煙草根際高效解磷菌的篩選鑒定及促生作用研究

劉廣超 葉青 車永梅 李雅華 安東 劉新

（青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 山東省高校植物生物技術(shù)重點實驗室，青島 266109）

磷元素是植物生長發(fā)育必需的大量元素之一，是構(gòu)成核酸、蛋白質(zhì)和磷脂等重要物質(zhì)的組成成分，廣泛參與植物的各種代謝過程。植物對磷的需求量大，土壤中磷含量較高，但大部分磷并不能被植物直接吸收利用，土壤中有效磷含量遠(yuǎn)遠(yuǎn)不能滿足植物的需求，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中通常通過施用化學(xué)磷肥補充植物所需的磷［1］。解磷菌是存在于土壤中的一類根際促生菌，可以將土壤中植物難以吸收利用的磷轉(zhuǎn)化為可被植物利用的形態(tài)。開發(fā)微生物肥料，利用解磷微生物將土壤中的無效磷轉(zhuǎn)化為有效磷，提高土壤磷的利用效率，改善土壤結(jié)構(gòu)，減少化肥用量，對于發(fā)展綠色可持續(xù)農(nóng)業(yè)具有重要意義。

解磷菌的種類與土壤質(zhì)地、植物種類、根際環(huán)境等相關(guān)，主要包括細(xì)菌、真菌和放線菌等，其中細(xì)菌占絕大多數(shù)。目前已分離鑒定了多種解磷菌，并研究了其解磷功能、作用機理及對植物生長的影響，根據(jù)作用底物不同又可以將解磷菌分為解無機磷微生物和解有機磷微生物［2］。解磷菌主要通過分泌葡萄糖酸、乙酸、草酸及檸檬酸等有機酸溶解無機磷，通過分泌堿性和酸性磷酸酶分解有機磷［3-4］。不同解磷菌對不同形式的磷轉(zhuǎn)化能力存在差異。Wu等［5］以及Yang等［2］從杭州西湖和武漢巢湖等地分離到多種解有機磷菌和解無機磷菌；從缺磷土壤中分離的馬昆德擬青霉（Paecilomyces marquandii）AA1對不同產(chǎn)地的磷礦有不同分解能力［6］；從綠豆根際分離到的解磷菌泡盛曲霉（Aspergillus awamori）S29對二磷酸鈣分解能力強，其次是磷酸三鈣［7］；從香蕉根際分離到40株解磷菌，具有溶解Ca3(PO4)2的作用，其中3株可以分解大豆卵磷脂，但均無分解FePO4的作用［8］；從大豆根際分離的解磷菌成團(tuán)泛菌（Pantoea agglomerans）R-42具有一定分解FePO4和AlPO4的能力［9］。多數(shù)解磷菌對植物生長有促進(jìn)作用，可以促進(jìn)綠豆、水稻、小麥、薄荷以及大豆和白菜等作物生長（Mentha arvensisL）［7，10-13］，但泛菌屬（Pantoeasp.）解磷菌A34和科薩克氏菌屬（Kosakoniasp.）解磷菌B7對番茄根和幼苗生長起抑制作用［14］。因此分離鑒定不同性質(zhì)和功能、對植物有良好促生作用的解磷微生物，可以為微生物肥料的生產(chǎn)提供充足的微生物資源，以滿足更廣條件下農(nóng)業(yè)生產(chǎn)的需求。

植物根際土壤（rhizosphere soil）是植物能量和物質(zhì)代謝最活躍的部位之一。在植物根際土壤中生存著大量的微生物，其數(shù)量遠(yuǎn)高于非根際土壤。本研究從煙草根際土壤中分離篩選到一株同時解有機磷和無機磷的不動桿菌屬的細(xì)菌3P29，對其進(jìn)行生理生化和分子生物學(xué)鑒定，并通過煙草促生試驗驗證該菌株對煙草的促生作用，為該菌株在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的開發(fā)利用及生物肥料的研發(fā)提供微生物資源和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 土壤樣品 土壤樣品取自山東省濰坊市高密市方市鄉(xiāng)煙草根際土壤，采樣深度10-20 cm，置于4℃冰箱中保存，備用。

1.1.2 培養(yǎng)基 以下培養(yǎng)基配方均為液態(tài)培養(yǎng)基，固態(tài)培養(yǎng)基需在此基礎(chǔ)上添加15 g瓊脂。

