具有殺線活性馬尾松內(nèi)生細(xì)菌的篩選與鑒定

賀麗娜 馮源 石慧敏 葉建仁

（南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心 南京林業(yè)大學(xué)林學(xué)院，南京 210037）

松材線蟲病是一種毀滅性的森林病害，使我國松林資源遭到嚴(yán)重破壞［1］。目前我國對松材線蟲的防治措施主要包括病害檢疫、疫情監(jiān)測、疫木除治、媒介昆蟲防治以及樹干注射等［2］。目前盡管一些市售的殺線蟲劑如阿維菌素和甲維鹽等化學(xué)樹干注射劑取得了顯著成效［3-6］，但仍然存在著對環(huán)境產(chǎn)生不利影響的因素。隨著人們環(huán)保意識的增強(qiáng)，利用生物防治來防控松材線蟲病一直是研究和關(guān)注的方向。利用細(xì)菌及其代謝產(chǎn)物來防治松材線蟲病已有一些研究，據(jù)報道，生防細(xì)菌可以通過多種方式殺死松材線蟲，例如產(chǎn)生毒素、分泌胞外蛋白酶消解線蟲的體表組織以及干擾線蟲行為等［7］。已報導(dǎo)的具有殺線功能的細(xì)菌主要包括芽孢桿菌、假單胞菌、沙雷氏菌、腸桿菌和放線菌等，其中研究較多的是芽孢桿菌和假單胞菌［8］。

植物內(nèi)生細(xì)菌普遍存在于植物的各個器官中，與寄主植物在長期進(jìn)化過程中建立了和諧聯(lián)合關(guān)系，是植物微生態(tài)系統(tǒng)中巨大而寶貴的資源庫［9］。研究表明，植物內(nèi)生細(xì)菌具有豐富的種群多樣性，對寄主植物具有內(nèi)生固氮、促生、抗病蟲害、殺線蟲等多種生物學(xué)作用［10］。由于植物內(nèi)生細(xì)菌定殖在寄主植物體內(nèi)，占據(jù)比較穩(wěn)定的生態(tài)位，大量研究表明內(nèi)生細(xì)菌在定殖后可以通過誘導(dǎo)植物抗性從而抵抗外界不良環(huán)境的影響［11-13］，因此篩選和利用內(nèi)生細(xì)菌將成為生物防治的熱點。對于松樹內(nèi)生細(xì)菌，袁文婷［14］首次對馬尾松和黑松的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行分離，共分離得到39株內(nèi)生細(xì)菌，為松樹內(nèi)生細(xì)菌的研究提供了參考。朱麗梅等［15］從馬尾松樹體上分離出一株對松樹線蟲具有顯著毒殺活性的解淀粉芽孢桿菌。李亮亮等［16］從松樹體內(nèi)篩選得到兩株具有殺線功能的內(nèi)生細(xì)菌，分別是短小芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌。彭雙［17］從6種不同植物內(nèi)篩選得到4株高活性殺線菌株，并能夠在黃瓜體內(nèi)定殖。Ponpandian等［18］報道了松樹內(nèi)生細(xì)菌寡養(yǎng)單胞菌（Stenotrophomonas）和芽孢桿菌（Bacillussp.）對松材線蟲的活性有抑制作用。

由于內(nèi)生細(xì)菌能夠定殖在植物內(nèi)部，因此從寄主植物本身篩選具有殺線功能的內(nèi)生細(xì)菌也更具有生防意義。本研究以前期從南京中山陵健康馬尾松上分離的58株內(nèi)生細(xì)菌為研究對象，通過浸漬法對分離的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行殺線活性的測定，以期篩選出具有高效殺線活性的內(nèi)生細(xì)菌，豐富拮抗松材線蟲的細(xì)菌資源，為開發(fā)生防菌劑防治松材線蟲病提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 內(nèi)生細(xì)菌來源 前期從南京中山陵健康馬尾松莖部一共分離得到了58株內(nèi)生細(xì)菌，現(xiàn)保存在南京林業(yè)大學(xué)森林病理實驗室。

1.1.2 松材線蟲來源 所用松材線蟲為南京林業(yè)大學(xué)森林病理實驗室保存的強(qiáng)毒力蟲株AMA3。

1.1.3 供試培養(yǎng)基 牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基（NA）、牛肉膏蛋白胨液體培養(yǎng)基（NB）、LB液體培養(yǎng)基和馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）。

