Maresin 1對肝缺血再灌注損傷的影響及機(jī)制研究

黃澤偉 鄭毓英 劉雪燕 姜遠(yuǎn)旭

肝缺血再灌注損傷是肝移植、肝部分切除術(shù)和失血性休克后急性肝臟損傷的重要因素[1]。肝缺血再灌注后不但導(dǎo)致肝臟損傷，而且導(dǎo)致肺、腎、腸、胰腺等遠(yuǎn)隔器官損傷[2]。因此，有效降低肝缺血再灌注損傷的措施可能會提高患者術(shù)后的生存期。盡管過去對肝缺血再灌注損傷的病理生理有一定了解，但對其確切機(jī)制了解較少，也缺少有效的治療方法。目前研究認(rèn)為，過度的氧化應(yīng)激反應(yīng)和炎癥反應(yīng)共同導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死和凋亡[3-4]。因此，抗炎和抗氧化在抗肝缺血再灌注損傷中尤為重要。Maresin 1（MaR1）是從二十二碳六烯酸中提取的一種新型促炎癥消退介質(zhì)。近些年研究表明，MaR1通過抗炎、抗氧化作用減輕肺和腎缺血再灌注損傷[5-6]，且對四氯化碳、刀豆球蛋白A誘導(dǎo)的肝損傷有保護(hù)作用[7-8]。然而，MaR1對缺血再灌注誘導(dǎo)的肝損傷保護(hù)作用及其機(jī)制尚不完全清楚。本研究通過建立部分肝缺血再灌注損傷模型，探究MaR1是否通過抗炎及抗氧化作用減輕肝缺血再灌注損傷，并探討其可能的機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 SPF級Wistar大鼠24只，4～7周齡，體重200～220 g，購于廣東省醫(yī)學(xué)實驗動物中心，許可證號：SCXK（粵）2019-0035。

1.2 主要藥物、試劑和儀器 Maresin 1購自美國Cayman公司（批號：1268720-28-0）；抗磷脂酰肌醇-3激酶（phosphatidylinositol 3-kinase，PI3K）抑制劑 LY2-94002購自德國 Merck公司（批號：154447-36-6）；TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10 ELISA試劑盒購自南京建成生物工程研究所（批號：H052-1、H002、H007-1-1、H009-1）；丙二醛（malondialdehyde,MDA）、谷胱甘肽（glutathione，GSH）、過氧化氫酶（catalase，CAT）、超氧化物歧化酶（superoxide dismutase,SOD）檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所（批號：A003-1-2、A006-2-1、A007-1-1、A001-1-2）；PI3K、磷酸化PI3K（p-PI3K）、蛋白激酶B（protein kinase B，Akt/PKB）、磷酸化 Akt（p-Akt）、轉(zhuǎn)錄因子NF-E2 相關(guān)因子 2（transcription factor NF-E2-related factor 2,Nrf2）、血紅素氧合酶-1（heme oxygenase-1,HO-1）抗體購自美國CST公司（批號：4255S、17366S、4691S、13038S、12721S、21416S）；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG二抗購自美國CST公司（批號：32935S）；β-actin抗體購自美國CST公司（批號：4970S）。顯微鏡購自日本OLYMPUS公司（型號：CKX53），全自動生化分析儀中國邁瑞公司（型號：BS-380），低溫離心機(jī)購自中國瑞沃德公司（型號：M1324R），石蠟切片機(jī)購自中國瑞沃德公司（型號：S700A），酶標(biāo)儀購自美國Bio-Rad公司（型號：1681130A），電泳儀購自美國Bio-Rad公司（型號：1645050）。

