用Blastp的方法在假禾谷鐮孢中鑒定到一個編碼C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子的基因FPSE_08586，根據(jù)蛋白同源性將其命名為FpCzf7。該基因全長2 009 bp，包含2個內(nèi)含子，編碼含有635個氨基酸的蛋白質(zhì)，包含6個保守的C2H2型鋅指基序（圖1-A）。通過實時熒光定量PCR方法，分析FpCzf7在假禾谷鐮孢侵染階段的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)FpCzf7在菌絲中的表達(dá)量較高，在侵染初期表達(dá)量降低，但是在侵染后期的表達(dá)量與菌絲中類似。猜測其在假禾谷鐮孢的菌絲生長和侵染擴(kuò)展過程中起作用（圖1-B）。

圖1 FpCzf7的結(jié)構(gòu)域及基因轉(zhuǎn)錄水平Fig. 1 Domains and expression levels of FpCzf7 in F. pseudograminearum

2.2 FpCzf7基因缺失菌株的獲得

為了分析FpCzf7在假禾谷鐮孢中的生物學(xué)功能，利用split PCR的方法擴(kuò)增獲得FpCzf7上游-潮霉素以及潮霉素-FpCzf7下游的融合片段（圖2-A）。通過PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化方法將重組片段轉(zhuǎn)入假禾谷鐮孢WZ2-8A中，利用潮霉素抗性篩選和PCR驗證FpCzf7缺失突變體。如圖2-B所示，在3個候選轉(zhuǎn)化子中均檢測到潮霉素（H）、FpCzf7上游-潮霉素（F）以及潮霉素-FpCzf7下游（R）的融合片段，但是無法擴(kuò)增到FpCzf7基因，由此獲得FpCzf7被潮霉素基因置換掉的菌株。克隆FpCzf7基因全長及其上游1 518 bp的啟動子區(qū)域，構(gòu)建真核表達(dá)載體pKNTG，利用PEG介導(dǎo)的原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化的方法導(dǎo)入Δfpczf7-T1菌株，獲得FpCzf7基因回補(bǔ)的轉(zhuǎn)化子。

圖2 假禾谷鐮孢FpCzf7基因的敲除Fig. 2 FpCzf7 gene knockout in F. pseudograminearum

2.3 FpCzf7對假禾谷鐮孢的生長非常關(guān)鍵

為了分析FpCzf7的缺失對假禾谷鐮孢營養(yǎng)生長的影響。將活化的假禾谷鐮孢野生型、Δfpczf7、Δfpczf7-cp菌株轉(zhuǎn)接到PDA培養(yǎng)基上，25℃、黑暗培養(yǎng)3 d，觀察菌絲生長速率及菌落形態(tài)。結(jié)果顯示，與野生型和回補(bǔ)菌株相比，Δfpczf7突變體菌絲生長速度明顯減慢，氣生菌絲減少，無明顯的粉紅色色素積累（圖3-A、B）。顯微觀察菌絲的形態(tài)，發(fā)現(xiàn)Δfpczf7突變體菌絲的粗細(xì)和分支與野生型和回補(bǔ)菌株類似。以上結(jié)果說明，F(xiàn)pCzf7對假禾谷鐮孢的菌絲生長速率非常關(guān)鍵。

圖3 野生型（WT）、Δfpczf7和Δfpczf7-cp在PDA平板上生長的菌落和菌絲測定Fig. 3 Mycelia growth and morphology assays of WT，Δfpczf7 and Δfpczf7-cp on PDA plates

2.4 FpCzf7缺失突變體分生孢子產(chǎn)生減少

分別取活化的假禾谷鐮孢野生型、Δfpczf7和Δfpczf7-cp菌落邊緣菌餅，轉(zhuǎn)接到CMC培養(yǎng)液中誘導(dǎo)分生孢子的產(chǎn)生，25℃、黑暗、150 r/min搖培4 d后收集孢子。與野生型相比，Δfpczf7突變體分生孢子的數(shù)量下降了約35%，而回補(bǔ)菌株的產(chǎn)孢量可以恢復(fù)到野生型的水平（圖4-A、B）。假禾谷鐮孢野生型、Δfpczf7和Δfpczf7-cp產(chǎn)生的分生孢子形態(tài)及隔膜數(shù)無明顯差異（圖4-A）。

