金葉榆二倍體及其同源四倍體的生理特征與轉(zhuǎn)錄組差異分析

宋文龍，葛 卉，劉興菊，梁海永,2

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 林學(xué)院，河北 保定 071000；2.河北省種質(zhì)資源與森林保護(hù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 保定 071000)

多倍體植物普遍存在于植物界尤其是被子植物中，多倍化的發(fā)生有利于植物進(jìn)化，其在物種遺傳多樣性和適應(yīng)性等方面有著顯著優(yōu)勢(shì)。多倍體由于基因加倍，導(dǎo)致植物在形態(tài)特征、生理特征、遺傳適應(yīng)及抗逆能力等方面發(fā)生很大變化［1］。例如，四倍體葡萄較二倍體出現(xiàn)巨大性的特點(diǎn)，葉綠素相對(duì)含量、POD 和CAT 活性均提高，抗逆性和適應(yīng)性增強(qiáng)［2］；新品種四倍體紫薇‘紫馨’和‘銀蝶’較二倍體紫薇葉片、花徑、果徑都顯著增大，抗病抗旱能力增強(qiáng)［3］；四倍體余蜜桔葉片中與抗旱性相關(guān)的激素ABA 含量，與抵抗病原菌侵染密切相關(guān)的激素JA 含量等均顯著高于二倍體［4］?？梢娫S多植物加倍后的性狀優(yōu)于二倍體，并已廣泛應(yīng)用于生產(chǎn)實(shí)踐。

轉(zhuǎn)錄組測(cè)序是一種高通量測(cè)序技術(shù)，對(duì)基因序列依賴性不強(qiáng)，對(duì)于無標(biāo)準(zhǔn)基因組的生物體也可以進(jìn)行無參轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。近年來，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序廣泛應(yīng)用于差異基因表達(dá)研究，已在茶樹［5］、松樹［6］、無油樟［7］等林木中成功應(yīng)用，為研究植物基因功能提供大量的轉(zhuǎn)錄本信息，成為植物基因挖掘的重要手段。

金葉榆(Ulmus pumilacv.‘Jinye’) 是榆科（Ulmaceae），榆屬（Ulmus）落葉喬木或灌木，是近年來推廣的彩葉綠化植物。其葉片金黃、自然光澤新鮮，耐修剪，易造型，廣泛用于綠化，耐寒、耐旱、耐鹽堿等優(yōu)勢(shì)突出。近年來，對(duì)金葉榆的研究主要集中在造型設(shè)計(jì)［8］、綠化應(yīng)用［9］及病蟲害防治等，對(duì)金葉榆多倍體育種研究還未見報(bào)道。本研究通過0.1%秋水仙素處理主干傷口，誘導(dǎo)出四倍體金葉榆，并對(duì)金葉榆二倍體及其同源四倍體進(jìn)行生理特征與轉(zhuǎn)錄組差異進(jìn)行分析，探究金葉榆多倍化對(duì)生理特征和分子水平影響，以期通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得與倍性相關(guān)基因序列，為揭示金葉榆倍性機(jī)制提供參考，同時(shí)為金葉榆基因工程育種提供分子基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試材料為金葉榆二倍體及其同源四倍體，四倍體由秋水仙素誘變得到，來自河北農(nóng)業(yè)大學(xué)西校區(qū)林學(xué)實(shí)驗(yàn)苗圃。供試株系的倍性均通過流式細(xì)胞儀進(jìn)行鑒定。

1.2 生理指標(biāo)測(cè)定

采用YSL-4T 葉綠素測(cè)定儀隨機(jī)挑選二倍體及其同源四倍體3 株，測(cè)定葉片的葉綠素相對(duì)含量，重復(fù)3 次；同時(shí)分別隨機(jī)選取3 株，采集葉片，重復(fù)3 次，取樣后迅速放入液氮中保存中暫存，之后轉(zhuǎn)入-80 ℃冰箱保存，用于可溶性糖、可溶性蛋白、丙二醛、超氧化物歧化酶和過氧化物酶測(cè)定。

可溶性糖含量采用蒽酮比色法；可溶性白含量采用考馬斯亮藍(lán)G-250 法；丙二醛（MDA）含量采用硫代巴比妥酸法測(cè)定；超氧化物歧化酶（SOD）活性的測(cè)定采用氮藍(lán)四唑光還原法；過氧化物酶（POD）活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法。

1.3 無參轉(zhuǎn)錄組測(cè)序

隨機(jī)挑選3 株二倍體及其同源四倍體，選取枝條上頂端相同部位的幼嫩葉片，放入錫箔紙中，并迅速放入液氮中暫存。用干冰送至百邁克生物信息公司進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

