敲除msn2對(duì)米曲霉生長(zhǎng)和發(fā)酵產(chǎn)曲酸的影響

史亞楠 王德培，3 王一川 周昊 薛鮮麗，2

（1. 天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院，天津 300450；2. 工業(yè)發(fā)酵微生物教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，天津 300450；3. 天津市微生物代謝與發(fā)酵過(guò)程控制技術(shù)工程中心，天津 300457；4. 日照金禾生化集團(tuán)股份有限公司，日照 276899）

曲酸（kojic acid）化學(xué)名為5-羥基-2-羥甲基-1，4-吡喃酮，結(jié)構(gòu)與葡萄糖相似，分子式C6H6O4，相對(duì)分子量142.11，純品為無(wú)色柱狀晶體，是具有還原性的有機(jī)弱酸［1-3］，與三氯化鐵反應(yīng)呈特殊的紅色［4］。曲酸具有抗菌性、抗氧化性以及抑制酪氨酸酶活性［5-6］，在食品釀造、化妝品和醫(yī)藥領(lǐng)域占有重要應(yīng)用價(jià)值。據(jù)調(diào)查國(guó)內(nèi)現(xiàn)階段曲酸需求量為500-600 t/年，而國(guó)內(nèi)曲酸產(chǎn)量?jī)H為200 t/年，進(jìn)口曲酸價(jià)格昂貴。因此預(yù)測(cè)，未來(lái)曲酸將持續(xù)保持市場(chǎng)需求熱度和較高的利潤(rùn)回報(bào)［7-10］。天然曲酸是來(lái)源于曲霉屬利用糖類(lèi)發(fā)酵產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，產(chǎn)曲酸菌集中于米曲霉（Aspergillus oryzae）和黃曲霉（Aspergillus flavus），而黃曲霉因可能產(chǎn)生黃曲霉毒素而被淘汰，米曲霉則成為發(fā)酵曲酸主要微生物。

msn2基因是編碼C2H2鋅指結(jié)構(gòu)蛋白［11］的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，發(fā)現(xiàn)于釀酒酵母中，之后在構(gòu)巢曲霉和黃曲霉等多種絲狀真菌均發(fā)現(xiàn)有同源基因，其編碼蛋白可通過(guò)結(jié)合基因的啟動(dòng)子區(qū)域的STRE基序來(lái)調(diào)節(jié)壓力響應(yīng)基因表達(dá)［12-13］。當(dāng)真菌細(xì)胞內(nèi)msn2基因缺失后，發(fā)現(xiàn)其對(duì)高滲、高溫、高鹽、強(qiáng)光等極端環(huán)境的適應(yīng)性顯著下降。Chen等［14］對(duì)Msn2/4的下游靶基因進(jìn)行了全面的研究發(fā)現(xiàn)，msn2/4突變株能夠直接誘導(dǎo)編碼抗氧化酶的基因表達(dá)，如sod1和sod2、prx1和tsa2。Chang等［15］敲除黃曲霉和寄生曲霉中msn2同源基因msnA，該基因缺失使菌株代謝的黃曲霉毒素量均有所提高，且曲酸產(chǎn)量分別提高4倍、29倍。

msn2自身轉(zhuǎn)錄活性受蛋白激酶A（protein kinase A，PKA）和雷帕霉素調(diào)控。在滲透壓脅迫的狀態(tài)下，轉(zhuǎn)錄因子Msn2被蛋白激酶HOG1磷酸化，從而結(jié)合到ctt1（編碼胞質(zhì)過(guò)氧化氫酶基因）和hsp12（編碼熱休克蛋白基因）啟動(dòng)子上，然后通過(guò)與RNA聚合酶Ⅱ全酶相互作用誘導(dǎo)轉(zhuǎn)錄。Msn2會(huì)激活YAP4表達(dá)，隨后YAP4又激活gcy1、dcs2和gpp2轉(zhuǎn)錄［16］，從而使蛋白酶、熱激蛋白、其他與代謝平衡有關(guān)的基因和及生物分子的修復(fù)與清除相關(guān)的編碼基因大幅度上調(diào)。曲酸是部分曲霉產(chǎn)生的次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有易氧化特性，成為緩解細(xì)胞內(nèi)活性氧壓力的一種抗氧化物，所以msn2基因?qū)τ诿浊巩a(chǎn)生曲酸可能有一定的調(diào)節(jié)功能。