將假禾谷鐮孢野生型、Δfpczf7和Δfpczf7-cp的分生孢子在無菌水中刺激萌發(fā)，25℃、黑暗培養(yǎng)3 h后觀察結(jié)果，發(fā)現(xiàn)Δfpczf7與野生型和回補(bǔ)菌株分生孢子的萌發(fā)率無明顯差異（圖4-A、C）。以上結(jié)果說明FpCzf7可能參與了假禾谷鐮孢分生孢子的產(chǎn)生。

圖4 分生孢子產(chǎn)生和萌發(fā)測定Fig. 4 Conidia production and germination assays

2.5 FpCzf7的缺失影響假禾谷鐮孢的致病力

取活化的假禾谷鐮孢野生型、Δfpczf7和Δfpczf7-cp菌落邊緣菌餅，分別接種在大麥葉片和小麥胚芽鞘上，25℃、黑暗、保濕培養(yǎng)24 h后去掉菌絲塊，繼續(xù)保濕培養(yǎng)2 d，觀察植物的發(fā)病。結(jié)果顯示，野生型和回補(bǔ)菌株在大麥葉片和小麥胚芽鞘上均能侵染并形成明顯擴(kuò)展的病斑，而Δfpczf7突變體侵染的植物病斑明顯減小（圖5）。

為了進(jìn)一步確定FpCzf7缺失突變體的致病力，利用盆栽實驗?zāi)M大田小麥莖基腐病的發(fā)生。萌發(fā)的小麥種植到0.5%的菌土中，10 d后觀察小麥的出芽率、株高和莖基腐病的發(fā)生情況（圖6-A）。與未接種的小麥相比，野生型和回補(bǔ)菌株接種的小麥出苗率較低，小麥生長明顯減慢，莖基部有明顯的褐色病斑。而Δfpczf7突變體接種的小麥生長與對照類似，莖基部發(fā)病明顯減輕（圖6-A、B）。利用假禾谷鐮孢野生型、Δfpczf7和Δfpczf7-cp的孢子懸浮液接種揚花期小麥穗，接種20 d后，與假禾谷鐮孢野生型和回補(bǔ)菌株相比，Δfpczf7突變體引起的赤霉病癥狀明顯減輕（圖6-C）。以上結(jié)果說明FpCzf7的缺失導(dǎo)致假禾谷鐮孢的致病性明顯降低。

2.6 FpCzf7的缺失影響假禾谷鐮孢DON毒素的產(chǎn)生

與其他鐮孢菌類似，假禾谷鐮孢在侵染過程中也可產(chǎn)生大量DON毒素。利用DON毒素ELISA檢測試劑盒，檢測了WT和Δfpczf7菌株DON毒素的產(chǎn)生，無菌小米培養(yǎng)基為空白對照（CK）。結(jié)果顯示，野生型菌株可以產(chǎn)生大量的DON毒素，長滿菌絲的小米中DON含量可達(dá)到176.89 μg/kg。同等條件下，長滿Δfpczf7菌絲的小米中DON毒素含量僅為17.1 μg/kg（圖7）。以上結(jié)果說明，F(xiàn)pCzf7的缺失影響假禾谷鐮孢DON毒素的產(chǎn)生，可能是其致病性降低的原因之一。

