基于環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增的抗蟲(chóng)基因超靈敏比色生物傳感器構(gòu)建

李佳樂(lè) 林晟豪 許文濤，

（1. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營(yíng)養(yǎng)工程學(xué)院 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)業(yè)轉(zhuǎn)基因生物安全評(píng)價(jià)（食用）重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083；2. 中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)營(yíng)養(yǎng)與健康系 食品精準(zhǔn)營(yíng)養(yǎng)與質(zhì)量控制教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100083）

具有抗蟲(chóng)特性的轉(zhuǎn)基因作物是借助DNA重組技術(shù)，將外源抗蟲(chóng)基因整合到對(duì)應(yīng)生物體中，使其表達(dá)出良好的抗蟲(chóng)特性并且能穩(wěn)定遺傳給后代的一類作物?？瓜x(chóng)基因源于蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis，Bt）中的Bt基因，該基因被廣泛用作抗蟲(chóng)外源基因。目前，Bt基因中運(yùn)用最廣泛的是Cry1A基因，在已商業(yè)化的49個(gè)抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因作物轉(zhuǎn)化體中有32 個(gè)含有Cry1A基因，占65.3%［1］，而Cry1A基 因 又 包 括Cry1Ab、Cry1Ac、Cry1Ab/Ac、Cry1A.105［2］和mCry1Ac［3］。利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改造的抗蟲(chóng)農(nóng)作物可以很好的減少農(nóng)藥使用，減少農(nóng)業(yè)生產(chǎn)成本，保護(hù)生態(tài)環(huán)境和人類健康［4-5］。目前一些商業(yè)化轉(zhuǎn)基因作物已經(jīng)得到了推廣，包括抗蟲(chóng)水稻、玉米和棉花等。但由于抗蟲(chóng)轉(zhuǎn)基因作物的推廣和轉(zhuǎn)基因技術(shù)的不斷發(fā)展，對(duì)于相應(yīng)的檢測(cè)技術(shù)也提出了挑戰(zhàn)。

目前，具有抗蟲(chóng)特性的轉(zhuǎn)基因產(chǎn)品的檢測(cè)可以從DNA、mRNA轉(zhuǎn)錄、蛋白質(zhì)或代謝物水平等多個(gè)不同層面進(jìn)行［6-8］。DNA和RNA水平的外源核酸檢測(cè)技術(shù)具有高靈敏度、高特異性和穩(wěn)定性，核酸檢測(cè)方法則以PCR和環(huán)介導(dǎo)等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)（loopmediated isothermal amplification，LAMP）為主［9-10］。LAMP最早由Notomi提出，在60-65℃恒溫條件下，通過(guò)鏈置換DNA聚合酶（Bst DNA聚合酶）的作用，4-6條特殊設(shè)計(jì)的引物可以特異性結(jié)合到模板基因的6-8個(gè)區(qū)域上，可以在30-60 min完成核酸擴(kuò)增［11］。該恒溫方法常見(jiàn)的信號(hào)輸出方式有比色法［12］、熒光法［10，13］、電化學(xué)法［14-15］。其中，比色法因其操作簡(jiǎn)單、現(xiàn)象明顯、可以與微流控結(jié)合形成快速檢測(cè)芯片等優(yōu)勢(shì)得到更為廣泛的應(yīng)用。目前比色法常用染料如基于pH變化的中性紅［16］、羥基溴酚藍(lán)（hydroxynaphthol blue，HNB）［17］，基于Mg2+濃度的鈣黃綠素［18］，均可在檢測(cè)終點(diǎn)形成明顯的顏色變化，指示目標(biāo)基因擴(kuò)增反應(yīng)的發(fā)生。