有機磷細(xì)菌培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，硫酸銨0.5 g，酵母浸粉0.5 g，氯化鈉0.3 g，氯化鉀0.3 g，硫酸鎂0.3 g，硫酸亞鐵0.03 g，硫酸錳0.03 g，卵磷脂0.2 g，碳酸鈣1.0 g，pH 7.0-7.5，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌15 min。

無機磷細(xì)菌培養(yǎng)基：葡萄糖10 g，硫酸銨0.5 g，酵母浸粉0.5 g，氯化鈉0.3 g，氯化鉀0.3 g，硫酸鎂0.3 g，硫酸亞鐵0.03 g，硫酸錳0.03 g，磷酸鈣5.0 g，pH 7.0-7.5，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌30 min。

LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，氯化鈉10 g，pH 7.0-7.2，蒸餾水1 000 mL，121℃滅菌30 min。

1.2 方法

1.2.1 解磷菌的初篩 將供試根際土壤稱取10 g，置于含玻璃珠和90 mL 無菌水的三角瓶中，28℃，120 r/min振蕩20 min，靜置30 min，取上清即得到稀釋度為10-1的根際土壤稀釋液，用10倍稀釋法分別配制10-3、10-4、10-5、10-6g/mL的土壤懸液，分別涂布到有機磷及無機磷細(xì)菌培養(yǎng)基上，28℃培養(yǎng)4 d，觀察出現(xiàn)溶磷圈的菌落，根據(jù)能否產(chǎn)生溶磷圈及測定溶磷指數(shù)（溶磷指數(shù)=透明圈直徑/菌落直徑）來初步確定菌株的溶磷能力。將篩選出的菌株利用平板劃線法分離純化后，4℃下保存于LB斜面培養(yǎng)基，-80℃保存菌種于甘油管中。

1.2.2 解磷菌株的復(fù)篩 250 mL三角瓶中分別裝入有機磷及無機磷細(xì)菌培養(yǎng)基100 mL，高壓滅菌121℃、25 min備用。將在LB斜面培養(yǎng)基上生長24 h的細(xì)菌制成菌懸液（菌數(shù)約為1×107CFU/mL），將解磷菌菌懸液1 mL接種于上述滅菌的液體細(xì)菌培養(yǎng)基中，以不接菌為對照，每個處理3次重復(fù)，搖床培養(yǎng)（28℃，120 r/min）3 d，利用鉬銻抗比色法［5］測定可溶性磷含量。

1.2.3 解磷菌的生理生化及分子生物學(xué)分析

1.2.3.1 篩選解磷菌株形態(tài)學(xué)特征 菌落形態(tài)：將篩選得到的菌株劃線接種到LB固體培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)24 h，觀察其菌落大小、形狀、透明度、光滑度、顏色等特點。

個體形態(tài)：革蘭氏染色，用接種環(huán)挑取18-24 h菌株培養(yǎng)液于載玻片無菌水中，室溫自然干燥后火焰固定，滴加適量草酸銨結(jié)晶紫染色l min，傾去染色液，用水沖洗至無色，然后用革蘭氏碘液染色2 min，水洗，乙醇脫色30 s，水洗后用石炭酸復(fù)紅染10 s，水洗，晾干后鏡檢。

1.2.3.2 篩選解磷菌株生理生化特征 糖類發(fā)酵試驗、動力學(xué)試驗、氧化酶試驗、硝酸鹽還原試驗、解鉀性試驗、固氮性試驗、產(chǎn)生長素試驗、產(chǎn)鐵載體試驗的方法均參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》（第8版）進(jìn)行。

1.2.3.3 溶磷菌株分泌IAA特性測定 將分離純化的菌株接種于 LB 液體培養(yǎng)基中（添加L-色氨酸，使終濃度為0.5 g/L），37℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)2 d，離心后取50 μL上清液加入等體積Sackowcki’s顯色劑在比色皿中避光顯色30 min后觀察，若出現(xiàn)粉紅色則為陽性，說明該菌株能夠分泌IAA。

