一株海南菌草“綠洲一號(hào)”內(nèi)生細(xì)菌的分離鑒定及其生物學(xué)特性研究

李望豪，周瑞鵬，許鈺瀅，趙琪琪，劉 娟，王榮波，葉文雨

（1.福建農(nóng)林大學(xué)國(guó)家菌草工程技術(shù)研究中心，福建 福州 350002；2.福建農(nóng)林大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院/植物與微生物相互作用福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350002；3.福建農(nóng)林大學(xué)園藝學(xué)院，福建 福州 350002；4.福建省作物有害生物監(jiān)測(cè)與治理重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州 350013）

【研究意義】菌草可作為靈芝等食、藥用菌培養(yǎng)基的成分。海南菌草“綠洲一號(hào)”是由國(guó)家菌草工程技術(shù)研究中心選育出的菌草品種之一。該品種在水土保持，治理鹽堿地，抑制病原菌及作為食、藥用菌新型培養(yǎng)基原料等方面都有廣闊的發(fā)展前景［1-5］?！熬G洲一號(hào)”是菌草中較為重要的品種，明確“綠洲一號(hào)”內(nèi)生細(xì)菌的生物學(xué)特性及其更深層次的機(jī)理，可以為菌草資源利用及其可持續(xù)發(fā)展提供理論支持，也為植物病原真菌的生物防治及植物促生機(jī)理的研究奠定基礎(chǔ)。【前人研究進(jìn)展】植物內(nèi)生細(xì)菌是指可以長(zhǎng)期在植物體內(nèi)生存，且會(huì)對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育產(chǎn)生一定益生作用的一類細(xì)菌［6-9］。目前，從植物組織分離的內(nèi)生細(xì)菌是當(dāng)今微生物領(lǐng)域研究的一大熱點(diǎn)，其主要研究方向?yàn)閮?nèi)生細(xì)菌的促生能力和拮抗能力。Khanna等［10］從鷹嘴豆（Cicer arietinumL.）中分離出對(duì)其枯萎病具有拮抗作用且可促進(jìn)鷹嘴豆植株生長(zhǎng)的菌株；曹鵬飛等［11］從楊梅等植物的組織中分離出對(duì)楊梅枯萎病病菌拮抗效果良好的內(nèi)生細(xì)菌；白潔等［12］從歐李根部分離得到7株內(nèi)生細(xì)菌，均具有一定的溶磷和產(chǎn)IAA 能力，從而對(duì)植物產(chǎn)生促生作用；錢鑫等［13］從健康的黃瓜植株中分離出對(duì)菊苣假單胞菌（Pseudonwnas cichorii）有抑菌作用的內(nèi)生細(xì)菌，該菌具有很好的固氮、溶磷等促生作用，在抵抗病原真菌的同時(shí)還可以為黃瓜提供生長(zhǎng)所需的微量元素，從而促進(jìn)黃瓜生長(zhǎng)。【本研究切入點(diǎn)】前人對(duì)經(jīng)濟(jì)作物和糧食作物內(nèi)生細(xì)菌的研究較為深入，近年來也逐漸重視對(duì)菌草等植物內(nèi)生細(xì)菌的研究。鑒于“綠洲一號(hào)”菌草用途廣泛，其內(nèi)生細(xì)菌功能多樣，故對(duì)其內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行相關(guān)研究。蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）可作為微生物殺蟲劑，其在植物病蟲害防治中起到積極作用，并且近年來得到更深入的研究與應(yīng)用［14-15］。目前蘇云金芽孢桿菌大多是從土壤和部分植物組織中分離得到，而從菌草分離得到蘇云金芽孢桿菌的研究鮮有報(bào)道。【擬解決的問題】本研究從海南菌草“綠洲一號(hào)”分離得到1 株內(nèi)生細(xì)菌，并對(duì)其生理生化特性、拮抗病原真菌以及其促生性能等方面展開研究，為植物病原真菌的生物防治及植物促生機(jī)理研究提供基礎(chǔ)理論。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試植物為海南菌草基地的“綠洲一號(hào)”（Juncao“Oasis No.1”），2020 年10 月采其葉片作為內(nèi)生細(xì)菌的分離材料。

供試病原真菌為稻瘟病菌（Magnaporthe oryzae，Guy11）、香蕉枯萎病菌4 號(hào)（Foctropical race4，F(xiàn)oc4），病原真菌均保存在植物與微生物相互作用福建省高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室。