運(yùn)用Excel 和SPSS.24 軟件對(duì)測(cè)定各指標(biāo)進(jìn)行分析，運(yùn)用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)法分析二倍體和同源四倍體金葉榆各指標(biāo)之間差異性顯著；轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)及生物信息學(xué)分析在百邁克云平臺(tái)進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 金葉榆多倍體株系的倍性鑒定

以金葉榆二倍體為對(duì)照，流式細(xì)胞儀測(cè)得其染色體熒光強(qiáng)度值為190 ～200，表現(xiàn)出較高單峰。將秋水仙素處理的金葉榆，通過流式細(xì)胞儀測(cè)得染色體的熒光強(qiáng)度值為380 ～400，處理后金葉榆染色體熒光強(qiáng)度約為二倍體的2 倍，鑒定為同源四倍體（圖1）。

圖1 金葉榆二倍體（A)及其同源四倍體(B)葉片細(xì)胞的DNA 熒光強(qiáng)度分布Fig.1 Fluorescence intensity distribution of DNA in leaf cells of the diploid (A) and its induced autotetraploid(B) of Ulmus pumila cv.‘Jinye’

2.2 金葉榆二倍體及其同源四倍體的生理指標(biāo)

葉綠素是植物進(jìn)行光合作用的重要色素因子，其含量高低反應(yīng)植物光合能力的強(qiáng)弱。植物體內(nèi)的可溶性糖和可溶性蛋白是植物的主要代謝物，MDA、SOD 及POD 是植物體內(nèi)抗逆性相關(guān)的活性酶［10］，與植物的生長(zhǎng)和抗逆性有直接關(guān)系，因此常用來評(píng)價(jià)植物抗逆性。金葉榆染色體加倍后，這些指標(biāo)發(fā)生了變化，其對(duì)逆境的適應(yīng)和抵抗可能會(huì)發(fā)生相應(yīng)的變化。由表1 可見，四倍體金葉榆葉片中的葉綠素相對(duì)含量、可溶性糖和可溶性蛋白比二倍體植株分別增加8.20%、38.63%和52.79%，MDA含量比二倍體降低37.23%，同時(shí)SOD 活性和POD活性比二倍體植株分別增加95.48%和46.45%，說明四倍體金葉榆代謝能力和清除體內(nèi)的過氧化物的能力提高，增強(qiáng)環(huán)境適應(yīng)能力，抗逆性增強(qiáng)。

表1 金葉榆二倍體及其同源四倍體不同生理指標(biāo)對(duì)比Table 1 Comparison of different physiological indices of diploid and its autotetraploid of Ulmus pumila cv.‘Jinye’

2.3 金葉榆二倍體及其同源四倍體的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果

對(duì)樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，共獲得37.96 Gb Clean Data，各樣品Clean Data 均達(dá)到5.86 Gb，Q30 堿基百分比在95.56%及以上，GC 含量均45.56%以上，組裝后共獲得34 424 條Unigene，組裝完整性較高，可用于后續(xù)分析。

2.4 金葉榆二倍體及其同源四倍體的差異表達(dá)基因

對(duì)金葉榆二倍體及其同源四倍體進(jìn)行Unigene的差異基因分析，結(jié)果如圖2 所示，共有1 283 個(gè)差異表達(dá)基因，其中上調(diào)表達(dá)基因數(shù)為1 078 個(gè)，下調(diào)表達(dá)基因數(shù)為205 個(gè)，上調(diào)表達(dá)基因數(shù)顯著高于其下調(diào)基因數(shù)。

圖2 差異表達(dá)基因火山圖Fig.2 Volcano map of the difference genes

2.5 差異表達(dá)基因GO 功能分析

為了對(duì)比金葉榆二倍體及其同源四倍體之間差異表達(dá)基因的生物學(xué)功能，進(jìn)行GO 功能富集。由圖3 可知，有995 個(gè)差異表達(dá)基因被GO 注釋到生物過程、細(xì)胞組分以及分子功能3 大類別。生物過程中注釋了18 種功能，主要功能有代謝過程、細(xì)胞過程和單體功能；在細(xì)胞組分中注釋了15 種功能，主要功能有細(xì)胞、細(xì)胞部分、細(xì)胞膜和細(xì)胞膜部分；在分子功能中注釋了12 中功能，主要功能有催化活性、結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性?？梢娖涔δ芫c細(xì)胞代謝活動(dòng)和生長(zhǎng)發(fā)育等方面有關(guān)。