基于pH指示劑的方法原理是在LAMP擴(kuò)增中，隨著dNTP大量引入到擴(kuò)增子中，會(huì)產(chǎn)生焦磷酸根和大量H+，而焦磷酸的部分水解也會(huì)產(chǎn)生一定量的H+，在弱緩沖體系下，積累的H+可以實(shí)現(xiàn)體系的pH明顯降低，跨越pH指示劑的突變區(qū)間，使pH指示劑變色。LAMP體系反應(yīng)前的pH值約為8.8，反應(yīng)后下降到6.0-6.5，可以依據(jù)此選取指示劑以表征反應(yīng)的發(fā)生［19］。通常選用的pH指示劑包括中性紅［20］、苯酚紅［21］、甲酚紅［22］和二甲酚橙［23］，分別能實(shí)現(xiàn)黃色到粉紅色、粉紅色到黃色、紫紅色到黃色、粉紅色到橙黃色的轉(zhuǎn)變。然而上述4種常用的指示劑的顏色變化均為突變，尚不具備半定量潛力。溴百里酚藍(lán)（bromothymol blue，BTB）是一種性能穩(wěn)定的pH指示劑，其可以依據(jù)溶液pH由堿性到酸性實(shí)現(xiàn)由藍(lán)色（pH 7.6）到黃色（pH 6.0）的漸變，發(fā)生顏色改變的pH區(qū)間與LAMP反應(yīng)前后pH變化區(qū)間有很大重合，且顏色變化可以在自然光下由裸眼區(qū)分［24］。因?yàn)槠湓谝欢▍^(qū)間內(nèi)隨pH變化可以產(chǎn)生裸眼可視的明顯顏色變化，在肉類［25］、奶類［26］質(zhì)量安全的現(xiàn)場(chǎng)快速檢測(cè)方面有良好的適用性。此外BTB還可以用于紫外分光光度計(jì)實(shí)現(xiàn)定量檢測(cè)，例如，Ong等［27］利用pH 7.2的BTB溶液快速篩選可生產(chǎn)脂肽的菌株，并且可以在410 nm和616 nm處實(shí)現(xiàn)對(duì)脂肽的定量檢測(cè)。Ramadan等［28］基于格列美脲（GLM）與BTB可形成黃色離子復(fù)合物開(kāi)發(fā)了一種簡(jiǎn)便、精準(zhǔn)的紫外分光光度法用于測(cè)定純制劑和藥物制劑中的GLM，可在412 nm處定量。近期，Gul等［29］還提出了一種基于BTB指示的非儀器化環(huán)氧化物檢測(cè)方法，利用鹵素脫鹵酶（HheC）催化環(huán)氧化物底物開(kāi)環(huán)引起pH變化從而使BTB變色，使用智能手機(jī)即可完成對(duì)圖像采集和數(shù)據(jù)處理，完成對(duì)環(huán)氧化物含量的測(cè)定，大大降低了分析成本和難度。

但目前將BTB作為L(zhǎng)AMP反應(yīng)指示劑的相關(guān)研究暫無(wú)，基于此，本研究以科豐6號(hào)（Kefeng 6，KF6號(hào)）轉(zhuǎn)基因水稻作為模式植物，根據(jù)Cry1Ac和Cry1Ab/Ac基因的同源區(qū)域設(shè)計(jì)6條LAMP特異性引物，選取BTB作為顯色指示劑，構(gòu)建pH響應(yīng)的LAMP生物傳感器，以期快速、靈敏、一步法篩查靶基因。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料與試劑 本實(shí)驗(yàn)中的轉(zhuǎn)基因作物均由實(shí)驗(yàn)室保存，測(cè)試樣品品種及Cry1A基因具體信息見(jiàn)表1。所用天根生化科技（北京）有限公司的多糖多酚植物基因組DNA提取試劑盒和RNase A購(gòu)于TIANGEN公司，dNTP Mixture購(gòu)于日本TaKaRa公司，Bst 2.0 polymerase、10×Thermopol Reaction Buffer、MgSO4購(gòu)于NEB公司，甜菜堿（betaine）購(gòu)于美國(guó)Sigma，SYTO 9 Green Fluorescent Nucleic Acid Stain購(gòu)于美國(guó)Invitrogen公司，溴百里酚藍(lán)（BTB）購(gòu)于天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司，瓊脂糖購(gòu)于上海百晶生物技術(shù)有限公司，Tris購(gòu)于北京博奧拓達(dá)科技有限公司。

表1 測(cè)試轉(zhuǎn)基因及非轉(zhuǎn)基因樣品Cry1A基因具體信息Table 1 Test specific information of Cry1A gene in GMO and non-GMO samples

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 FQD-96A熒光定量PCR擴(kuò)增儀（杭州博日科技股份有限公司）、NanoDrop one分光光度計(jì)（美國(guó)Thermo Fisher公司）、HZP-L502 pH計(jì)（華志電子科技有限公司）、SH-510凝膠成像系統(tǒng)（杭州申花科技有限公司）。