供試培養(yǎng)基包括細(xì)菌生長(zhǎng)培養(yǎng)基：LB 固（液）體培養(yǎng)基［16］；真菌菌絲生長(zhǎng)培養(yǎng)基：PDA 培養(yǎng)基［17］；生理生化培養(yǎng)基：淀粉水解培養(yǎng)基［18］、明膠培養(yǎng)基［19］、脫脂奶粉培養(yǎng)基、檸檬酸鹽利用培養(yǎng)基、酯酶檢測(cè)培養(yǎng)基、纖維素水解培養(yǎng)基；促生性能培養(yǎng)基：有機(jī)磷培養(yǎng)基［20］、無機(jī)磷培養(yǎng)基［21］、CAS 檢測(cè)培養(yǎng)基［22］、硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基［23］、King 培養(yǎng)基［24］。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 內(nèi)生細(xì)菌的分離與純化 將新鮮葉片用自來水沖洗，洗凈后用75%酒精浸泡5 min，然后用無菌水沖洗3 次以上，將最后一次無菌水涂布于LB 培養(yǎng)基中，以確定表面是否消毒徹底。將葉片剪碎后放入研缽，加入無菌水充分研磨，吸取上清液并將上清液稀釋至10-1、10-2、10-3倍，然后分別涂布于LB 培養(yǎng)基上。培養(yǎng)1 d 后挑取合適的菌落，純化3 次后加甘油，以菌液︰甘油為3︰1 的比例對(duì)分離純化得到的內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行保藏。

1.2.2 內(nèi)生細(xì)菌拮抗病原真菌的篩選 采取平板對(duì)峙法，將提前活化的稻瘟病菌和香蕉枯萎病菌4 號(hào)切成直徑5 mm 的菌餅，菌絲向下接種在培養(yǎng)基中心。再將提前活化16 h 的內(nèi)生細(xì)菌分別添加在距離中心菌餅3.5 cm 處，待對(duì)照組病原真菌基本長(zhǎng)滿平板時(shí)記錄對(duì)照組和試驗(yàn)組病原真菌菌落半徑，計(jì)算抑菌率：

1.2.3 內(nèi)生細(xì)菌的分子鑒定 活化內(nèi)生細(xì)菌16 h 后，利用菌液作為模板，采用引物27F 和1492R［25］，PCR 條件及反應(yīng)體系參考劉彥超等［25］的方法，PCR 產(chǎn)物送至生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行BLAST 比對(duì)，利用 MEGA7.0 軟件采用近鄰相接法構(gòu)建出系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 內(nèi)生細(xì)菌的生理生化特性分析 將內(nèi)生細(xì)菌活化16 h 后進(jìn)行生理生化特性鑒定［26-28］，相關(guān)試驗(yàn)包括革蘭氏染色、檸檬酸鹽利用試驗(yàn)、纖維素利用試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、酯酶試驗(yàn)、淀粉水解試驗(yàn)、蛋白酶試驗(yàn)和接觸酶試驗(yàn)。

1.2.5 內(nèi)生細(xì)菌的促生能力分析 將內(nèi)生細(xì)菌活化16 h 后進(jìn)行該菌對(duì)植物的促生能力分析［29-32］，相關(guān)試驗(yàn)包括溶磷能力鑒定、合成鐵載體能力鑒定、降解硅酸鹽能力鑒定以及分泌IAA 能力鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 內(nèi)生細(xì)菌HLY3-2 的形態(tài)學(xué)特征

從海南菌草“綠洲一號(hào)”葉片上分離得到1株內(nèi)生細(xì)菌（編號(hào)：HLY3-2）。從圖1A 可見，HLY3-2 菌落呈紅色圓形，邊緣規(guī)則、表面光滑、濕潤(rùn)、粘稠狀，菌落直徑為1～2 mm。經(jīng)革蘭氏染色為陽性，菌體呈桿狀（圖1B），初步鑒定該內(nèi)生細(xì)菌為芽孢桿菌（Bacillussp.）。

圖1 內(nèi)生細(xì)菌HLY3-2 的形態(tài)學(xué)特征Fig.1 Morphological characteristics of endophytic bacterium HLY3-2

2.2 內(nèi)生細(xì)菌HLY3-2 拮抗病原真菌的篩選

內(nèi)生細(xì)菌HLY3-2 拮抗病原真菌篩選試驗(yàn)結(jié)果表明，該菌對(duì)稻瘟病菌和香蕉枯萎病菌4 號(hào)兩種病原真菌均具有一定的抑菌作用（圖2）。通過測(cè)量對(duì)照組病原真菌菌落直徑與試驗(yàn)組病原真菌菌落直徑，得出內(nèi)生細(xì)菌HLY3-2 的抑菌率分別為 18.45%和30.65%（圖3）。