本文以產(chǎn)曲酸的米曲霉3.042為出發(fā)菌株，利用基因工程手段敲除其msn2基因探討該基因?qū)γ浊股L(zhǎng)及合成曲酸的影響，挖掘該基因?qū)γ浊乖诓煌瑵B透壓和過(guò)氧化物存在下的調(diào)節(jié)功能，為進(jìn)一步提高米曲霉曲酸的產(chǎn)量提供有意義的借鑒。

1 材料與方法

1.1 材料

本實(shí)驗(yàn)所用米曲霉A. oryzae3.042（CGMCC No.3.00951）菌株、米曲霉pyrG缺陷型菌株g-1和根癌農(nóng)桿菌AGL1均由天津科技大學(xué)生物工程學(xué)院生化過(guò)程與技術(shù)研究室保藏。斜面培養(yǎng)基：CM培養(yǎng)基添加0.12%尿苷和0.12%尿嘧啶來(lái)傳代營(yíng)養(yǎng)缺陷型［17］；初篩培養(yǎng)基：CM培養(yǎng)基添加100 μg/mL 氨芐、200 μmol/L頭孢噻肟鈉；復(fù)篩培養(yǎng)基：CM添加25 mmol/L過(guò)氧化氫。

1.2 方法

1.2.1msn2敲除質(zhì)粒pk1的構(gòu)建 以p40為出發(fā)質(zhì)粒，米曲霉3.042基因組為模板，以各自引物擴(kuò)增得到：msn2左側(cè)上游同源臂msn2L，pyrG和msn2右側(cè)下游同源臂msn2R。然后將p40和片段msn2L利用EcoR I和BamH I雙酶切連接得到p40-msn2L，p40-msn2L和片段msn2R利用XbaI和Hind Ⅲ雙酶切連接得到p40-msn2L-msn2R，將p40-msn2L-msn2R和片段pyrG通過(guò)KpnI和XbaI雙酶切連接得到質(zhì)粒pk1。并化轉(zhuǎn)至大腸桿菌。以大腸桿菌菌液為模板驗(yàn)證pk1質(zhì)粒敲除框全長(zhǎng)。提取質(zhì)粒送至華大公司進(jìn)行基因測(cè)序比對(duì)。

1.2.2 根癌農(nóng)桿菌侵染營(yíng)養(yǎng)缺陷型菌株 將pk1質(zhì)粒電轉(zhuǎn)進(jìn)農(nóng)桿菌AGL1感受態(tài)細(xì)胞，按照文獻(xiàn)所述方法孵育農(nóng)桿菌［18］，之后將農(nóng)桿菌與米曲霉g-1新鮮孢子置于IM固體培養(yǎng)基上覆蓋的硝酸纖維膜上，25℃避光共培養(yǎng)48 h。待共培養(yǎng)過(guò)后用無(wú)菌生理鹽水將米曲霉孢子從膜上洗到初篩培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)60 h，再挑單菌落至復(fù)篩培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)48 h，最后挑選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行提取基因組驗(yàn)證。

1.2.3 敲除msn2基因的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的篩選 待共培養(yǎng)過(guò)后用無(wú)菌生理鹽水將米曲霉孢子從膜上洗到初篩培養(yǎng)基上30℃培養(yǎng)60 h，再挑單菌落至復(fù)篩培養(yǎng)基30℃培養(yǎng)48 h，最后挑選轉(zhuǎn)化子進(jìn)行提取基因組驗(yàn)證，分別以Yz-F1和Yz-R1驗(yàn)證敲除框（msn2LpyrG-msn2R）的全長(zhǎng)，以Yz-F2和Yz-R2驗(yàn)證msn2L上游到pyrG中間部分。