1.2 方法

本文的LAMP生物傳感器利用環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增實(shí)現(xiàn)Cry1Ac或Cry1Ab/Ac基因核酸信號(hào)放大，在保證酶活的同時(shí)將緩沖液的緩沖能力降低，使得LAMP反應(yīng)前后體系有更大的pH變化，并以BTB為指示劑實(shí)現(xiàn)一步可視化檢測(cè)。檢測(cè)原理如圖1所示。在LAMP擴(kuò)增中有大量的DNA鏈合成，每一分子的dNTPs被合成到新的鏈上時(shí)都會(huì)產(chǎn)生一分子的焦磷酸根和H+，焦磷酸根的部分水解也伴隨著一定量H+產(chǎn)生。以BTB為指示劑的LAMP生物傳感器可以響應(yīng)LAMP反應(yīng)過(guò)程中產(chǎn)生的H+，從而實(shí)現(xiàn)體系從綠色到黃綠色，再到黃色的變色。

1.2.1 植物基因組DNA的提取 所有轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因植物的基因組DNA提取參照天根生化科技（北京）有限公司的多糖多酚植物基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)。所得的基因組使用NanoDrop one分光光度計(jì)測(cè)定基因組DNA濃度，并將基因組濃度調(diào)整至50、25和5 ng/μL。

1.2.2 引物序列設(shè)計(jì) 比較Cry1A基因中Cry1Ab（AY326434.1）、Cry1Ac（Y09787.1）、Cry1Ab/Ac（EU816953.1）、Cry1A.105［2］和mCryAc［3］的序列，選取Cry1 Ac和Cry1Ab/Ac的同源區(qū)域（附圖1-A），及Cry1Ab、Cry1A.105和mCry1Ac的非同源區(qū)域?yàn)榘袠?biāo)基因（附圖1-B），命名為Cry1Ac&Ab/Ac。利用LAMP Primer Explorer 5在線軟件（http://primerexplorer.jp/e/v5_manual/index.html）設(shè)計(jì)3組引物，其中第二套與第三套的BIP引物相同（表2）。所有引物均由上海生工生物工程公司合成，PAGE純化。

表2 LAMP引物設(shè)計(jì)表Table 2 LAMP primer design table

圖1 檢測(cè)原理圖Fig. 1 Detection principle diagram

1.2.3 LAMP非開(kāi)蓋可視化體系的構(gòu)建與優(yōu)化 建立25 μL的LAMP擴(kuò)增體系，包 括10×Isothermal amplification buffer、0.6 mol/L Betaine、0.5 mmol/L dNTP、3 mmol/L MgSO4、0.2 μmol/L F3和B3、1.6 μmol/L FIP和BIP、0.8 μmol/L LF和LB、0.4 μmol/L SYTO 9、8 U Bst 2.0 polymerase、400 pg/μL Kefeng 6轉(zhuǎn)基因水稻基因組，以下涉及的所有操作均進(jìn)行了3次生物學(xué)平行。反應(yīng)液充分混勻后置于博日熒光定量PCR儀中，64℃反應(yīng)1 h，每1 min讀取一次FAM信號(hào)，85℃ 3 min。調(diào)整10×Isothermal amplification buffer中的Tris終濃度分別為0、6.5、13、19.5、26、32.5、39、52、65、130 mmol/L，并保持緩沖液的天然pH，隨后在弱緩沖體系中添加1 μL的0.1% BTB pH指示劑，肉眼觀察反應(yīng)終點(diǎn)的顏色變化。最后優(yōu)化0.1% BTB的添加量分別為0.75、1.0、1.25、1.5、2.0 μL。

1.2.4 LAMP特異性測(cè)試 分別以常見(jiàn)的商業(yè)化轉(zhuǎn)基因作物的基因組DNA為模版，評(píng)價(jià)本文中LAMP方法的特異性。7種轉(zhuǎn)基因作物分別為轉(zhuǎn)基因水稻Kefeng8號(hào)、轉(zhuǎn)基因水稻TT51、轉(zhuǎn)基因玉米Bt11、轉(zhuǎn)基因玉米Bt176、轉(zhuǎn)基因玉米MON810、轉(zhuǎn)基因棉花MON 15985、轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1，2種非轉(zhuǎn)基因作物包括五優(yōu)稻4號(hào)和粳稻糙米。采用優(yōu)化后的LAMP反應(yīng)體系，64℃恒溫反應(yīng)1 h，85℃ 3 min，添加1.5 μL BTB用于可視化分析，隨著LAMP反應(yīng)中H+的不斷生成，構(gòu)建的生物傳感器能夠響應(yīng)pH的變化，當(dāng)體系中存在靶標(biāo)時(shí)響應(yīng)為黃色，當(dāng)沒(méi)有靶標(biāo)存在時(shí)則為綠色。裸眼判定終點(diǎn)后，結(jié)合瓊脂糖電泳進(jìn)行雙重驗(yàn)證。