1.3 模型制作、分組及處理 所有大鼠實驗前均經(jīng)歷至少一個晝夜循環(huán)，自由飲水。根據(jù)文獻(xiàn)報道的方法建立肝缺血再灌注模型[12]，主要步驟：腹腔注射3%戊巴比妥鈉50 mg/kg麻醉大鼠，腹部正中切口，暴露肝門（肝動脈、門靜脈、膽管），微血管鉗阻斷肝左葉、肝中葉血管，保留肝右葉和尾葉血流，阻斷血流60 min后，移除血管鉗開始再灌注，縫合切口，建立部分（70%）肝缺血再灌注損傷模型。大鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為假手術(shù)組（Sham組）、肝缺血再灌注損傷組（I/R組）、MaR1治療組（I/R+MaR1組）、I/R+MaR1+LY294002治療組（I/R+MaR1+LY294002組），每組6只。各組大鼠采用3%戊巴比妥鈉50 mg/kg進(jìn)行麻醉，Sham組開腹關(guān)腹，不阻斷血流；參照文獻(xiàn)[13]，I/R+MaR1組在肝缺血再灌注前1 h腹腔注射4 mg/kg MaR1，I/R+MaR1+LY294002組在肝缺血再灌注前30 min腹腔注射LY294002 0.5 mg/kg，其余處理同I/R+MaR1組。再灌注6 h后各組大鼠采用3%戊巴比妥鈉50 mg/kg再次進(jìn)行麻醉，分離右頸總動脈，置入套管針，取3 ml血液靜置20 min后，4℃、3 000 r/min離心10 min，離心半徑10 cm，取血清凍存?zhèn)溆?。頸動脈放血后處死大鼠，立即開腹，取500 mg肝左葉組織凍存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 肝組織病理學(xué)檢查 肝組織用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，恒溫冷凍切片機(jī)切片（4 μm），HE染色，評估組織病理學(xué)變化。使用奧林巴斯光學(xué)顯微鏡（放大倍數(shù)為20倍）觀察切片，每個切片隨機(jī)選取6個視野進(jìn)行肝損傷評估。根據(jù)Suzuki等[9]提出標(biāo)準(zhǔn)，依據(jù)充血、炎性和壞死的嚴(yán)重程度進(jìn)行評分，0分為無，1分為極其輕微，2分為輕度，3分為中度，4分為嚴(yán)重，統(tǒng)計各組各項得分之和。

1.5 肝功能檢測 大鼠處死前取1 ml頸動脈血，室溫靜置20 min，4℃、3 000 r/min離心10 min，離心半徑10 cm，取上清液，采用全自動生化分析儀立即檢測AST、ALT、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase,LDH）水平，嚴(yán)格根據(jù)廠家說明書操作。

1.6 血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平的檢測 取冰凍的血清解凍，采用ELISA測定TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書操作。

1.7 肝組織MDA、GSH、CAT、SOD水平檢測 取100 mg肝組織解凍，準(zhǔn)確稱重后，剪碎，置于組織勻漿器中，按1∶9的比例加入預(yù)冷0.9%氯化鈉注射液（1 g組織加入9 ml0.9%氯化鈉注射液），在0～4℃冰盒中研磨，制備10%組織勻漿液，4℃、3 000 r/min離心5 min，離心半徑10 cm，取上清液測定肝組織中MDA、GSH、CAT、SOD水平，嚴(yán)格按說明書操作。

1.8 肝組織p-PI3K、p-Akt、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)的檢測 采用Western blot法。取100 mg肝組織，裂解緩沖液勻漿（16 000 r/min，離心15 min），收集上清液。采用BCA蛋白檢測試劑盒測定蛋白水平。樣品加入上樣緩沖液，用10%或15%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離。然后在250 mA電流下將條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，持續(xù)2 h。5%脫脂奶粉封閉1 h，封閉完畢后用PBS-T洗膜5次，5 min/次，然后加入抗PI3K、p-PI3K、Akt、p-Akt、Nrf2、HO-1一抗，在1%脫脂奶粉中孵育過夜。膜在TBS-T中洗滌10 min，加入辣根過氧化物酶（HRP）二抗，孵育1 h。二抗孵育結(jié)束后再次用TBS-T洗膜5次，5 min/次，洗膜后加入化學(xué)發(fā)光增強(qiáng)劑，自顯影。采用圖像分析處理系統(tǒng)（Image J軟件）對蛋白條帶掃描分析，測得的蛋白光密度值與β-actin光密度值的比值表示各蛋白的相對表達(dá)量。

1.9 統(tǒng)計學(xué)處理 采用SPSS 24.0統(tǒng)計軟件。正態(tài)分布的計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗；非正態(tài)分布的計量資料以M（P25，P75）表示，組間比較采用Kruskai-WallisH檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 4組大鼠肝組織病理學(xué)檢查結(jié)果 Sham組大鼠肝組織細(xì)胞排列有序，細(xì)胞形態(tài)正常。與Sham組比較，I/R組肝組織出現(xiàn)嚴(yán)重的肝損傷，如細(xì)胞排列不規(guī)則、肝細(xì)胞變性、壞死、炎性細(xì)胞浸潤等，而MaR1治療明顯減輕I/R誘導(dǎo)的病理學(xué)變化，見圖1（插頁）。I/R組肝組織病理學(xué)評分為[3（3，4）]分，明顯高于Sham 組[0（0，1）]分（P＜0.05）；I/R+MaR1組肝組織病理學(xué)評分為[1.5（1，2）]分，較 I/R 組明顯降低（P＜0.05），而LY294002逆轉(zhuǎn)了MaR1的作用，I/R+MaR1+LY294002組肝組織病理學(xué)評分為[2.5（2，3）]分，高于I/R+MaR1組（P＜0.05）。