1.2.4 孢子計(jì)數(shù) 分別將不同的新鮮米曲霉菌落，用同一打孔器取3個(gè)相同面積的菌落培養(yǎng)物，裝入帶有玻璃珠的無(wú)菌三角瓶?jī)?nèi)，加入一定量0.9%生理鹽水，充分振蕩30 min，經(jīng)漏斗過(guò)濾后獲得孢子懸液。稀釋10倍后通過(guò)血球計(jì)數(shù)板計(jì)算孢子濃度。

孢子濃度（個(gè)/mL）=5個(gè)中格中孢子數(shù)之和/80×400×104×10

式中4×4小格為一中格；80為計(jì)數(shù)小格總數(shù)；400為計(jì)數(shù)室所有方格總數(shù)；104為大方格的體積個(gè)0.1 mm3=0.1 μL；10為稀釋倍數(shù)。

1.2.5 轉(zhuǎn)化子耐受性試驗(yàn) 將稀釋至2×107個(gè)/mL的新鮮米曲霉孢子懸液取1 μL點(diǎn)種到CM培養(yǎng)基及CM培養(yǎng)基添加15、25、30 mmol/L過(guò)氧化氫，30℃培養(yǎng)60 h。同時(shí)點(diǎn)種到CM培養(yǎng)基及CM培養(yǎng)基其中葡萄糖濃度分別為10%、15%，上放置在30℃培養(yǎng)48 h。觀察菌株對(duì)過(guò)氧化氫和高糖的耐受性。

1.2.6 轉(zhuǎn)化子搖瓶曲酸發(fā)酵 將正確米曲霉轉(zhuǎn)化子接種于CM斜面30℃培養(yǎng)6 d得到新鮮孢子，搖瓶發(fā)酵接種量為3.3×105個(gè)/mL，33℃，轉(zhuǎn)速250 r/min，發(fā)酵7 d。曲酸測(cè)定利用硫酸鐵顯色法［4］。

1.2.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

1.2.7.1 總RNA的提取 分別取發(fā)酵3 d、6 d的米曲霉3.042、g-5菌絲，無(wú)菌水離心洗滌3遍后用濾紙將水分?jǐn)D干，液氮研磨直至菌絲成白色細(xì)粉末狀，將研磨好的粉末分裝于1.5 mL無(wú)菌EP管中，后續(xù)步驟見(jiàn)OMEGA生物技術(shù)公司Fungal RNA Kit試劑盒（目錄號(hào)：R6840）說(shuō)明書(shū)。

1.2.7.2 逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA 加樣體系見(jiàn)百邁客生物技術(shù)公司1st Strand cDNA Synthesis Kit試劑盒。

1.2.7.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 將上述cDNA稀釋2倍作為模板，加樣體系見(jiàn)諾唯贊生物技術(shù)公司SYBR qPCR Master Mix試劑盒。根據(jù)引物設(shè)計(jì)原則和要求設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)所需的引物見(jiàn)表1，引物合成均由金唯智公司完成。

表1 RT-qPCR 的引物Table 1 RT-qPCR primers

2 結(jié)果

2.1 msn2基因敲除質(zhì)粒pk1的構(gòu)建及msn2敲除轉(zhuǎn)化子的篩選

構(gòu)建pk1質(zhì)粒的目的是敲除米曲霉中的msn2基因。以米曲霉3.042的基因組DNA為模板，PCR分別擴(kuò)增msn2基因的上下游序列msn2L（1 032 bp）和msn2R（1 024 bp）以及pyrG基因片段（1 650 bp），通過(guò)相應(yīng)的酶切連接方法構(gòu)建pk1質(zhì)粒。pk1質(zhì)粒并通過(guò)PCR及測(cè)序驗(yàn)證確定成功構(gòu)建，質(zhì)粒模式圖如圖1-A所示。