1.2.5 LAMP靈敏度分析 將Kefeng 6轉(zhuǎn)基因水稻的基因組進(jìn)行梯度稀釋，依據(jù)公式：拷貝/μL=（ng/μL×NA）/（堿基對(duì)長(zhǎng)度×109×650D）得到濃度分別為2.12×105、1.06×105、2.12×104、4.24×103、8.48×102、3.4×100、1.7×100拷貝/μL的基因組樣品，通過(guò)瓊脂糖電泳和可視化方法進(jìn)行比較分析。

2 結(jié)果

2.1 最佳引物篩選

為了篩選出最優(yōu)的引物，比較了3套引物的實(shí)時(shí)定量擴(kuò)增曲線和終點(diǎn)時(shí)的凝膠電泳圖。從圖2-A中可以看出，Cry1Ac&Ab/Ac -2引物在20 min左右就出現(xiàn)了擴(kuò)增曲線，相比于其他兩套引物具有最小的Ct值。圖2-B的電泳結(jié)果中Lane 3的條帶亮度最強(qiáng)，表明Cry1Ac&Ab/Ac-2引物可以在相同擴(kuò)增時(shí)間內(nèi)得到最多的擴(kuò)增產(chǎn)物。為了獲得更低的檢測(cè)限線和使得終產(chǎn)物中有更多的H+，選擇Cry1Ac&Ab/Ac-2引物進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 引物篩選圖Fig.2 Primer screening diagram

2.2 比色方法的可行性及優(yōu)化

顯色體系中的Tris濃度優(yōu)化結(jié)果如圖3-A所示，Tris的最優(yōu)終濃度為3.25 mmol/L，而不是經(jīng)典的20 mmol/L，可能是20 mmol/L的Tris終濃度的體系更具有普適性和擴(kuò)增過(guò)程中的穩(wěn)定性，但是3.25 mmol/L Tris的環(huán)境對(duì)于該體系的擴(kuò)增初期最有利。BTB的添加量?jī)?yōu)化結(jié)果如圖3-B，C所示，隨著0.1%BTB的添加量的增加，即該生物傳感器中的顯色劑含量增加，可視化響應(yīng)效果也隨之增加，尤其在添加量0.75-1.5 μL時(shí)。但是可能是由于BTB溶液中含有乙醇，其添加量的增加對(duì)于傳感器的LAMP擴(kuò)增效率有一定抑制作用，但是抑制效果較小，所以優(yōu)先考慮BTB的指示效果，選取其添加量為1.5 μL，見(jiàn)圖3-B中的紅框。

圖3 比色方法可行性及優(yōu)化Fig. 3 Feasibility and optimization of colorimetric method

2.3 特異性驗(yàn)證

在最優(yōu)的體系條件下，LAMP生物傳感器可以響應(yīng)轉(zhuǎn)基因水稻Kefeng 6、Kefeng 8、TT51和轉(zhuǎn)基因棉花MON 15985這4種含有Cry1Ac或者Cry1Ab/Ac基因的轉(zhuǎn)基因樣本，裸眼可視化結(jié)果為黃色或黃綠色。轉(zhuǎn)基因玉米Bt11、Bt176、MON 810、轉(zhuǎn)基因甜菜H7-1、五優(yōu)稻4號(hào)和粳稻糙米這6種不含有靶標(biāo)基因的轉(zhuǎn)基因或者非轉(zhuǎn)基因作物則不能實(shí)現(xiàn)LAMP生物傳感器的響應(yīng)，裸眼可視化結(jié)果為綠色。瓊脂糖電泳的結(jié)果與生物傳感器響應(yīng)的結(jié)果保持一致（圖4）。

圖4 LAMP方法特異性驗(yàn)證Fig. 4 Specificity verification of LAMP method

2.4 靈敏度分析

LAMP生物傳感器對(duì)于2.12×105-1.7 拷貝/μL的樣本的響應(yīng)都為黃色，瓊脂糖凝膠電泳的表征也具有典型的梯型擴(kuò)增條帶，表明該生物傳感器的檢測(cè)靈敏度可以達(dá)到1.7 拷貝/μL，相比于其他檢測(cè)方法（附表1），具有更高的靈敏度。并且隨著靶標(biāo)基因的拷貝數(shù)降低，LAMP擴(kuò)增中產(chǎn)生的H+未達(dá)到飽和，該生物傳感器在響應(yīng)黃色信號(hào)的同時(shí)還保持有綠色色調(diào)（圖5）。相比于瓊脂糖電泳分析中的結(jié)果，該生物傳感器對(duì)于在檢測(cè)限附近不同濃度的靶標(biāo)所響應(yīng)的顏色有細(xì)微的可視化區(qū)別，說(shuō)明該方法具有一定的半定量潛力，在儀器分析下可以實(shí)現(xiàn)半定量。

