pOsHAK1：OsFLN2提高水稻的糖代謝水平和抗旱性

陳光 李佳 杜瑞英 王旭

（1. 廣東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與監(jiān)測技術研究所，廣州 510640；2. 中國水稻研究所，杭州 311401）

干旱造成的危害83%以上發(fā)生在農(nóng)業(yè)領域，影響糧食供應和人民生活，已成為全球最嚴重的饑荒誘發(fā)因素［1］。水稻（Oryza sativaL .）是一種耗水量大的作物，對水分的需求使其極易遭受干旱脅迫，全球每年因干旱導致減產(chǎn)近1 800萬t［2］。我國水資源條件無法支撐傳統(tǒng)水稻的進一步發(fā)展，因此，創(chuàng)制抗旱水稻品種，可以緩解水稻生產(chǎn)中水資源的過度消耗，對保障糧食安全具有重要意義［3］。

植物的抗旱機制包括形態(tài)、生理適應和細胞調(diào)節(jié)等，在不同階段受遺傳因素控制。形態(tài)適應包括根系長度和生物量增加，蠟質(zhì)或厚葉覆蓋，葉重、葉形和表皮細胞減小，葉片衰老延緩以及綠葉面積增加。生理適應包括較高的氣孔密度和導度，蒸騰速率降低，更優(yōu)的生產(chǎn)、積累、同化以及營養(yǎng)器官的干物質(zhì)分配。細胞調(diào)節(jié)需要提高葉綠素含量、收獲指數(shù)和降低滲透勢［4］。非還原二糖和寡糖等滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)的積累、光合效率的降低以及碳水化合物代謝的改變，在緩解脅迫中發(fā)揮重要作用［4］。光合產(chǎn)物主要以蔗糖的形式在體內(nèi)長距離運輸，既為組織代謝提供能量，又作為信號分子和滲透調(diào)節(jié)劑在有限的水分供應下防止器官損傷［5］。維持不同組織間的糖分穩(wěn)態(tài)對逆境脅迫下植株的生長發(fā)育至關重要［6］。對C4-磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶轉(zhuǎn)基因株系的生理研究表明，蔗糖代謝影響水稻的抗旱性［7］。在干旱等非生物脅迫條件下增強海藻糖的生物合成可以顯著提高水稻產(chǎn)量［8］。OsGolS2過表達水稻抗旱性的提高是體內(nèi)棉子糖半乳糖苷系列寡糖的積累所致［9］。

本研究的目標，一是明確糖分代謝是否與水稻干旱脅迫響應有關；二是探討在水分缺乏條件下，促進體內(nèi)糖分代謝是否可以提高水稻的抗旱性。啟動子和功能基因的確定基于前期研究結(jié)果，選擇使用受干旱/滲透脅迫誘導上調(diào)表達的基因OsHAK1的啟動子［10］，驅(qū)動編碼果糖激酶類似蛋白基因OsFLN2［11］在水稻中表達，發(fā)現(xiàn)干旱脅迫下，pHAK1：FLN2促進體內(nèi)糖分的合成和運輸，并顯著提高植株的抗旱性。因此，將干旱誘導型基因啟動子與糖代謝基因結(jié)合，是創(chuàng)造穩(wěn)產(chǎn)、高抗種質(zhì)有效的轉(zhuǎn)基因策略。

1 材料與方法

1.1 材料

為了構建pHAK1：FLN2轉(zhuǎn)基因水稻，以日本晴（Nipponbare）cDNA為模板擴增FLN2基因的編碼序列（CDS，1 770 bp），純化后用GBclonart無縫克隆試劑盒（蘇州神洲基因有限公司）連接到經(jīng)BamH I和SpeI雙酶切的pTCK303線性載體上，獲得中間載體pTCK303-FLN2；再以日本晴DNA為模板擴增OsHAK1的啟動子（起始密碼子上游3 037 bp），純化后用同樣方法連接到經(jīng)Hind III和BamH I雙酶切的pTCK303-FLN2線性載體上，獲得最終載體pHAK1-FLN2。將該載體電轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌EHA105中，并侵染日本晴愈傷，遺傳轉(zhuǎn)化方法詳見Chen等［10］。T0-T2代轉(zhuǎn)基因材料種植于廣東省農(nóng)業(yè)科學院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標準與監(jiān)測技術研究所廣州大豐試驗基地和中國水稻研究所杭州富陽試驗基地的轉(zhuǎn)基因苗圃。用水培營養(yǎng)液中加入15%（W/V）聚乙二醇（PEG）6000模擬干旱脅迫，選擇兩個生育期的水稻（1.苗期，2周苗齡；2.分蘗期，6周苗齡）分別處理7 d和10 d，記錄表型、測定各項生理生化指標以及分析基因表達模式。實驗在14 h光照（30℃）/10 h黑暗（25℃）光周期、相對濕度約70%的人工氣候室進行，所有處理每隔2 d更換一次營養(yǎng)液，營養(yǎng)液組成和配制詳見Chen等［12］。