圖1 4組大鼠肝組織病理學(xué)改變圖（a：Sham組；b：I/R組；c：I/R+MAR1組；d：I/R+MAR1組+LY294002組;HE染色，×200）

2.2 4組大鼠血清AST、ALT、LDH水平的比較 與Sham組比較，I/R組血清AST、ALT、LDH水平均升高（均P＜0.05）；與I/R組比較，I/R+MaR1組AST、ALT、LDH水平均降低（均P＜0.05）；而LY294002逆轉(zhuǎn)了MaR1的作用，與I/R+MaR1組比較，I/R+MaR1+LY294002組AST、ALT、LDH水平均升高（均P＜0.05），見表1。

表1 4組大鼠血清AST、ALT、LDH水平的比較（U/L）

2.3 4組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平的比較 與Sham組比較，I/R組血清TNF-α、IL-1β、IL-6水平均升高（均P＜0.05），而IL-10無明顯變化（P＞0.05）；與I/R組比較，I/R+MaR1組TNF-α、IL-1β、IL-6水平均降低，IL-10水平升高（均P＜0.05）；而LY294002逆轉(zhuǎn)了MaR1的作用，與I/R+MaR1組比較，I/R+MaR1+LY294002組TNF-α、IL-1β、IL-6水平均升高，IL-10水平降低（均P＜0.05），見表2。

表2 4組大鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10水平的比較（pg/ml）

2.4 4組大鼠肝組織MDA、GSH、CAT、SOD水平的比較 與Sham組比較，I/R組肝組織中MDA水平升高，而GSH、SOD、CAT水平均降低（均P＜0.05）；與I/R組比較，I/R+MaR1組MDA水平降低，而GSH、SOD、CAT水平均升高（均P＜0.05）；而LY294002逆轉(zhuǎn)了MaR1的作用，與I/R+MaR1組比較，I/R+MaR1+LY294002組MDA水平升高，而GSH、SOD、CAT水平均降低（均P＜0.05），見表3。

表3 4組大鼠肝組織MDA、GSH、CAT、SOD水平的比較

2.5 4組大鼠肝組織p-PI3K、p-Akt、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)的比較 與Sham組比較，I/R組肝組織p-PI3K、p-Akt、Nrf2、HO-1蛋白相對表達(dá)量均升高（均P＜0.05），與I/R組比較，I/R+MaR1組p-PI3K、p-Akt、Nrf2、HO-1蛋白相對表達(dá)量進(jìn)一步升高（均P＜0.05）；而LY294002逆轉(zhuǎn)了MaR1的作用，與I/R+MaR1組比較，I/R+MaR1+LY294002組p-PI3K、p-Akt、Nrf2、HO-1蛋白相對表達(dá)量均降低（均P＜0.05），見表4和圖2。

表4 4組大鼠肝組織p-PI3K、p-Akt、Nrf2、HO-1蛋白相對表達(dá)量的比較

圖2 4組大鼠肝組織p-PI3K、p-Akt、Nrf2、HO-1蛋白表達(dá)的電泳圖

3 討論

臨床上進(jìn)行肝臟手術(shù)時，往往會阻斷肝臟血流。遺憾的是，在缺血區(qū)域組織恢復(fù)血流灌注后，發(fā)生了更嚴(yán)重的損傷，即肝缺血再灌注損傷。本研究中通過夾閉肝左及肝中葉血管，然后恢復(fù)再灌注來建立肝部分缺血再灌注損傷。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在缺血1 h及恢復(fù)再灌注6 h后，大鼠血清ALT、AST、LDH明顯高于Sham組，表明肝功能障礙。此外，肝組織學(xué)的檢測也表明，缺血再灌注誘導(dǎo)明顯的肝組織炎性細(xì)胞浸潤及肝細(xì)胞壞死。這些研究結(jié)果說明本實驗成功誘導(dǎo)了肝缺血再灌注損傷模型。另外，本研究發(fā)現(xiàn)，MaR1治療降低血清中ALT、AST、LDH水平，且減輕缺血再灌注誘導(dǎo)的病理學(xué)改變。與此同時，MaR1治療明顯降低肝損傷評分。以上這些數(shù)據(jù)表明，MaR1治療減輕肝缺血再灌注誘導(dǎo)的損傷。