如圖1-B所示，pk1質(zhì)粒上的msn2同源重組臂替換米曲霉的msn2基因，即獲△msn2菌株，其中pk1質(zhì)粒上敲除msn2的左右臂msn2L-arm和msn2Rarm之間的pyrG可以替換米曲霉3.042基因組上909 bp的msn2片段。通過(guò)轉(zhuǎn)化子在平板上的菌落形態(tài)觀察及PCR驗(yàn)證，篩選msn2敲除的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。

如圖1-C所示，其中紅色圈中的5號(hào)轉(zhuǎn)化子（即g-5）菌落形態(tài)發(fā)生很明顯的變化，選擇其與另外兩個(gè)轉(zhuǎn)化子3號(hào)和4號(hào)進(jìn)行PCR驗(yàn)證。如圖1-D所示，在復(fù)篩培養(yǎng)基上正常生長(zhǎng)的轉(zhuǎn)化子進(jìn)行基因組驗(yàn)證。以Yz-F1和Yz-R1驗(yàn)證敲除框（msn2L-pyrG-msn2R）的全長(zhǎng)3 706 bp，電泳圖顯示5號(hào)轉(zhuǎn)化子正好有與理論大小一致的單一條帶，3號(hào)轉(zhuǎn)化子除目的條帶外還有原始msn2的條帶，說(shuō)明3號(hào)轉(zhuǎn)化子為隨機(jī)插入，4號(hào)轉(zhuǎn)化子未擴(kuò)增出目的條帶。為了進(jìn)一步驗(yàn)證5號(hào)轉(zhuǎn)化子的正確性，以Yz-F2和Yz-R2驗(yàn)證msn2L上游到pyrG中間部分，電泳圖6泳道顯示2.6 kb的條帶即為目的條帶，說(shuō)明5號(hào)（g-5）轉(zhuǎn)化子為msn2被敲除的陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。g-5轉(zhuǎn)化子傳10代確定其遺傳穩(wěn)定性。

圖1 質(zhì)粒pk1的構(gòu)建及△msn2菌株的篩選Fig.1 Construction of plasmid pk1 and screening of △msn2 strain

2.2 g-5菌株生長(zhǎng)形態(tài)觀察

將3.042與g-5菌株孢子懸液稀釋至2×107個(gè)孢子/mL，各點(diǎn)種孢子懸液1 μL到CM培養(yǎng)基平板，放置在30℃培養(yǎng)箱，在24、36、48 h觀察其生長(zhǎng)形態(tài)，結(jié)果如表2所示?？傮w來(lái)看，兩株菌在24 h開(kāi)始萌發(fā)產(chǎn)生白色菌絲，36 h從菌落中央到邊緣白色菌絲越來(lái)越致密，菌落中心產(chǎn)黃綠色孢子，48 h孢子成熟顏色深綠；3.042菌絲向外發(fā)散菌落呈圓形，氣生菌絲較多，邊緣白色菌絲致密，48 h菌落直徑為2.8 cm孢子量（9.0±0.4）×107個(gè)/mL（計(jì)算方法見(jiàn)1.2.4）；g-5菌落整體呈聚縮狀，邊緣白色菌絲明顯較短，在36 h產(chǎn)孢相較于野生型來(lái)說(shuō)顏色明顯更深且占總面積比例更高，48 h菌落直徑為1.1 cm孢子量（3.6±0.35）×107個(gè)/mL。通過(guò)在CM培養(yǎng)基不同時(shí)間生長(zhǎng)觀察明顯發(fā)現(xiàn)，g-5轉(zhuǎn)化子菌絲生長(zhǎng)弱，菌落直徑減小，呈現(xiàn)菌落聚縮的狀態(tài)，孢子發(fā)育提前，而且孢子老化速度快，最終孢子產(chǎn)量較3.042下降60%。

表2 米曲霉3.042和g-5菌株生長(zhǎng)形態(tài)觀察Table 2 Growth morphology of Aspergillus oryzae 3.042 and g-5 strain