1.2.3.4 解磷菌分子生物學(xué)鑒定 菌株劃板后挑取單菌落，接種于20 mL三角瓶振蕩培養(yǎng)16-18 h，取1 mL菌液10 000 r/min離心1 min，棄上清，沉淀加200-300 μL無菌水，沸水浴10 min，立即置于-20℃處理3 min后12 000 r/min 4℃離心5 min，取上清即為模板，采用采用細(xì)菌16S rDNA通用引物：27f（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）、1492r（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）及gyrB通 用 引物：gyrBf（5'-CAYGCNGGNGGNAARTTYGA-3'）、gyrBr（5'-CCRTCNACRTCNGCRTCNGTCAT-3'）進(jìn)行16S rDNA的PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增片斷長度為1.5 kb。PCR程序為94℃預(yù)變性4 min，94℃變性0.5 min，51℃退火0.5 min，72℃延伸1.5 min，共35個循環(huán)，72℃延伸10 min，4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)純化回收，交由上海生物工程有限公司進(jìn)行測序，將16S rDNA基因序列與RDP數(shù)據(jù)庫中核酸數(shù)據(jù)進(jìn)行比對分析，在BLAST數(shù)據(jù)庫搜索gyrB基因同源序列，使用MEGA 6.0軟件，以Neighbor-joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 土壤營養(yǎng)元素含量和酶活性檢測 將187.5 mL解磷菌（菌數(shù)約為3.5×108CFU/mL）菌液經(jīng)離心棄上清后，將菌體沉淀用等體積滅菌水懸浮，再接種到裝有750 g泥炭土的塑料花盆里，同時設(shè)置滅活解磷菌的對照組，置于28℃溫室中培養(yǎng)，每周澆水一次，每隔10 d進(jìn)行土壤氮、磷和鉀元素含量以及酶活性測定。

土壤中總氮采用凱氏定氮法測定，速效氮采用滴定法測定，總磷和速效磷采用鉬銻抗比色法測定，總鉀和速效鉀采用火焰分光光度計法測定［15］。脲酶采用苯酚-次氯酸鈉比色法測定［16］；酸性磷酸酶采用磷酸苯二鈉比色法測定［17］；蔗糖酶采用3，5-二硝基水楊酸比色法測定［18］。

1.2.5 解磷菌促生作用分析 消毒的煙草種子于28℃黑暗條件下催芽，發(fā)芽后移栽至含750 g泥炭土的塑料花盆中。實驗設(shè)滅活解磷菌（對照）和接種解磷菌兩組處理。接種解磷菌的煙草幼苗每盆澆含187.5 mL菌液（菌 數(shù)約3.5×108CFU/mL），經(jīng)離心棄上清后，等體積無菌水懸浮后接種，對照每盆施等量滅活菌液。兩組處理每盆澆花無缺營養(yǎng)液100 mL（花無缺水溶肥購自上海永通化工有限公司），于25℃，12 h/12 h光周期，光強200 μmol/（m2·s）條件下培養(yǎng)，每周澆水兩次，培養(yǎng)45 d后進(jìn)行生長指標(biāo)和葉片氮、磷和鉀含量的測定。

2 結(jié)果

2.1 根際土壤高效解磷菌的分離篩選

經(jīng)稀釋平板涂布法從供試煙草根際土壤中分離純化出50株菌株，依據(jù)溶磷指數(shù)分別在固體有機磷篩選培養(yǎng)基和無機磷篩選培養(yǎng)基上進(jìn)行初篩，共有10株菌株具有解磷功能，分別命名為2P1、2P10、2P14、2P23、2P24、3P25、3P28、3P29、3P33、3P37。

將篩選出的10株解磷菌接種到液體有機磷篩選培養(yǎng)基和無機磷篩選培養(yǎng)基中進(jìn)行復(fù)篩，振蕩培養(yǎng)7 d后，檢測發(fā)酵液中可溶性磷含量，結(jié)果如表1所示，菌株3P29在有機磷篩選培養(yǎng)基中磷含量為13.38 mg/L，無機磷篩選培養(yǎng)基中磷含量為19.83 mg/L，說明菌株3P29同時具有高效分解有機磷及無機磷的功能。

表1 解磷菌3P29的解磷能力Table 1 Phosphorus solubilizing ability of strain 3P29

2.2 解磷菌3P29的生理生化及分子生物學(xué)鑒定

經(jīng)平板劃線、革蘭氏染色，觀察解磷菌3P29形態(tài)特征，可見解磷菌3P29在菌落較小時為圓形，初期為無色透明，后期為淡黃色，表面光滑、濕潤、黏稠、邊緣整齊、直徑2-3 mm，為革蘭氏陰性菌，生理生化指標(biāo)檢測結(jié)果表明，3P29同時具有解鉀、固氮及產(chǎn)硫化氫、生長素的能力（圖1）。

圖1 解磷菌3P29的菌落形態(tài)、革蘭氏染色及分泌生長素的能力Fig.1 Colony morphology，Gram staining and auxin secretion ability of strain 3P29