有研究表明，肝缺血再灌注后，激活的枯否細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等釋放TNF-α、IL-1β等炎性細(xì)胞因子導(dǎo)致過度炎性反應(yīng)，進(jìn)而導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷[10-11]。MaR1是巨噬細(xì)胞中由二十二碳六烯酸產(chǎn)生的一種介質(zhì)。既往有研究表明，MaR1通過減輕中性粒細(xì)胞浸潤，抑制炎性細(xì)胞因子釋放而減輕炎性反應(yīng)[12-13]。本研究結(jié)果顯示，MaR1治療顯著降低血清中TNF-α、IL-1β、IL-6水平，增加IL-10水平，表明MaR1減輕肝細(xì)胞損傷可能與其抑制炎性反應(yīng)有關(guān)。除炎性反應(yīng)外，肝缺血再灌注后中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞活化產(chǎn)生的活性氧（reactive oxygen species，ROS）誘導(dǎo)的氧化反應(yīng)在肝損傷中也起重要作用[14]。過量的ROS通過脂質(zhì)過氧化導(dǎo)致蛋白質(zhì)和DNA損傷，被認(rèn)為是缺血再灌注損傷過程中細(xì)胞膜氧化損傷的主要原因。MDA可反應(yīng)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化水平，而活性自由基的清除主要是通過一系列抗氧化酶來實現(xiàn)的，如SOD、CAT、GSH等，以維持氧化反應(yīng)和抗氧化反應(yīng)的平衡。以往研究發(fā)現(xiàn)，MaR1減輕氧化應(yīng)激導(dǎo)致的肝細(xì)胞損害[8]。本研究發(fā)現(xiàn)，MaR1治療顯著降低肝組織中MDA水平，提高SOD、CAT、GSH水平。以上研究表明，MaR1減輕肝缺血再灌注損傷除了與抑制缺血再灌注誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)有關(guān)外，也與其抑制氧化反應(yīng)有關(guān)。然而，MaR1的抗炎、抗氧化作用部分被PI3K抑制劑逆轉(zhuǎn)，表明其作用是PI3K依賴的。

HO-1作為Ⅱ期抗氧化酶之一，在生理條件下，通過調(diào)控血紅素的分解，其代謝產(chǎn)物具有抗氧化和抗炎作用。研究發(fā)現(xiàn)，外源性誘導(dǎo)HO-1表達(dá)增加對肺、肝和腎缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用[15]，提示在缺血再灌注損傷中，增加HO-1表達(dá)是減輕損傷的有效治療措施。有研究發(fā)現(xiàn)，MaR1通過上調(diào)HO-1表達(dá)而發(fā)揮抗炎、抗氧化及器官保護(hù)作用[5]。HO-1表達(dá)受多個上游分子的調(diào)控，其中，PI3K/Akt/Nfr2是調(diào)控HO-1表達(dá)的一條重要信號通路。首先，HO-1受Nrf2緊密調(diào)控，而PI3K/Akt信號通路參與激活Nrf2[16-17]。一旦被激活，Nrf2就與Keap1分離，轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核與ARE結(jié)合，調(diào)控靶基因的表達(dá)，包括HO-1。既往研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號通路激活后，通過抑制炎癥和線粒體產(chǎn)生的ROS，同時促進(jìn)抗凋亡作用，在肝臟缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要作用[18]。據(jù)報道，激活PI3K/Akt和Nrf2/HO-1通路減輕硫代乙酰胺誘導(dǎo)的肝毒性作用[17]，提示激活PI3K/Akt/Nrf2/HO-1通路可能成為治療肝缺血再灌注損傷的潛在靶點(diǎn)。研究表明，MaR1通過激活PI3K/Akt減輕神經(jīng)炎性反應(yīng)和認(rèn)知功能障礙[19]。本研究發(fā)現(xiàn)，缺血再灌注誘導(dǎo)PI3K、Akt、Nfr2、HO-1表達(dá)增加，其原因為缺血再灌注后機(jī)體在啟動促炎反應(yīng)的同時，也激發(fā)了抗炎反應(yīng)系統(tǒng)，屬于一種保護(hù)機(jī)制。然而，本研究中I/R組誘發(fā)了明顯的炎性反應(yīng)，表明這種保護(hù)機(jī)制不足以抵消缺血再灌注誘發(fā)的促炎性反應(yīng)，從而表現(xiàn)出過度的炎性反應(yīng)。值得注意的是，MaR1治療進(jìn)一步增加PI3K、Akt、Nfr2、HO-1的表達(dá)，而給予PI3K抑制劑后，部分逆轉(zhuǎn)了MaR1的這些作用。以上研究結(jié)果提示：MaR1通過激活PI3K/Akt/Nrf2/HO-1通路減輕缺血再灌注導(dǎo)致的肝組織損傷。

綜上所述，MaR1減輕缺血再灌注誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，減輕肝缺血再灌注損傷，且MaR1治療進(jìn)一步上調(diào) PI3K、Akt、Nfr2、HO-1蛋白表達(dá)，而MaR1的這些作用部分被PI3K抑制劑LY294002逆轉(zhuǎn)。MaR1通過激活PI3K/Akt/Nrf2/HO-1信號通路抑制肝缺血再灌注誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，進(jìn)而減輕肝缺血再灌注損傷。