2.3 轉(zhuǎn)化子耐受性分析

2.3.1 過(guò)氧化氫耐受性 將3.042與g-5菌株孢子懸液稀釋至2×107個(gè)孢子/mL，各點(diǎn)種懸液1 μL到含15、25、30 mmol/L的H2O2CM培養(yǎng)基平板，30℃培養(yǎng)48 h，結(jié)果如表3所示，g-5菌株在含15 mmol/L到30 mmol/L的H2O2CM培養(yǎng)基中都能正常萌發(fā)，且在48 h生長(zhǎng)出黃綠色孢子。但對(duì)照菌株3.042在24 h僅于15 mmol/L的H2O2CM培養(yǎng)基中萌發(fā)，在30 mmol/L的H2O2CM培養(yǎng)基中不能萌發(fā)生長(zhǎng)，在25 mmol/L的H2O2CM培養(yǎng)基中48 h才剛剛萌發(fā)，白色氣生菌絲由發(fā)散狀向外呈圓形生長(zhǎng)，48 h仍未產(chǎn)孢，延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間到72 h也不生孢子。

表3 米曲霉3.042和g-5菌株的H2O2耐受性Table 3 H2O2 tolerance of A. oryzae 3.042 and g-5 strain

△msn2菌株g-5在過(guò)氧化氫平板呈聚縮狀生長(zhǎng)，白色菌絲致密，在48 h產(chǎn)孢成熟顏色深綠，在30 mmol/L的H2O2下仍然可以萌發(fā)生長(zhǎng)，但菌落直徑較無(wú)H2O2平板減小57%，說(shuō)明g-5號(hào)菌株雖然可以具有較好的H2O2耐受性，但其生長(zhǎng)依然會(huì)受到較大的影響，生長(zhǎng)速度和形態(tài)受到H2O2的抑制。

2.3.2 高糖耐受性 將稀釋至2×107個(gè)/mL的米曲霉孢子各點(diǎn)重1 μL到CM（10%、15%葡萄糖濃終度）培養(yǎng)基平板，放置于30℃培養(yǎng)48 h，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表4所示，在高濃度糖情況下菌株均能正常萌發(fā)。10%和15%葡萄糖濃度對(duì)3.042菌株孢子萌發(fā)和菌絲生長(zhǎng)及其產(chǎn)孢均無(wú)明顯影響，都于36 h開(kāi)始產(chǎn)孢，菌落直徑?jīng)]差別，呈現(xiàn)出中心深綠色孢子伴有少量氣生菌絲，外圍白色和透明菌絲呈圓形生長(zhǎng)。g-5號(hào)于10%和15%葡萄糖濃度孢子萌發(fā)速度、菌絲生長(zhǎng)菌落直徑等也無(wú)明顯差異，但與其自身在2%葡萄糖及3.042在同濃度葡萄糖培養(yǎng)基相同時(shí)間生長(zhǎng)情況存在較大差異，總體菌落呈聚縮狀，產(chǎn)生大量白色氣生菌絲卻無(wú)孢子產(chǎn)生，g-5菌株較3.042對(duì)高濃度糖耐受性降低。

表4 米曲霉3.042和g-5菌株高糖耐受性Table 4 High sugar tolerance of A. oryzae 3.042 and g-5 strains

2.4 g-5轉(zhuǎn)化子搖瓶發(fā)酵曲酸

將米曲霉3.042和g-5號(hào)菌株按照方法1.2.6進(jìn)行曲酸發(fā)酵。結(jié)果如圖2所示，g-5菌株曲酸產(chǎn)量為21.55 g/L，較3.042菌株產(chǎn)量11.86 g/L提高了81%。顯微鏡下觀察與3.042相比，g-5的菌絲球較小且菌絲較短，在搖瓶發(fā)酵過(guò)程中g(shù)-5菌株抗剪切力強(qiáng)，溶氧好，曲酸產(chǎn)量越高。

圖2 米曲霉3.042和g-5號(hào)菌株發(fā)酵產(chǎn)曲酸分析及菌絲球形態(tài)觀察Fig. 2 Fermentation results of A. oryzae 3.042 and strain g-5 and observation of mycelial pellet morphology