圖3 差異表達(dá)基因GO 注釋分類統(tǒng)計(jì)圖Fig.3 Differentially expressed genes GO annotation classification statistics graph

2.6 差異表達(dá)基因COG 注釋

將差異表達(dá)基因進(jìn)行COG 注釋，注釋結(jié)果如圖4。有384 條差異表達(dá)基因得到注釋，主要注釋在碳水化合物的運(yùn)輸和代謝、次生代謝產(chǎn)物合成、細(xì)胞壁、膜生物合成、翻譯、核糖體結(jié)構(gòu)和生物合成、脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝、氨基酸運(yùn)輸和代謝等。這些代謝產(chǎn)物和生理過程與植物生長(zhǎng)發(fā)育密切相關(guān)，與四倍體植株葉面積增大，光合速率提高，呼吸速率增強(qiáng)等有密切聯(lián)系。

圖4 差異表達(dá)基因COG 注釋分類統(tǒng)計(jì)圖Fig.4 Differentially expressed genes COG annotation classification statistics graph

2.7 差異表達(dá)基因KEGG 分析

對(duì)金葉榆二倍體及其同源四倍體差異表達(dá)基因KEGG 的注釋結(jié)果按照KEGG 中通路類型進(jìn)行分類（圖5），分為細(xì)胞過程、環(huán)境信息處理、遺傳信息處理、代謝機(jī)制和組織系統(tǒng)五大類特定的KEGG通路中。其中，代謝機(jī)制中差異表達(dá)基因被注釋到的數(shù)目最多，主要為淀粉和蔗糖代謝、苯丙烷生物合成、戊糖和葡萄糖醛酸的相互轉(zhuǎn)化、碳代謝、類黃酮生物合成、氨基酸生物合成以及糖酵解等37 個(gè)亞類。另外，在胞吞作用、植物激素信號(hào)傳導(dǎo)、核糖體及植物病原體互作等通路中也注釋到較多差異表達(dá)基因。將差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG 通路富集分析，共有11 條代謝通路顯著富集（P＜0.05）（表2）。其中植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、淀粉和蔗糖代謝、苯丙烷類生物合成和戊糖和葡萄糖醛酸鹽的相互轉(zhuǎn)化等代謝通路差異表達(dá)基因的數(shù)目較多。植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、淀粉和蔗糖代謝和二萜類生物合成等通路的差異基因顯著性最為明顯。說明四倍體中與代謝相關(guān)基因顯著上調(diào)，與植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有密切聯(lián)系。

表 2 差異表達(dá)基因的KEGG 通路富集分析Table 2 Analysis of KEGG pathway enrichment of DEG

圖5 差異表達(dá)基因KEGG 分類圖Fig.5 Classification map of differentially expressed gene KEGG

2.8 植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路分析

差異表達(dá)基因通過KEGG 通路富集，共得到99個(gè)KEGG 通路，其中植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集水平最顯著。本研究中，有46 個(gè)差異表達(dá)基因顯著富集在植物激素信號(hào)傳導(dǎo)通路中。其中41 個(gè)在四倍體中表達(dá)量較高，其中以生長(zhǎng)素（Auxin,IAA）、油菜素內(nèi)酯（Brassinosteroid）和水楊酸（Salicylicacid）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑富集基因數(shù)最多（圖5）。在生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中與生長(zhǎng)素抑制因子和生長(zhǎng)素響應(yīng)因子相關(guān)的基因上調(diào)表達(dá)；油菜素內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中與TCH4和CYCD3相關(guān)基因上調(diào)表達(dá)；在水楊酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中與NPR1 和PR-1 相關(guān)基因得到上調(diào)表達(dá)。差異基因的上調(diào)表達(dá)直接影響內(nèi)源激素水平，內(nèi)源激素水平變化顯著影響細(xì)胞生長(zhǎng)、代謝與酶活等生理過程，對(duì)四倍體金葉榆葉片面積，葉片厚度，葉片顏色等產(chǎn)生影響。

圖5 相關(guān)激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路Fig.5 Related hormone signaling pathways