以菌株3P29的基因組DNA為模板，分別用通用測序引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增獲得3P29的16S rDNA和gyrB序列。通過在RDP數(shù)據(jù)庫比對16S rDNA，得到20株相似菌株，進(jìn)而在NCBI數(shù)據(jù)庫下載相似菌株對應(yīng)gyrB基因，應(yīng)用MEGA 6.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2-圖3）。經(jīng)16S rDNA及gyrB進(jìn)化樹圖譜綜合分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，解磷菌3P29與皮特不動桿菌LMG 1035同源性最高，結(jié)合形態(tài)及生理生化特征鑒定結(jié)果，將菌株3P29鑒定為皮特不動桿菌屬（Acinetobacter pittii）。

圖2 基于解磷菌3P29和相關(guān)菌株的16S rDNA 序列采用鄰接法建立的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 2 Phylogenetic tree established using the neighborjoining method，based on 16S rDNA sequences of strain 3P29 and related strains

圖3 基于解磷菌3P29和相關(guān)菌株的gyrB序列采用鄰接法建立的系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 3 Phylogenetic tree established using the neighborjoining method，based on gyrB sequences of strain 3P29 and related strains

2.3 解磷菌3P29對土壤礦質(zhì)營養(yǎng)元素含量及土壤酶活的影響

菌株3P29具有解磷、解鉀和固氮作用，因此檢測了3P29對土壤氮、磷和鉀含量的影響，結(jié)果（圖4）顯示，3P29對土壤總氮、總磷和總鉀含量無顯著性影響，但增加土壤堿解氮、速效磷和速效鉀含量。隨接種時間延長，堿解氮、速效磷和速效鉀含量呈升高趨勢，于接種30 d時達(dá)最高水平。與初始未接種時相比堿解氮含量提高229%，速效磷含量提高了156%，速效鉀含量提高了16%。

圖4 解磷菌3P29對土壤礦質(zhì)元素含量的影響Fig. 4 Effects of strain 3P29 on mineral element contents in soil

土壤中脲酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶參與土壤有機含碳、氮和磷化合物降解，在土壤碳、氮和磷的循環(huán)過程中發(fā)揮重要作用。3P29對土壤脲酶和酸性磷酸酶活性具有較大影響，脲酶和酸性磷酸酶活性隨時間延長呈先升高后降低趨勢，于接種后30 d左右達(dá)最高水平。而土壤蔗糖酶活性無顯著影響（圖5）。

圖5 解磷菌3P29對土壤酶活的影響Fig.5 Effects of strain 3P29 on soil enzyme activity

2.4 解磷菌3P29對煙草的促生試驗

對菌株3P29進(jìn)行煙草促生試驗，結(jié)果（圖6、表2）表明，接種3P29顯著促進(jìn)煙草的生長，在無磷霍格蘭營養(yǎng)液培養(yǎng)下煙草株高、葉面積和莖粗分別提高了12.4%、21.7%和36.1%；在花無缺全營養(yǎng)液培養(yǎng)下分別提高了40.1%、42.7%和29.1%。

表2 解磷菌3P29對煙草生長指標(biāo)的影響Table 2 Effects of strain 3P29 on the growth index of tobacco

圖6 解磷菌3P29對煙草生長的影響Fig. 6 Effects of strain 3P29 on tobacco growth

由表3可知，與對照組相比，接種3P29后煙草地上部分和地下部分的生物量亦顯著提高，煙草生長明顯優(yōu)于對照組。

表3 解磷菌3P29對煙草地上部分和地下部分生物量的影響Table 3 Effects of strain 3P29 on the biomass of aerial and underground parts of tobacco

進(jìn)一步檢測接種3P29對煙草葉片氮、磷和鉀元素含量的影響，結(jié)果如圖7所示，接種3P29后促進(jìn)煙草葉片氮、磷和鉀的積累，在無磷霍格蘭營養(yǎng)液和在花無缺營養(yǎng)液條件下，鉀元素含量分別提高了45%和10%，磷元素含量分別提高了134%和28%，氮元素含量分別提高了71%和49%。

圖7 解磷菌3P29對煙草葉片氮、磷和鉀元素含量的影響Fig. 7 Effects of strain 3P29 on contents of nitrogen，phosphorus and potassium in tobacco leaves