2.5 菌株抗逆性及產(chǎn)酸相關(guān)基因RT-qPCR分析

2.5.1 抗逆性相關(guān)tps1、brlA及ageB基因RT-qPCR分析 將出發(fā)菌株3.042與g-5分別培養(yǎng)，取3 d、6 d菌絲提取總RNA，檢測(cè)顯示完整性好且質(zhì)量符合要求后進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，用于RT-qPCR檢測(cè)。由于Δmsn2菌株g-5與3.042相比菌絲生長(zhǎng)和孢子形成都有較大的差異，因此需要對(duì)影響曲霉分生孢子梗分化，促進(jìn)孢子的brlA基因、影響細(xì)胞內(nèi)海藻糖合成的基因tps1和曲霉菌落生長(zhǎng)發(fā)育及產(chǎn)孢子相關(guān)的主要基因ageB［19-20］通過(guò)RT-qPCR檢測(cè)其轉(zhuǎn)錄水平，以his2A基因作為內(nèi)參，結(jié)果如圖3所示。隨著時(shí)間推移兩株菌tps1和brlA表達(dá)量均呈顯著上升趨勢(shì)（圖3-A，3-B），在6 d時(shí)3.042中兩基因表達(dá)量較3 d時(shí)分別上調(diào)了150倍和70倍，g-5菌株分別上調(diào)24倍和7倍，但在6 d時(shí)g-5菌株較同期3.042tps1和brlA表達(dá)量大幅下調(diào)128倍和63倍。說(shuō)明敲除了msn2基因?qū)τ诿浊筨rlA和tps1基因表達(dá)產(chǎn)生抑制，由于msn2是轉(zhuǎn)錄因子，隨著msn2基因轉(zhuǎn)錄缺失導(dǎo)致brlA和tps1基因表達(dá)大幅下降，說(shuō)明msn2轉(zhuǎn)錄因子對(duì)這兩個(gè)基因具有正向調(diào)節(jié)功能。同時(shí)在2.3節(jié)中也觀察到g-5菌株較3042菌株孢子生成量減少60%而且菌落聚縮。此外3.042菌株ageB表達(dá)量非常低，而g-5菌株隨著時(shí)間變化表達(dá)量顯著上調(diào)，在6 d達(dá)到3 d表達(dá)量的59倍（圖3-C）。

圖3 米曲霉3.042和g-5菌株brlA、tps1和ageB相對(duì)表達(dá)量Fig. 3 Relative expressions of A. oryzae 3.042 and g-5 strain brlA，tps1 and ageB

2.5.2msn2及產(chǎn)酸相關(guān)基因LaeA和kojRRT-qPCR分析 在g-5菌株中未檢測(cè)到msn2基因的表達(dá)，而在3.042菌株中msn2呈現(xiàn)上升的趨勢(shì)（圖4-A）。在3.042和g-5菌株中與曲酸產(chǎn)量相關(guān)的全局調(diào)控轉(zhuǎn)錄因子LaeA基因隨時(shí)間表達(dá)量呈增加趨勢(shì)，而且在曲酸發(fā)酵后期6 d，g-5轉(zhuǎn)化子LaeA基因表達(dá)量急劇增加，是3.042表達(dá)量的21.02倍（圖4-B）。直接影響曲酸合成的kojR基因，在3.042和g-5菌株表達(dá)量也隨時(shí)間呈增加趨勢(shì)，在3 d時(shí)g-5菌株kojR基因表達(dá)量是3.042表達(dá)量的3.19倍，而到6 d時(shí)g-5菌株kojR基因表達(dá)量依然比3.042高，但差距明顯縮?。▓D4-C）。

圖4 米曲霉3.042和g-5菌株kojR、msn2和LaeA相對(duì)表達(dá)量Fig. 4 Relative expressions of A. oryzae 3.042 and g-5 strain kojR，msn2 and LaeA