1.2 方法

1.2.1 凈光合速率（Pn）的測定 參照Chen等［13］的方法，利用Li-COR6400便攜式光合儀（Li-COR，美國）測定上午9：00-11：00水稻葉片的凈光合速率。

1.2.2 蔗糖磷酸合成酶（sucrose phosphate synthase，SPS）活性測定 干旱處理后收獲植株的葉片，液氮研磨成粉末，利用SPS試劑盒（蘇州科銘生物技術有限公司）提取并參照Chen等［14］的方法進行測定。

1.2.3 蔗糖外運速率（rate of sucrose export，SER）的測定 參照Chen等［14］的EDTA法從源葉中收集韌皮部滲出液，葉片的切口端立即浸入20 mL 30 mmol/L EDTA溶液中（pH 7.0），黑暗中浸泡15 min。為了避免木質(zhì)部滲出液的影響，棄去第一次的EDTA溶液，然后將葉片洗凈，轉(zhuǎn)移至10 mL 30 mmol/L EDTA溶液中，整個采集過程中，葉片置于高相對濕度的密閉暗室。4 h后，利用蔗糖試劑盒測定收集液中的蔗糖濃度。

1.2.4 蔗糖含量的測定 脅迫處理后收獲植株的葉片和根系，液氮研磨成粉末，利用蔗糖試劑盒（蘇州科銘生物技術有限公司）提取并參照Chen等［11］的方法進行測定。

1.2.5 實時熒光定量PCR（RT-qPCR） 參照Chen等［15］的步驟，分別提取正常和干旱處理下T1代轉(zhuǎn)基因株系、不含目的片段的分離株系和野生型（WT）植株地上部以及T2代純合株系和WT植株葉片的RNA。水稻UBQ5（LOC_Os01g22490）為內(nèi)參基因，參照Chen等［16］的算法確定相對表達豐度，引物序列見表1。

表1 熒光定量PCR所用引物Table 1 Primers used for RT-qPCR assays

1.2.6 根長和根表面積的測定 參照Chen等［17］的方法，利用根系分析儀（WinRhizoV4.0b，Regent Instrument公司，加拿大）掃描不同處理的根系，記錄總根長和根表面積。每個處理每個株系測量5個單株。

1.2.7 相對含水量和失水率的測定 相對含水量（RWC）的測定方法參照Chen等［17］：脅迫結(jié)束后將植株葉片離體稱重，記錄鮮重（FW），將這些葉片用去離子水浸泡4 h，測定其飽和重量（SW），葉片80℃烘干48 h，確定干重（DW），RWC按公式計算：RWC（%）=（FW-DW）/（SW-DW）×100%。參照Chen等［17］的方法測定離體葉片失水率。將苗期WT和轉(zhuǎn)基因植株葉片剪碎稱重，然后在室溫下暴露于空氣中，在指定時間點稱重后計算。

1.2.8 電解質(zhì)滲透率的測定 電解質(zhì)滲漏分析參照Chen等［18］的方法進行：新鮮的葉片收獲后用去離子水清洗以去除表面附著的離子，之后立即放入裝有30 mL去離子水的燒杯中，將燒杯置于25℃，120 r/min振蕩3 h，用電導率儀（EC215，Hanna，意大利）測定浸泡液的電導率（EC1）。然后將浸入溶液的樣品在100℃下煮沸20 min，冷卻至室溫后測量溶液的電導率（EC2）。相對電解質(zhì)滲透率（REL）按公式計算：REL（%）=EC1/EC2×100%。

1.2.9 脯氨酸含量的測定 參照Chen等［18］的方法測定葉片中的脯氨酸的含量：取葉片約0.5 g，用5 mL 3%磺基水楊酸勻漿，12 000×g離心10 min，取1 mL上清液與1 mL酸性茚三酮和1 mL冰乙酸混合，100℃孵育1 h，在冰浴中終止反應，用2 mL甲苯萃取顯色，用酶標儀（SpectraMax M5，Molecular Devices公司，美國）在520 nm處測定吸光度。