3 討論

土壤中的磷包括有機磷和無機磷，有機磷主要來源于動植物殘體、堆肥和微生物組織等，無機磷大 部 分 以Ca3(PO4)2、CaHPO4、FePO4和AlPO4等難溶性磷酸鹽的形式存在，不能被植物直接吸收利用，土壤中無效磷含量占95%以上［9］。解磷菌能夠?qū)⑼寥乐胁蝗苄粤邹D(zhuǎn)化為可溶性磷，對于土壤磷的循環(huán)和改善土壤結(jié)構(gòu)具重要作用。目前已有多種對Ca3(PO4)2、CaHPO4、FePO4和AlPO4等不同形式無機磷具有溶解作用的微生物被分離鑒定［6-8，19-20］，也分離鑒定到一些解有機磷微生物［14］，但目前分離鑒定的解有機磷微生物種類相對較少。本實驗從煙草根際分離篩選到一株同時具有解有機磷和無機磷能力的菌株3P29。形態(tài)學(xué)、生理生化及分子生物學(xué)鑒定表明3P29屬于皮特不動桿菌屬（Acinetobacter pittii）細(xì)菌。

目前研究發(fā)現(xiàn)不同解磷菌生理生化特性（如激素產(chǎn)生、解鉀和固氮等）存在差異，如Wu等［5］在杭州西子湖分離的固氮螺菌屬（Azospirillum）解有機磷菌OPB1同時具有固氮作用；從小麥根際分離的解磷菌Pseudomonassp. MS16和Enterobactersp.MS32具有解鋅作用及固氮酶活性［10］。本文結(jié)果表明，3P29在平板實驗中兼具解鉀和固氮作用，是一株潛在的多功能菌，具有重要開發(fā)利用價值。土壤中的酶主要來源于土壤微生物，是反映土壤微生物活性的重要指標(biāo)，土壤中脲酶、酸性磷酸酶和蔗糖酶參與土壤有機含碳、氮和磷化合物降解，在土壤碳、氮和磷的循環(huán)過程中發(fā)揮重要作用［21-22］。生物菌劑可以影響土壤酶活性，如根際促生菌和AM真菌接種可以提高脲酶和蔗糖酶等土壤酶活性［23］。含枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的生物肥料可以提高土壤脲酶和過氧化氫酶等酶活性［24］。因此本文進(jìn)一步分析了3P29對土壤營養(yǎng)元素含量，土壤酶活性以及對煙草生長的作用，結(jié)果表明3P29可以顯著提高土壤中堿解氮、速效磷和速效鉀的含量及土壤脲酶、酸性磷酸酶活性。

根際微生物生活在靠近植物根部的土壤區(qū)域，在調(diào)節(jié)植物養(yǎng)分供應(yīng)方面起著特別重要的作用［25-26］。如從玉米根中分離出的Burkholderia cenocepacia CR318通過提高玉米葉片葉綠素含量，根部鮮重等促進(jìn)玉米根系發(fā)育，增加玉米凈生物量［27］；玫瑰花天竺葵接種假單胞菌與未接種的對照相比，蒙特氏假單胞菌可增溶無機磷并使莖，根和精油的干生物量分別增加44%，48%和43%［28］。本文通過盆栽實驗表明，接種3P29可以優(yōu)化煙草根系結(jié)構(gòu)，增加側(cè)根數(shù)量及主根長度，同時具有分泌生長素的能力，從而提高煙草對土壤營養(yǎng)物質(zhì)及水分的吸收與利用，葉片氮、磷和鉀的含量較對照組顯著升高，進(jìn)而增強煙草光合活性，促進(jìn)植株生長。因此，在缺磷的土壤環(huán)境中，3P29可被作為研制煙草促生生物肥料的候選菌株。但3P29能否直接參與煙草在缺磷時的根形態(tài)建成以及其可能的調(diào)節(jié)機制仍需進(jìn)一步研究；同時，3P29促進(jìn)煙草體內(nèi)氮代謝過程與其固氮功能的關(guān)系也有待進(jìn)一步闡明。

4 結(jié)論

本試驗從煙草根際土壤中篩選得到一株同時解有機磷和無機磷的皮特不動桿菌屬（Acinetobacter pittii）細(xì)菌3P29，其對卵磷脂的轉(zhuǎn)化量為13.38 mg/L，磷酸鈣的轉(zhuǎn)化量為19.83 mg/L。高效解磷菌3P29促進(jìn)煙草根系生長，形成更多側(cè)根，增強對土壤中營養(yǎng)元素的吸收和利用，生物量等生長指標(biāo)明顯優(yōu)于對照組，具有開發(fā)利用價值。