3 討論

Msn2是真菌重要的轉(zhuǎn)錄因子，但其在米曲霉中的功能研究比較少。本文對(duì)Δmsn2菌株g-5生長(zhǎng)、其耐受過(guò)氧化氫和高濃度糖等與米曲霉3.042進(jìn)行觀察比較，同時(shí)進(jìn)行相關(guān)基因表達(dá)量檢測(cè)。g-5菌株較3.042菌株孢子生成量顯著降低60%，菌絲生長(zhǎng)受到抑制導(dǎo)致菌落聚縮，通過(guò)相關(guān)基因表達(dá)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，g-5菌株msn2基因幾乎沒(méi)有表達(dá)，說(shuō)明該基因在米曲霉中可能僅有一個(gè)拷貝沒(méi)有同工酶，同時(shí)發(fā)現(xiàn)與同期3.042相比g-5菌株brlA和tps1基因表達(dá)顯著下調(diào)63倍和128倍，ageB基因表達(dá)量上調(diào)59倍，因此導(dǎo)致g-5菌株生長(zhǎng)受到影響，說(shuō)明敲除msn2對(duì)ageB基因的表達(dá)有顯著促進(jìn)作用，而3.042菌株由于msn2基因的正常表達(dá)抑制了ageB基因的表達(dá)。ageB編碼高爾基體定位的ArfA GTPase活性蛋白G蛋白調(diào)控因子，影響蛋白分泌和菌絲球形成［21］，推測(cè)這可能是g-5菌株菌絲球更小菌絲更短的一個(gè)原因。與球孢白僵菌和羅伯茲綠僵菌msn2突變體分生孢子產(chǎn)量降低40%結(jié)果相近［22］。

過(guò)氧化氫耐受性分析，g-5較3.042抗H2O2能力顯著增強(qiáng)，H2O2的添加使得菌絲胞內(nèi)ROS增加受到氧化脅迫，由于msn2基因缺失導(dǎo)致LaeA基因補(bǔ)償性轉(zhuǎn)錄增加，可增加抗氧化酶含量平衡過(guò)多活性氧帶來(lái)的毒害，提高氧化應(yīng)激防御能力。實(shí)驗(yàn)人員發(fā)現(xiàn)H2O2的添加使得野生株胞內(nèi)ROS增加，抗氧化酶含量也相應(yīng)增加，而相同條件下LaeA缺失株的抗氧化酶含量較對(duì)照降低，說(shuō)明LaeA的缺失可能會(huì)影響抗氧化酶的活性使其在受到氧化脅迫時(shí)無(wú)法平衡過(guò)多活性氧帶來(lái)的毒害，造成對(duì)脅迫環(huán)境敏感性的增加［23］，同時(shí)增加次生代謝產(chǎn)物曲酸含量，曲酸作為一種抗氧化物可以直接緩解真菌活性氧壓力，這也是△msn2菌株產(chǎn)曲酸高于出發(fā)菌株的原因之一。高糖耐受性結(jié)果表明，高濃度糖導(dǎo)致ROS的增加，而Msn2作為應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的缺失使得△msn2菌株對(duì)于高糖利用率下降，甚至影響了菌絲生長(zhǎng)和產(chǎn)孢調(diào)控相關(guān)基因的表達(dá)，這與呂潤(rùn)玲［16］在玉米大斑病△Stmsn2菌株生長(zhǎng)速度增快、不產(chǎn)生分生孢子結(jié)果相似。Msn2轉(zhuǎn)錄因子作為壓力響應(yīng)調(diào)節(jié)基因，其編碼蛋白可以特異識(shí)別并結(jié)合STRE序列，響應(yīng)多重壓力的誘導(dǎo)來(lái)調(diào)控不同類(lèi)型的基因，也是部分信號(hào)通路中的關(guān)鍵激活因子，在參與調(diào)控真菌生長(zhǎng)形態(tài)和環(huán)境脅迫方面等起到重要作用。研究表明球孢白僵菌和羅伯茲綠僵菌msn2突變體對(duì)多種高滲脅迫的耐受性大大降低［22］。本研究發(fā)現(xiàn)△msn2菌株g-5對(duì)高糖的耐受性降低，可能由于g-5菌株受到msn2不表達(dá)影響導(dǎo)致tps1基因表達(dá)量下降，海藻糖合成受阻影響細(xì)胞內(nèi)滲透壓調(diào)節(jié)，同時(shí)高濃度糖類(lèi)導(dǎo)致ROS的增加，而Msn2作為應(yīng)激反應(yīng)調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子的缺失使得△msn2菌株對(duì)于高糖利用率下降。