2 結(jié)果

2.1 干旱脅迫影響水稻糖分代謝

15% PEG處理后，水稻體內(nèi)糖分代謝發(fā)生顯著變化，葉片的凈光合速率、SPS活性和蔗糖外運速率分別降低31%、24%和39%（圖1-A-C）。干旱顯著抑制蔗糖從源到庫的轉(zhuǎn)運，表現(xiàn)為脅迫下葉片中蔗糖含量增加40%，而根中卻減少25%（圖1-D-E）。

圖1 干旱脅迫對水稻糖分代謝的影響Fig. 1 Effects of drought stress on sugar metabolism in rice

2.2 構建pHAK1：FLN2轉(zhuǎn)基因水稻

基于干旱誘導水稻糖代謝發(fā)生變化的研究現(xiàn)象，通過pHAK1：FLN2轉(zhuǎn)基因株系與WT之間干旱脅迫響應的差異分析，驗證促進糖分的合成和運輸是否可以提高水稻的抗旱性。利用GUS染色鑒定陽性植株，T0代共獲得24個獨立的轉(zhuǎn)基因株系（圖2）。

圖2 表達載體的構建及水稻遺傳轉(zhuǎn)化過程Fig. 2 Construction of expression vector and process of genetic transformation in rice

選擇5個T1代陽性株系及其相應的不含目的片段的分離株系（null segregant，NS）分析FLN2的表達量和凈光合速率，發(fā)現(xiàn)在正常和干旱條件下，NS和WT均沒有差異；在WT和NS的地上部，干旱抑制FLN2的表達，但在轉(zhuǎn)基因植株中，F(xiàn)LN2的表達量增加1-2倍（圖3-A）；與此同時，凈光合速率的下降幅度顯著低于WT和NS（圖3-B），因此在T2代的水培試驗中，選擇GUS染色全部陽性的兩個純合pHAK1：FLN2株系并以WT作為唯一的陰性對照。

圖3 干旱脅迫下T1代pHAK1：FLN2轉(zhuǎn)基因株系與WT的FLN2表達量和凈光合速率差異分析Fig. 3 Differential analysis of FLN2 expression and net photosynthetic rate between T1 generation of pHAK1：FLN2 transgenic lines and WT in response to drought stress

2.3 pHAK1：FLN2對水稻苗期生長的影響

在正常和含15% PEG的水稻營養(yǎng)液中培養(yǎng)WT和T2代pHAK1：FLN2純合轉(zhuǎn)基因株系，評估pHAK1：FLN2的表達如何影響水稻生長。如圖4所示，在正常營養(yǎng)液中生長時，轉(zhuǎn)基因植株與WT的生長沒有差異，地上部和根系生物量相似。將幼苗置于干旱脅迫下，WT植株葉片嚴重萎蔫，而轉(zhuǎn)基因植株的失水表型明顯減輕，此外，干旱對轉(zhuǎn)基因植株地上部和根系生長的抑制程度顯著低于WT，導致脅迫下地上部干重高于WT 15%-17%，根系干重高于WT 13%-20%（圖4-B，C）。

圖4 干旱脅迫下pHAK1：FLN2轉(zhuǎn)基因株系與WT的苗期生長差異分析Fig. 4 Seedling growth of pHAK1：FLN2 transgenic lines compared with WT in response to drought stress

2.4 pHAK1：FLN2對水稻體內(nèi)糖代謝的影響

對WT和pHAK1：FLN2轉(zhuǎn)基因植株體內(nèi)的糖代謝水平進行分析比較，以驗證轉(zhuǎn)基因株系是否通過維持糖分穩(wěn)態(tài)來提高水稻的抗旱性。糖分合成關鍵酶SPS的活性在對照條件下，WT和轉(zhuǎn)基因植株沒有顯著差異（圖5-A），在PEG處理下，WT的SPS活性只有轉(zhuǎn)基因株系的87%（圖5-A）。pHAK1：FLN2的表達在干旱脅迫下顯著提高糖分從源到庫的轉(zhuǎn)運，具體表現(xiàn)為轉(zhuǎn)基因株系葉片的蔗糖外運速率高于WT 25%-37%，葉片中的蔗糖含量比WT低6%-13%，而根中的蔗糖含量比WT高7%-10%（圖5-B-D）。

圖5 干旱脅迫下pHAK1：FLN2轉(zhuǎn)基因株系與WT的糖代謝差異分析Fig. 5 Differential analysis of sugar metabolism between pHAK1：FLN2 transgenic lines and WT in response to drought stress

2.5 pHAK1：FLN2對水稻根系構型的影響

根系構型影響干旱條件下水分的高效獲取，進一步明確pHAK1：FLN2轉(zhuǎn)基因植株與WT根系對干旱的響應是否存在差異。如圖6所示，PEG處理顯著降低植株的總根長和根表面積，但對WT根的影響相對較強，導致受脅迫轉(zhuǎn)基因株系的總根長高于WT 16%-21%，根表面積高于WT 9%-13%。