圖2 內(nèi)生細(xì)菌HLY3-2 對(duì)病原真菌的拮抗作用Fig.2 Antagonism of endophytic bacterium HLY3-2 against pathogenic fungi

圖3 內(nèi)生細(xì)菌HLY3-2 對(duì)病原真菌的抑制率Fig.3 Inhibition rates of endophytic bacterium HLY3-2 against pathogenic fungi

2.3 內(nèi)生細(xì)菌HLY3-2 的分子鑒定

采用通用引物對(duì)菌液進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳，結(jié)果（圖4A）顯示，HLY3-2菌株的16SrDNA 基因片段大小約1 600 bp。測(cè)序得到16S rDNA 基因序列后，將序列與NCBI 數(shù)據(jù)庫(kù)中的已知序列進(jìn)行BLAST 比對(duì)，將具有同源性高的序列下載，利用MEGA7.0 軟件進(jìn)行同源比對(duì)，采用鄰近相接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，結(jié)果（圖4B）表明，內(nèi)生細(xì)菌HLY3-2 與蘇云金芽孢桿菌（Bacillus thuringiensis）匯在一支且相似度高達(dá)到99%，故初步判斷該菌為蘇云金芽孢桿菌。

圖4 內(nèi)生細(xì)菌HLIY3-2 的分子鑒定Fig.4 Molecular identification of endophytic bacterium HLY3-2

2.4 內(nèi)生細(xì)菌HLY3-2 的生理生化特性

在檸檬酸鹽利用試驗(yàn)培養(yǎng)基中，菌落周圍沒有產(chǎn)生變化，說明HLY3-2 菌株無法利用檸檬酸鹽（圖5A）；向纖維素利用試驗(yàn)培養(yǎng)基中加入剛果紅后，菌落被沖散且無透明圈產(chǎn)生，表明該菌株不具有利用纖維素的能力，從而導(dǎo)致菌落沒有很好地固定在培養(yǎng)基上（圖5B）；向裝有明膠培養(yǎng)基的EP 管中接種菌液，明膠沒有液化，故該菌株沒有使明膠液化的能力（圖5C）；菌落在酯酶培養(yǎng)基上沒有產(chǎn)生透明暈圈，可見其為不產(chǎn)酯酶菌株（圖5D）；向接種該菌株且恒溫培養(yǎng)3 d 的淀粉培養(yǎng)基中加入碘液，2 min 后菌落周圍沒有產(chǎn)生透明圈，故其為不產(chǎn)淀粉水解酶菌株（圖5E）；在奶粉培養(yǎng)基上，菌落周圍產(chǎn)生了明顯的透明圈，故該菌株可以產(chǎn)生蛋白酶（圖5F）；向涂有該菌落的載玻片上滴入過氧化氫溶液后，迅速產(chǎn)生大量氣泡，有氧氣產(chǎn)生，故該菌株可以產(chǎn)生過氧化氫酶（圖5G）。

圖5 內(nèi)生細(xì)菌HLIY3-2 的生理生化特性分析Fig.5 The physiological and biochemical characteristics of endophytic bacterium HLY3-2

2.5 內(nèi)生細(xì)菌HLY3-2 的促生能力

在含有機(jī)磷和無機(jī)磷的培養(yǎng)基上，菌落周圍都產(chǎn)生了透明圈，因此HLY3-2 菌株具有溶解有機(jī)磷和無機(jī)磷的能力（圖6A 和圖6B）；在CAS培養(yǎng)基上，菌落周圍培養(yǎng)基沒有產(chǎn)生黃色暈圈，故該菌株沒有產(chǎn)生鐵載體的能力（圖6C）；在硅酸鹽細(xì)菌培養(yǎng)基上，菌落周圍產(chǎn)生了透明圈，故該菌株可以降解硅酸鹽，為植物提供鉀、硅等微量元素（圖6D）；通過標(biāo)準(zhǔn)比色法可知，菌液的發(fā)酵液得到的顏色深于50 μg/mL IAA的標(biāo)準(zhǔn)溶液，因此該菌株具有很強(qiáng)的產(chǎn)IAA 能力（圖6E）。綜上可見，HLY3-2 菌株具有一定的促生能力。

圖6 內(nèi)生細(xì)菌HLY3-2 的促生能力分析Fig.6 Analysis of growth promoting ability of endophytic bacterium HLY3-2