圖 5 大麥葉片和小麥胚芽鞘接種Fig. 5 Inoculation on barley leaves and wheat coleoptiles

圖 6 小麥盆栽和小麥穗接種實驗Fig. 6 Experiments of pot-culture and wheat heads inoculation

圖 7 DON毒素的產(chǎn)生Fig. 7 DON production

3 討論

鋅指轉(zhuǎn)錄因子是真核生物中最大的轉(zhuǎn)錄因子家族之一，根據(jù)組氨酸和半胱氨酸的位置及數(shù)量，可以分為C2H2、C2HC、C2HC5、C2C2、CCCH、C3HC4、C4、C4HC3、C6和C8［19］。其中C2H2鋅指轉(zhuǎn)錄因子在真菌中調(diào)控多種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及生物學(xué)過程。已有研究發(fā)現(xiàn)，C2H2同源蛋白在不同真菌中具有不同的調(diào)控作用。例如，Msn2和Msn4在釀酒酵母中通過應(yīng)激響應(yīng)元件激活基因的轉(zhuǎn)錄以應(yīng)對逆境脅迫，而其同源蛋白在白色念珠菌的脅迫響應(yīng)過程中無明顯作用［20-21］；番茄尖孢鐮孢C2H2鋅指轉(zhuǎn)錄因子FolCzf1及其在禾谷鐮孢和稻瘟菌中的同源蛋白GzC2H003和Gcf3均參與病原菌的營養(yǎng)生長和分生孢子產(chǎn)生。此外，F(xiàn)olCzf1還調(diào)控番茄尖孢鐮孢分生孢子的形態(tài)、次級代謝和致病性，而稻瘟菌Gcf3的缺失不影響色素的合成和附著胞的功能，禾谷鐮孢GzC2H003缺失突變體DON毒素的合成與野生型相比無明顯變化［9-10，13］。

研究者對假禾谷鐮孢的關(guān)注相對較晚，其與禾谷鐮孢的親緣關(guān)系非常近，曾一度被作為禾谷鐮孢的一個類群，后來通過分子手段將其單獨列為一個種［22-23］。隨著研究的深入，發(fā)現(xiàn)假禾谷鐮孢與禾谷鐮孢在多個方面有明顯差異，比如假禾谷鐮孢有性生殖屬于異宗配合，且在實驗室條件下很難獲得其子囊殼；禾谷鐮孢在溫暖潮濕的環(huán)境下容易侵染，而假禾谷鐮孢更偏向在干旱冷涼地區(qū)侵染小麥造成小麥莖基腐?。?］。猜測假禾谷鐮孢可能與禾谷鐮孢具有不同的致病調(diào)控機(jī)制，由此研究假禾谷鐮孢致病的分子機(jī)制，不僅為病害防治提供理論基礎(chǔ)，也為了解鐮孢菌的致病性分化提供依據(jù)。

本研究中，在假禾谷鐮孢中鑒定到一個C2H2鋅指轉(zhuǎn)錄因子FpCzf7，可以穩(wěn)定高表達(dá)，與野生型和回補(bǔ)菌株相比，F(xiàn)pCzf7缺失突變體菌絲生長明顯減慢、分生孢子產(chǎn)生減少、對大麥和小麥的致病性顯著降低、DON合成減少。在禾谷鐮孢中，其同源基因GzC2H007的缺失突變體完全不能產(chǎn)生有性孢子和無性孢子、不能產(chǎn)生DON毒素、致病性完全喪失，但是對菌絲生長的影響較?。?0］。對應(yīng)同源基因缺失突變體的相關(guān)表型，F(xiàn)pCzf7在真菌致病性和DON合成中的表型一致，但是對其生長和產(chǎn)孢的影響具有明顯分化。本研究可為進(jìn)一步了解其在假禾谷鐮孢生長、產(chǎn)孢和致病過程中的作用機(jī)制提供基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

C2H2鋅指轉(zhuǎn)錄因子FpCzf7的缺失導(dǎo)致假禾谷鐮孢的菌絲生長、分生孢子產(chǎn)生、致病性和DON毒素產(chǎn)生均明顯降低，推測其參與假禾谷鐮孢的生長、產(chǎn)孢和致病性。研究結(jié)果將為進(jìn)一步解析FpCzf7的靶標(biāo)及其調(diào)控病原菌致病過程的機(jī)制提供信息。