1.2 方法

1.2.1 內(nèi)生細(xì)菌的活化 用接種針挑取保存的內(nèi)生細(xì)菌菌液，在LB固體培養(yǎng)基上劃線，待菌落長出后，挑取單菌落接種到LB液體培養(yǎng)基中，28℃，200 r/min振蕩培養(yǎng)24 h進(jìn)行菌株的活化。

1.2.2 松材線蟲的培養(yǎng) 將灰葡萄孢菌接種到PDA培養(yǎng)基上，待灰葡萄孢長滿平皿后，在超凈工作臺上接種松材線蟲。待松材線蟲取食完灰葡萄孢，用貝爾曼漏斗法收集松材線蟲液。將收集得到的松材線蟲液經(jīng)3 500 r/min，5 min離心，倒掉上清液，用無菌水反復(fù)清洗3次。將洗凈的松材線蟲懸液濃度配制為5 000條/mL線蟲懸液，備用。

1.2.3 細(xì)菌發(fā)酵濾液的制備 將活化后的馬尾松內(nèi)生細(xì)菌以1%的比例轉(zhuǎn)接到50 mL的NB液體培養(yǎng)基中28℃，200 r/min搖培3 d，將菌液經(jīng)8 000 r/min離心5 min，得到的上清液用0.22 μm的濾膜過濾，得到細(xì)菌發(fā)酵濾液，置于-20℃冰箱中，備用。

1.2.4 具有高效殺線活性的內(nèi)生細(xì)菌的篩選 采用浸漬法測定分離出的細(xì)菌培養(yǎng)濾液殺松材線蟲的活性。分別將500 μL細(xì)菌發(fā)酵濾液與500 μL（約2 500 條）的松材線蟲懸液加入2 mL離心管中輕輕振蕩混勻，放置線蟲培養(yǎng)箱（25℃，避光）中培養(yǎng)。以不接菌的NB液體培養(yǎng)基作為對照。每一處理重復(fù)3次，分別在24 h、48 h時測定殺線能力。在顯微鏡下觀察統(tǒng)計加有各不同細(xì)菌菌株培養(yǎng)濾液的處理中松材線蟲的總數(shù)和死亡數(shù)量，計算死亡率和校正死亡率，依次比較各細(xì)菌菌株發(fā)酵濾液的殺線活性。統(tǒng)計時，先對離心管中的線蟲液進(jìn)行振蕩，吸取20 μL的線蟲混合液后放在載玻片上靜置5 min，避免線蟲假死對實驗結(jié)果造成影響。線蟲的死亡標(biāo)準(zhǔn)為身體僵直，用針戳線蟲沒有反應(yīng)。

進(jìn)一步對篩選出的NZM13-11菌株的發(fā)酵濾液按照0（原液）、2、4、6、8倍稀釋，用顯微鏡觀察在12、24、36以及48 h松材線蟲的死亡情況和消解情況，計算校正死亡率和消解率。測定方法同上。

線蟲的死亡率、校正死亡率和消解率計算公式［19］：

死亡率（%）=線蟲死亡數(shù)/線蟲總數(shù)×100%

校正死亡率（%）=（處理死亡率-空白對照死亡率）/（100-空白對照死亡率）×100%

消解率（%）=線蟲消解數(shù)/線蟲總數(shù)×100%

1.2.5 數(shù)據(jù)處理 采用Origin和 WPS 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)圖表處理，用SPSS軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.6 具有高效殺線活性的內(nèi)生細(xì)菌的鑒定

1.2.6.1 菌落形態(tài)特征描述 將篩選出來的具有殺松材線蟲活性的菌株接種于NA培養(yǎng)基在30℃恒溫條件下培養(yǎng) 24 h，觀察生長出來的菌落的外形特征、顏色、大小、邊緣狀況、透明度等培養(yǎng)特征，并對菌株進(jìn)行革蘭氏染色和生長曲線等的測定。

1.2.6.2 生理生化特征的測定 根據(jù)《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》（東秀珠等主編）［20］和《微生物學(xué)實驗教程》［21］進(jìn)行了接觸酶試驗、氧化酶試驗、甲基紅試驗、VP試驗（乙酰甲基甲醇）、淀粉水解試驗、硝酸鹽還原試驗、亞硝酸鹽還原試驗、反硝化試驗、明膠水解試驗以及精氨酸雙水解酶試驗對菌株進(jìn)行常規(guī)生理生化特性的鑒定。