圖5 LAMP方法靈敏度分析Fig. 5 Sensitivity analysis of LAMP method

3 討論

轉(zhuǎn)基因作物在帶來(lái)一系列好處的同時(shí)也可能對(duì)環(huán)境和人類健康造成威脅，其中抗蟲(chóng)基因作物的擴(kuò)增風(fēng)險(xiǎn)較高，為了保障公民的知情權(quán)，建立新型的抗蟲(chóng)基因檢測(cè)方法對(duì)于完善我國(guó)轉(zhuǎn)基因檢測(cè)體系具有重要意義。Cry1A基因是使用頻率最高的外源抗蟲(chóng)基因，該基因還可以進(jìn)一步細(xì)分為其他基因。為了進(jìn)一步區(qū)分Cry1A抗蟲(chóng)基因家族的具體特異性基因，本文針對(duì)Cry1Ac與Cry1Ac/Ab基因的的同源區(qū)域設(shè)計(jì)了3套特異性LAMP引物。

轉(zhuǎn)基因作物基因水平檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)仍然是PCR方法，但是PCR方法依賴熱循環(huán)儀，這限制了其在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的運(yùn)用。而近10年興起的環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)彌補(bǔ)了這一缺陷，并伴生了包含有比色、熒光、電化學(xué)等方式的生物傳感器。這些傳感器中比色方法可以實(shí)現(xiàn)一步裸眼可視化、成本低廉、儀器要求低，但是目前的比色試劑的研發(fā)集中于HNB和中性紅。隨著NEB等公司的中性紅比色試劑盒的上市，這一同質(zhì)化現(xiàn)象進(jìn)一步加深。

本研究根據(jù)LAMP反應(yīng)過(guò)程中能夠產(chǎn)生大量H+，以及Bst 2.0聚合酶能夠耐受6.0-10.0的pH變化的基礎(chǔ)［19］，挑選了在pH 6.0-7.6存在連續(xù)變色現(xiàn)象的pH指示劑BTB作為顯色劑。與中性紅類似，使用BTB作為顯色劑也具有一系列優(yōu)點(diǎn)，如裸眼可視化、顯色現(xiàn)象明顯、一步閉管操作、操作簡(jiǎn)單等。同時(shí)該方法還具有中性紅不具備的優(yōu)勢(shì)：（1）BTB水溶性更好，只需溶解在20%的乙醇溶液中，而同質(zhì)量的中性紅需要溶解在60%的乙醇溶液中，所以添加BTB指示劑可以更少地在體系中引入乙醇，降低乙醇對(duì)于反應(yīng)的影響。（2）BTB在變色區(qū)間內(nèi)會(huì)實(shí)現(xiàn)藍(lán)色、藍(lán)綠色、綠色、黃綠色、黃色的依次轉(zhuǎn)變，中性紅則為黃色至紅色的突變。所以BTB的比色結(jié)果更加豐富，可以與比色卡聯(lián)用，更具有商業(yè)化潛力。

選擇了pH比色試劑后，本文對(duì)于LAMP體系的緩沖能力進(jìn)行了調(diào)整，相比于在無(wú)緩沖能力的體系中直接使用pH指示劑，本研究保留了體系的部分緩沖能力，使Bst酶在擴(kuò)增過(guò)程中的環(huán)境更接近于理論最優(yōu)。不過(guò)Bst酶的緩沖體系仍然需要進(jìn)一步優(yōu)化，在本研究中尚只能實(shí)現(xiàn)反應(yīng)前后從綠色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S綠色再轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，若想要實(shí)現(xiàn)反應(yīng)前后從藍(lán)色轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，在兼顧反應(yīng)效率的同時(shí)，還需要進(jìn)一步調(diào)整體系的初始pH、緩沖能力以及增加H+的產(chǎn)生量。

4 結(jié)論

本文針對(duì)Cry1Ac/Ab和Cry1Ac的同源序列設(shè)計(jì)LAMP引物，并首次在弱緩沖體系中引入BTB作為生物傳感器的響應(yīng)試劑，一步法實(shí)現(xiàn)比色信號(hào)輸出。該方法可以在1 h內(nèi)檢測(cè)到1.7 拷貝的Cry1Ac或Cry1Ac/Ab基因，同時(shí)具有良好的特異性。

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