3 討論與結(jié)論

3.1 金葉榆二倍體及其同源四倍體部分生理指標(biāo)比較

植物染色體加倍后會(huì)影響生理生化特征變化，主要表現(xiàn)在光合色素含量、生物酶活性和次級(jí)代謝產(chǎn)物等方面。四倍體植株普遍比二倍體植株具有更高活性成分含量，因此四倍體抗逆性更強(qiáng)［11］，染色體加倍育種是增加植物產(chǎn)量和提高抗逆性的重要手段之一。本研究中發(fā)現(xiàn)四倍體金葉榆中葉綠素相對(duì)含量、可溶性糖含量、可溶性蛋白含量、SOD 活性和POD 活性均顯著高于二倍體金葉榆，MDA 含量則顯著低于二倍體金葉榆，這與酸棗［12］和刺槐［13］染色體加倍后表現(xiàn)相同。葉綠素含量的提高導(dǎo)致綠色葉片加深，可溶性糖及可溶性蛋白含量提高使植株有更多能源物質(zhì)，從而導(dǎo)致四倍體金葉榆葉片變大變厚，生長(zhǎng)速度加快。SOD 和POD 活性提高及MDA 含量降低，提高四倍體金葉榆的抗氧化能力和抗逆能力。

3.2 二倍體與四倍體差異基因分析

植物染色體加倍后，基因表達(dá)發(fā)生變化從而引起表型和生理變異。近年來，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)已廣泛應(yīng)用于多倍體植株與二倍體植株差異基因表達(dá)分析，如茅蒼術(shù)［14］、西瓜［15］、霍山石斛［16］和刺槐［13］。本研究對(duì)金葉榆二倍體及其同源四倍體葉片進(jìn)行無參轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，測(cè)序數(shù)據(jù)組裝完整性較高。因此，對(duì)金葉榆二倍體及其同源四倍體的差異表達(dá)基因進(jìn)行分析，共有1 283 個(gè)差異表達(dá)基因，其中1 078 個(gè)表達(dá)上調(diào)，205 個(gè)表達(dá)下調(diào)。差異表達(dá)基因通過GO富集分析，發(fā)現(xiàn)主要富集在代謝過程、細(xì)胞過程、細(xì)胞、催化活性、結(jié)合和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性等，說明四倍體金葉榆在生長(zhǎng)發(fā)育和抗逆方面與二倍體存在差異；COG 注釋結(jié)果顯示，主要注釋在碳水化合物的運(yùn)輸和代謝、次生代謝產(chǎn)物合成、膜生物合成、脂質(zhì)運(yùn)輸和代謝和氨基酸運(yùn)輸和代謝等；KEGG 富集結(jié)果顯示，植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)、淀粉和蔗糖代謝和二萜類生物合成等通路的差異基因顯著性最為明顯。說明在四倍體中上調(diào)表達(dá)的差異基因可能參與植物內(nèi)源激素、可溶性糖和可溶性蛋白的積累過程，為植株生長(zhǎng)提供更多能量，從而提高四倍體金葉榆生長(zhǎng)勢(shì)。四倍體金葉榆葉片變大變厚，莖加粗，綠葉顏色加深等特征可能與差異基因表達(dá)有關(guān)。

3.3 差異基因功能分析

植物生長(zhǎng)發(fā)育與內(nèi)源激素調(diào)節(jié)密不可分，細(xì)胞分化、糖類物質(zhì)合成和酶活等生理過程受內(nèi)源激素水平影響［17］。油菜素內(nèi)酯具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)發(fā)育及提高植物抗氧化酶類的生物活性的作用，提高植物抗逆性［18］。水楊酸［19］是重要的免疫激素，通過誘導(dǎo)抗病基因的表達(dá)來提高植物抗病能力。酸棗四倍體與二倍體的差異基因參與了內(nèi)源生長(zhǎng)素的合成及傳導(dǎo)過程，使四倍體酸棗表型發(fā)生變異［20］。本研究中，KEGG 通路中植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路富集最顯著，其中生長(zhǎng)素、油菜素內(nèi)酯和水楊酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑富集基因數(shù)最多，在四倍體金葉榆生長(zhǎng)素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中，生長(zhǎng)素響應(yīng)因子和生長(zhǎng)素流入載體受差異表達(dá)基因上調(diào)表達(dá)；油菜素內(nèi)酯信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中細(xì)胞周期蛋白和糖基轉(zhuǎn)移酶受到上調(diào)表達(dá)；水楊酸信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑中調(diào)節(jié)蛋白和病原體相關(guān)蛋白受到上調(diào)差異表達(dá)基因的調(diào)控。

本研究以金葉榆二倍體及其同源四倍體葉片轉(zhuǎn)錄組測(cè)序與生理特征相結(jié)合進(jìn)行基因表達(dá)變化分析，發(fā)現(xiàn)二者在生理特征、生長(zhǎng)發(fā)育以及抗逆能力等方面存在差異，以上結(jié)果可進(jìn)一步為金葉榆關(guān)鍵調(diào)控基因的定位及基因工程育種提供分子基礎(chǔ)。