1.2.6.3 分子鑒定 參照已報道的文獻(xiàn)［22］提取細(xì)菌的基因組DNA，以基因組DNA為模板，利用細(xì)菌16S rDNA通用引物（上游引物27F：5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'，下 游 引 物1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）進(jìn)行PCR擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)程序為94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，35個循環(huán)；72℃修復(fù)延伸10 min。將擴(kuò)增得到的PCR產(chǎn)物經(jīng)1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后送至上海生工公司完成測序。根據(jù)測序得到的DNA序列在Ezbiocloud網(wǎng)站上進(jìn)行16S rDNA分析。篩選出同源性較高的16S rDNA 的基因序列作為參比對象，對克隆片段進(jìn)行序列分析，使用Bioedit和MEGA X軟件對序列進(jìn)行多序列比對和編輯后，采用Neighbor-joining（N-J）法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

2 結(jié)果

2.1 具有高效殺線活性的內(nèi)生細(xì)菌的篩選

對內(nèi)生細(xì)菌發(fā)酵濾液殺線活性進(jìn)行測定，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)細(xì)菌菌株都有一定的殺線作用，從58株內(nèi)生細(xì)菌中篩選出19株內(nèi)生細(xì)菌的殺線活性較強(qiáng)，校正死亡率均在80%以上。編號為NZM13-11的內(nèi)生細(xì)菌的殺線能力最強(qiáng)，并且能夠使松材線蟲蟲體發(fā)生消解，具有進(jìn)一步的研究價值。通過對菌株NZM13-11的進(jìn)一步研究，由表1可知，該菌株在12 h時原液處理對線蟲的死亡率可達(dá)到92.2%，并且對松材線蟲的蟲體有消解作用，消解率達(dá)到85%。在處理36 h后，線蟲的校正死亡率達(dá)到100%，消解率達(dá)到90%，在處理48 h后，線蟲體壁被完全消解，顯微鏡視野內(nèi)已觀察不到完整的線蟲蟲體。

表1 菌株NZM13-11對松材線蟲的殺線活性Table 1 Nematicidal activities of the strain NZM13-11 against B. xylophilus

通過對菌株NZM13-11發(fā)酵濾液稀釋，如圖1所示，在處理36 h后測定發(fā)現(xiàn)，在2倍稀釋下，線蟲的校正死亡率依然高達(dá)100%，并且消解率高達(dá)88%。在4倍、6倍和8倍稀釋下，線蟲的校正死亡率分別為92.5%、84.3%和72.9%，在4倍稀釋下對線蟲依然有較高的消解，消解率為83.1%。隨著處理時間的延長，死亡率逐漸升高，在36 h后達(dá)到100%。隨著稀釋倍數(shù)的增加，死亡率和消解率均有所降低，但是在稀釋8倍，處理36 h后，線蟲的校正死亡率依然達(dá)到72.9%。通過在顯微鏡下觀察被菌株NZM13-11發(fā)酵濾液處理后的松材線蟲，蟲體消解，表現(xiàn)為蟲體內(nèi)形成空泡，內(nèi)含物外滲，身體斷裂，如圖2所示。說明菌株NZM13-11的發(fā)酵濾液中可能含有某些能夠降解線蟲體壁的物質(zhì)。

圖1 不同稀釋倍數(shù)下菌株NZM13-11的殺線活性Fig.1 Nematicidal activities of the strain NZM13-11 against B. xylophilus under different dilution times

圖2 NZM 13-11菌株發(fā)酵濾液處理松材線蟲后的蟲體形態(tài)觀察Fig.2 Morphological observation of B.xylophilus treated with fermentation filtrate of NZM 13-11 strain

2.2 菌株NZM13-11的種類鑒定

2.2.1 形態(tài)觀察 如圖3所示，菌株NZM13-11在LB培養(yǎng)基上生長良好，菌落顏色為黃綠色，菌落的性狀為圓形、橢圓形，大小不一，邊緣不整齊，菌落隆起程度不一，菌落光滑濕潤且常呈融合狀態(tài)。革蘭氏染色結(jié)果顯示該菌株為革蘭氏陰性菌，菌體為桿狀。菌株NZM13-11的生長曲線如圖4所示，在2 h開始指數(shù)增長，在24 h后開始趨于穩(wěn)定。

圖3 菌株NZM13-11的菌落形態(tài)（A）和革蘭氏染色（B）Fig. 3 Colony morphology of strain NZM13-11（A）and Gram staining（B）