圖6 干旱脅迫下pHAK1：FLN2轉(zhuǎn)基因株系與WT的根系構型差異分析Fig. 6 Differential analysis of root system architecture between pHAK1：FLN2 transgenic lines and WT in response to drought stress

2.6 pHAK1：FLN2對水稻持水能力和脂質(zhì)過氧化程度的影響

干旱脅迫下，與對照相比，WT和轉(zhuǎn)基因株系的相對含水量均降低，但轉(zhuǎn)基因植株的相對含水量顯著高于WT（圖7-A），可能歸因于植株的失水率不同，即WT離體葉片失水的速度快于轉(zhuǎn)基因株系（圖7-B），這些結(jié)果表明pHAK1：FLN2的表達提高水稻的保水能力。

在正常生長條件下，WT和轉(zhuǎn)基因水稻植株具有相似的電解質(zhì)滲透率和脯氨酸含量，但在干旱處理后，轉(zhuǎn)基因株系的電解質(zhì)滲透率只有WT的74%-81%（圖7-C），而脯氨酸含量高于WT 29%-33%（圖7-D）。綜上，pHAK1：FLN2轉(zhuǎn)基因株系抗旱性的提高可能是由于植株較強的保水能力、較少的電解質(zhì)外滲以及較多的脯氨酸積累。

圖7 干旱脅迫下pHAK1：FLN2轉(zhuǎn)基因株系與WT的保水能力和脂質(zhì)過氧化程度差異分析Fig. 7 Differential analysis of water-content ability and lipid peroxidation between pHAK1：FLN2 transgenic lines and WT in response to drought stress

2.7 pHAK1：FLN2對衰老、脅迫響應基因表達的影響

為進一步明確pHAK1：FLN2的表達提高水稻抗旱性的機制，對正常和干旱條件下生長的WT和轉(zhuǎn)基因株系進行基因表達差異分析。所選基因分為兩類，SGR和ATG8a屬于衰老指示基因，SNAC1和MYB2是脅迫響應基因。正常條件下檢測到所選基因相對較弱的表達，并且在WT和轉(zhuǎn)基因植株中的差異不明顯（圖8）。脅迫處理后，基因的表達量相較于對照植株均顯著提高，衰老指示基因在pHAK1：FLN2植株中的上調(diào)幅度低于WT，導致SGR表達量只有WT的56%-63%，ATG8a表達量只有WT的66%-74%（圖8-A，B）；而脅迫響應基因在轉(zhuǎn)基因株系中的上調(diào)幅度高于WT，導致SNAC1表達量是WT的1.35-1.61倍，MYB2表 達 量 是WT的1.31-1.47倍（圖8-C，D）。這些結(jié)果表明，抑制干旱誘導的衰老指示基因和促進脅迫響應基因的上調(diào)表達，是pHAK1：FLN2轉(zhuǎn)基因株系抗旱性提高的重要原因之一。

圖8 干旱脅迫下pHAK1：FLN2轉(zhuǎn)基因株系與WT中衰老和脅迫響應相關基因的表達差異分析Fig. 8 Differential analysis of expressions of senescenceassociated genes and stress-responsive genes between pHAK1：FLN2 transgenic lines and WT in response to drought stress

3 討論

通過在正常營養(yǎng)液中加入15% PEG模擬干旱脅迫處理水稻，體內(nèi)糖代謝發(fā)生顯著變化，具體表現(xiàn)為糖合成受抑制（凈光合速率和SPS活性降低）以及糖轉(zhuǎn)運受阻（蔗糖外運速率和根系蔗糖含量減少），此結(jié)果與前人報道的相似，即干旱逆境下植物有限的光合作用附以能量需求和滲透調(diào)節(jié)的改變，影響光合產(chǎn)物在源和庫組織之間的運輸和分配［19-20］?；诖?，我們提出通過促進干旱脅迫下的糖代謝來提高水稻抗旱性的實驗假設，采取構建表達載體并遺傳轉(zhuǎn)化水稻的方式進行驗證。鑒于組成型過表達功能基因常常導致不利的生長發(fā)育表型，而誘導型啟動子可以有效避免這一問題［12，17］，我們選擇已經(jīng)明確滲透/干旱響應關鍵區(qū)段的OsHAK1啟動子［10］。糖代謝相關基因選擇研究組前期克隆的FLN2，該基因編碼pfkB家族中的果糖激酶類似蛋白，影響水稻前質(zhì)體和葉綠體的發(fā)育，并且促進糖分的合成和運輸，提高水稻的耐鹽性［11］。與預期一致，pHAK1：FLN2轉(zhuǎn)基因株系在對照條件下正常生長，沒有出現(xiàn)不利的表型，而PEG處理后，糖代謝指標Pn、SPS、SER均顯著高于WT，這與FLN2在干旱脅迫下的誘導表達密切相關，并且在T1代和T2代穩(wěn)定遺傳。