g-5菌株在高濃度過(guò)氧化氫存在下，表現(xiàn)出較好的耐受性和生長(zhǎng)特性，而且搖瓶發(fā)酵產(chǎn)曲酸達(dá)到21.55 g/L，較3.042發(fā)酵曲酸11.86 g/L提升至81%。通過(guò)基因表達(dá)量檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，對(duì)比各時(shí)間3.042和g-5菌株msn2基因、LaeA基因和kojR基因表達(dá)量，發(fā)現(xiàn)g-5菌株msn2基因沒(méi)有表達(dá)，而其LaeA基因表達(dá)量急劇增加，表明LaeA對(duì)于msn2轉(zhuǎn)錄因子有補(bǔ)償作用，并且可能由于msn2基因的缺失促進(jìn)了LaeA基因轉(zhuǎn)錄，以實(shí)現(xiàn)米曲霉生長(zhǎng)和對(duì)環(huán)境適應(yīng)的需要。g-5菌株LaeA和kojR較3.042具有較大的提高，LaeA作為絲狀真菌全局轉(zhuǎn)錄因子在調(diào)控次級(jí)代謝產(chǎn)物具有重要作用，Oda等［24］發(fā)現(xiàn)在米曲霉中LaeA能調(diào)節(jié)曲酸合成基因表達(dá)水平，敲除LaeA基因后，米曲霉不再產(chǎn)生曲酸，且曲酸合成相關(guān)的koj基因簇表達(dá)量均大幅度降低。Bok等［25］發(fā)現(xiàn)米曲霉koj基因簇直接參與曲酸的產(chǎn)生。kojA和kojT基因的主要功能分別是FAD依賴(lài)的氧化還原酶和主要的促進(jìn)劑超家族轉(zhuǎn)運(yùn)體。而kojR基因編碼一個(gè)轉(zhuǎn)錄因子，參與曲酸生物合成基因kojA和kojT轉(zhuǎn)錄的激活［26］。并且KojR作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子可正向調(diào)節(jié)過(guò)表達(dá)LaeA來(lái)提高真菌多種次級(jí)代謝產(chǎn)物如曲酸。而Msn2涉及另一部分與生成曲酸間接的途徑，與次級(jí)代謝不直接相關(guān)。根據(jù)本研究的實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示菌株g-5號(hào)msn2表達(dá)量始終為零，而LaeA和kojR基因隨時(shí)間變化表達(dá)量顯著增加，這表明msn2基因?qū)τ诿浊怪蠰aeA和kojR基因表達(dá)有抑制作用，間接對(duì)曲酸的合成呈效應(yīng)影響。

總之，通過(guò)RT-qPCR實(shí)驗(yàn)顯示出msn2基因敲除菌株g-5其調(diào)節(jié)曲酸合成相關(guān)基因LaeA和kojR表達(dá)量顯著高于3.042，與其搖瓶發(fā)酵曲酸結(jié)果一致，表明LaeA基因和kojR基因?qū)τ诿浊购铣汕峋哂姓嚓P(guān)性，這兩個(gè)基因的高表達(dá)可實(shí)現(xiàn)提高米曲霉曲酸產(chǎn)量。

4 結(jié)論

以米曲霉3.042為出發(fā)菌株，利用同源重組和農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法，以回補(bǔ)pyrG為篩選標(biāo)記最終獲得△msn2菌株g-5號(hào)，該菌株呈聚縮狀生長(zhǎng)，孢子量降低且菌絲較短，耐受高濃度過(guò)氧化氫且對(duì)高糖利用率降低，搖瓶發(fā)酵產(chǎn)曲酸達(dá)到21.55 g/L，較3.042曲酸產(chǎn)量11.86 g/L提升81%。