圖4 菌株NZM13-11的生長曲線Fig.4 Growth curve of strain NZM13-11

2.2.2 生理生化鑒定 NZM13-11生理生化實驗結(jié)果見表2。由表2可知該菌能夠利用葡萄糖和果糖，氧化酶、接觸酶陽性，是好氧型細(xì)菌，硝酸鹽還原和亞硝酸鹽還原反應(yīng)為陽性，能夠水解明膠，不能夠水解淀粉，具有精氨酸雙水解酶活性。

表2 菌株NZM13-11的生理生化特征Table 2 Physiological and biochemical characteristics of strain NZM13-11

2.2.3 菌株NZM13-11的16S rDNA測序結(jié)果及系統(tǒng)發(fā)育樹構(gòu)建 以菌株NZM13-11的基因組DNA為模板，擴(kuò)增16S rDNA序列，將提取的NZM13-11的16S rDNA序列送至上海生工進(jìn)行序列測定，菌株NZM13-11的16S rDNA序列總長1 401 bp。菌株NZM13-11的基因組DNA的電泳結(jié)果和16S rDNA的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果如圖5所示。

圖5 菌株NZM13-11的基因組DNA（A）以及16S rDNA的PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果（B）Fig.5 Electrophoresis results of genomic DNA（A）and16S rDNA PCR products（B）of strain NZM13-11

將內(nèi)生細(xì)菌NZM13-11的16S rDNA序列與EzBioCloud數(shù)據(jù)庫中的序列進(jìn)行比對，采用MEGA X進(jìn)行同源性分析并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，如圖6所示，由系統(tǒng)發(fā)育樹可以看出菌株NZM13-11與Pseudomonas aeruginosa（銅綠假單胞菌）在同一個遺傳分支上。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹，菌株NZM13-11與Pseudomonas aeruginosastrain DSM 50071和Pseudomonas aeruginosaJCM 5962表現(xiàn)出98%的相似性。

圖6 基于16S rDNA基因序列構(gòu)建的菌株NZM13-11的系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 6 Phylogenetic tree of strain NZM13-11 based on 16S rDNA gene sequence

結(jié)合菌落形態(tài)特征和生理生化特征，將NZM13-11鑒定為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。

3 討論

銅綠假單胞菌作為假單胞菌屬的一種模式菌株，常常也被稱為綠膿桿菌，同時也是臨床上三大條件性致病細(xì)菌之一，在自然界中存在廣泛。近年來，具有生防作用的銅綠假單胞菌逐漸被鑒定和分離。銅綠假單胞菌能夠分泌多種次級代謝產(chǎn)物，研究表明這些次級代謝產(chǎn)物，比如吩嗪類抗生素、生長素、鐵載體等［23］可以拮抗多種植物病原菌，因此成為農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的一種重要的生防菌株。近年來，研究人員分離篩選出很多具有生防作用的銅綠假單胞菌應(yīng)用于多種植物病害中。其中，肖咪云等［24-25］從植物根中分離得到的一株銅綠假單胞菌2016NX1對玉米大斑病菌、甘蔗鳳梨病菌、貢柑鏈格孢菌、辣椒炭疽病菌、水稻胡麻葉斑病菌等多種不同植物病原真菌的生長具有抑制作用。王雪潔等［26］從健康葡萄植株中分離得到157株內(nèi)生細(xì)菌，并篩選出一株對葡萄霜霉病菌具有防治效果的一株銅綠假單胞菌，并且該菌株對10種供試病原真菌均具有不錯的抑制作用。Bakthavatchalu［27］從根際土壤中分離到一株銅綠假單胞菌FP6，經(jīng)研究該菌株產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物對立枯病絲核菌和炭疽菌具有廣譜抗真菌活性，能夠使這兩種病原真菌的菌絲出現(xiàn)畸形現(xiàn)象。這些研究表明，銅綠假單胞菌在植物病害的生物防治方面具有很好的應(yīng)用價值。目前利用銅綠假單胞菌來防治松材線蟲病鮮有報道，牟亞妮等［28］從松墨天牛的蟲尸中分離到一株銅綠假單胞菌BRCCXG5，結(jié)果表明對松墨天牛表現(xiàn)出殺蟲活性。范津［29］對銅綠假單胞菌中毒性蛋白進(jìn)行南方根結(jié)線蟲殺蟲實驗，發(fā)現(xiàn)銅綠假單胞菌中毒性物質(zhì)不僅對秀麗隱桿線蟲具有殺蟲活性，對南方根結(jié)線蟲同樣具有毒性作用。