研究表明，pHAK1：FLN2轉(zhuǎn)基因植株的耐旱性顯著提高，可能是形態(tài)、生理和分子水平上變化的綜合結(jié)果。首先，pHAK1：FLN2轉(zhuǎn)基因植株產(chǎn)生更繁茂的根系，在形態(tài)水平上有助于抗逆性的改善。根系的大小和構型決定植物獲得水分和養(yǎng)分的能力，是許多農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)中限制生長和產(chǎn)量的關鍵因素，因此，根系構型優(yōu)化與抗旱性呈正相關關系［21］。許多轉(zhuǎn)錄因子可以通過改變根系構型來提高植物的耐受性［22-23］。pHAK1：FLN2的表達，促進水稻根系生長，在干旱脅迫下，pHAK1：FLN2轉(zhuǎn)基因植株根系的生物量、總根長和根表面積均顯著高于WT，這可能與作為營養(yǎng)物質(zhì)的蔗糖在庫器官的含量有關。

pHAK1：FLN2引起的第二個重要變化是滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)積累量增加，有助于提高轉(zhuǎn)基因植株的抗逆性。非生物脅迫可以改變韌皮部汁液中蔗糖的濃度，有助于植物抵御逆境［5］，此外，可溶性糖也會在干旱脅迫的馬鈴薯庫葉中積累［24］，與這些報道一致，轉(zhuǎn)基因植株中蔗糖外運速率和根系蔗糖含量與WT相比均顯著增加。脯氨酸是一種滲透保護劑，與滲透調(diào)節(jié)和膜在干旱脅迫下的穩(wěn)定性有關［25］。在本研究中，PEG處理后pHAK1：FLN2轉(zhuǎn)基因株系脯氨酸含量顯著高于WT。脯氨酸含量的增加會導致滲透勢升高，從而降低水勢，使植物更有效地保持水分［26］，與之相似，轉(zhuǎn)基因株系的葉片比WT具有更高的相對含水量和更低的失水率。鑒于脯氨酸可以作為抗氧化劑來減少脅迫過程中的氧化損傷［27］，因此，干旱脅迫下，pHAK1：FLN2的表達導致較高的脯氨酸含量在一定程度上有助于降低電解質(zhì)滲透率，表明干旱引起的轉(zhuǎn)基因植株脂質(zhì)過氧化程度低于WT。

第三，RT-qPCR分析顯示基因表達差異與轉(zhuǎn)基因植株的抗逆表型之間存在相關性。干旱脅迫誘導的早衰會引起水稻性狀發(fā)生一系列變化，分蘗、葉片伸展和光合作用因早衰而受抑制［4］。衰老誘導的SGR基因在調(diào)控葉綠素降解中起重要作用［28］。自噬與植物衰老相關，是降解和轉(zhuǎn)運大分子的主要機制［29］，水稻自噬基因OsATG8a在葉片衰老過程中表達量增加［30］。SGR和OsATG8a在轉(zhuǎn)基因株系中受干旱誘導增強表達的趨勢顯著低于WT，表明pHAK1：FLN2的表達減緩PEG處理引發(fā)的葉片衰老。許多研究表明，脅迫/ABA響應基因的誘導表達，增強植物對各種脅迫的耐受性［25，31］。本研究中，與干旱處理后的WT相比，轉(zhuǎn)基因植株中2個脅迫相關基因的受誘導程度更為明顯。SNAC1顯著提高轉(zhuǎn)基因水稻在營養(yǎng)和生殖生長期的抗旱性［32］。OsMYB2編碼一個脅迫響應MYB轉(zhuǎn)錄因子，對水稻鹽、冷、干旱逆境的耐受性起調(diào)控作用［33］。因此，這些基因的誘導表達可能是pHAK1：FLN2轉(zhuǎn)基因株系抗旱性提高的另一重要原因。

4 結(jié)論

干旱抑制水稻體內(nèi)糖分的合成和運輸，利用干旱誘導型基因OsHAK1的啟動子驅(qū)動FLN2的表達，可以改善脅迫下的糖代謝水平，進而提高水稻的抗旱性。