松材線蟲病對松林資源造成的嚴(yán)重威脅至今仍然無法對其進(jìn)行有效的控制，研究表明，許多生防細(xì)菌產(chǎn)生的一些代謝物質(zhì)對松材線蟲表現(xiàn)出強(qiáng)烈的殺線蟲活性。除此之外，利用生防細(xì)菌來防治松材線蟲有助于減少化學(xué)藥劑造成的環(huán)境污染，有助于保持生態(tài)系統(tǒng)的平衡。目前對于細(xì)菌是如何導(dǎo)致松材線蟲致死的機(jī)制尚不明確，主要是包括毒素致死，消解線蟲體表組織以及干擾線蟲行為模式等［7］。在嗜麥芽寡養(yǎng)單胞菌殺線蟲活性的研究中，從細(xì)菌濾液中提取的胞外蛋白酶能夠破壞線蟲的表皮組織，使其逐漸裂解消失，體內(nèi)細(xì)胞逐漸形成空泡，最終使蟲體基本裂解消失［30］。本研究從馬尾松內(nèi)生細(xì)菌篩選出一株內(nèi)生銅綠假單胞菌，首次證明了銅綠假單胞菌對松材線蟲的殺蟲活性，并且能夠使松材線蟲的體表發(fā)生消解，消解率在48 h達(dá)到100%。在顯微鏡下觀察到，在12 h時松材線蟲體表已經(jīng)出現(xiàn)消解，主要表現(xiàn)為線蟲體壁不完整，內(nèi)含物外滲，松材線蟲體內(nèi)出現(xiàn)空泡，在48 h時，線蟲的體壁被完全分解，顯微鏡視野內(nèi)沒有觀察到完整的蟲體。由于松材線蟲的體壁主要是由蛋白質(zhì)構(gòu)成，因此細(xì)菌產(chǎn)生的蛋白酶能夠分解松材線蟲的體壁，造成內(nèi)含物外滲，最終殺死松材線蟲［31］。目前銅綠假單胞菌對秀麗隱桿線蟲毒性作用的研究較為深入，主要是由于銅綠假單胞菌能夠產(chǎn)生一些毒性次級代謝產(chǎn)物比如蛋白酶、吩嗪、氰化物等從而起到毒殺的作用［32］。結(jié)合前人研究猜想銅綠假單胞菌可能是因為分泌的蛋白酶對線蟲起到消解的作用，但由于微生物侵染松材線蟲是一種復(fù)雜的過程，可能是一些其他毒力因子共同起作用從而起到殺蟲的作用。因此對于具體是哪種物質(zhì)起殺線作用還有待于進(jìn)一步研究。由于銅綠假單胞菌的次生代謝產(chǎn)物豐富［33］，后續(xù)也可以通過優(yōu)化培養(yǎng)基條件來提高次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生，從而提高其殺線能力。

從銅綠假單胞菌的安全性考慮，本研究篩選出來的殺線菌株與Pseudomonas aeruginosaJCM 5962和Pseudomonas aeruginosastrain DSM 50071在同一個遺傳分支上，研究表明，Pseudomonas aeruginosaJCM 5962是從甘蔗地的土壤中篩選出來的一株高脂溶性的能夠產(chǎn)生生物表面活性銅綠假單胞菌［34］，Pseudomonas aeruginosastrain DSM 50071是從油田土壤中篩選出來的石油降解菌［35］，它們都屬于非致病性的銅綠假單胞菌。本研究從松材線蟲寄主本身篩選出具有高效殺線活性的內(nèi)生銅綠假單胞菌，并發(fā)現(xiàn)該菌株的發(fā)酵濾液對松材線蟲具有消解能力。為篩選具有殺線活性的內(nèi)生細(xì)菌提供了新的微生物資源，也為松材線蟲病的生物防治提供了新思路。

4 結(jié)論

本研究以58株松樹內(nèi)生細(xì)菌為研究對象，測定了不同細(xì)菌菌株發(fā)酵濾液的殺線活力，其中NZM13-11的殺線活性最強(qiáng)，處理12 h、24 h和36 h的死亡率分別為92%、97%和100%，消解率為85%、86%和89%。在48 h線蟲死亡率和消解率均達(dá)到100%，在48 h時，松材線蟲的身體被完全消解，顯微鏡視野中不能觀察到完成的蟲體。NZM13-11的發(fā)酵濾液主要通過消解松材線蟲的體表，使線蟲內(nèi)容物外泄，最終使松材線蟲消解死亡。菌株NZM13-11為銅綠假單胞菌（Pseudomonas aeruginosa）。