3 討論

在菌草內(nèi)生細(xì)菌研究方面，鄧振山等［33］從巨菌草植株中共分離得到187 株內(nèi)生細(xì)菌，其中86 株具有分泌IAA 的能力，47 株具有溶磷能力。本研究從海南菌草“綠洲一號(hào)”葉片中分離得到的內(nèi)生細(xì)菌HLY3-2 具有類似的生物學(xué)性能，經(jīng)過分子與形態(tài)學(xué)鑒定，該內(nèi)生細(xì)菌為蘇云金芽孢桿菌。該菌株與大多數(shù)植物組織中分離得到的內(nèi)生拮抗促生細(xì)菌同為芽孢桿菌屬，但并非同一種。“綠洲一號(hào)”植株高大、根系發(fā)達(dá)、抗逆性強(qiáng)、營(yíng)養(yǎng)豐富，可以為更多內(nèi)生細(xì)菌的生存提供條件，后續(xù)仍需進(jìn)一步驗(yàn)證。

在促生機(jī)理研究方面，張萍等［34］對(duì)蘭科植物內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)內(nèi)生細(xì)菌可以通過溶解磷元素、鉀元素和產(chǎn)生IAA 來促進(jìn)植物生長(zhǎng)。而本研究分離得到的內(nèi)生細(xì)菌HLY3-2 具有溶解無機(jī)磷、有機(jī)磷及降解硅酸鹽的能力，并且可以產(chǎn)生IAA。因此該內(nèi)生細(xì)菌HLY3-2 可為植株提供充足微量元素和生長(zhǎng)素，進(jìn)而促進(jìn)植物生長(zhǎng)，故該菌株具有開發(fā)成為促生菌劑的潛力。

在內(nèi)生細(xì)菌拮抗病原真菌方面，周維等［35］從香蕉中分離出可以對(duì)Foc4病原真菌產(chǎn)生拮抗的內(nèi)生細(xì)菌；郭垂寶等［36］從龍牙百合磷莖中分離出對(duì)灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea）產(chǎn)生強(qiáng)拮抗作用的內(nèi)生細(xì)菌；孫宇晨等［37］從百合的莖分離得到具有促生效應(yīng)的菌株。以上試驗(yàn)可以證實(shí)植物內(nèi)生細(xì)菌不僅對(duì)宿主有促生作用，還可以增強(qiáng)宿主對(duì)病害的抵御能力。本研究分離得到1 株拮抗內(nèi)生細(xì)菌屬于蘇云金芽孢桿菌，該菌種的促生、拮抗作用未見報(bào)道，因此其可為內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行生物防治提供新思路和新方法。

在蘇云金芽孢桿菌抗病研究方面，李輝等［38］從疏花水柏枝葉片中篩選出對(duì)魔芋軟腐病病菌拮抗效果較好的蘇云金芽孢桿菌，但是對(duì)Foc4和Guy11病原真菌的拮抗作用尚未涉及。而本研究分離得到的蘇云金芽孢桿菌對(duì)Foc4和Guy11均具有一定的抑菌作用，這可能是由于不同宿主對(duì)內(nèi)生細(xì)菌的影響不同，從而產(chǎn)生不同抑菌效果。

在拮抗病原真菌機(jī)理方面，劉洋等［39］從核桃根部篩選出拮抗細(xì)菌，并對(duì)其拮抗病原真菌機(jī)理進(jìn)行了深入研究，表明內(nèi)生細(xì)菌可以通過分泌多種酶（如蛋白酶、纖維素酶）降解病原真菌或抑制病原真菌的生長(zhǎng)與繁殖。但是本研究分離得到的內(nèi)生細(xì)菌在生理生化鑒定時(shí)表現(xiàn)出可以產(chǎn)生蛋白酶但無法產(chǎn)生纖維素酶的特性，因此其拮抗病原真菌的機(jī)理可能與上述研究不同。這可能是由于不同種屬的內(nèi)生細(xì)菌生境不同，拮抗病原真菌的機(jī)理也不相同。內(nèi)生細(xì)菌HLY3-2 有望在生物防治、生物農(nóng)藥開發(fā)、菌草產(chǎn)業(yè)發(fā)展，以及促進(jìn)國(guó)家農(nóng)業(yè)健康發(fā)展等方面發(fā)揮一定作用。

4 結(jié)論

本研究從海南菌草“綠洲一號(hào)”中分離得到內(nèi)生細(xì)菌HLY3-2，經(jīng)鑒定，該菌株為蘇云金芽孢桿菌，具有溶解無機(jī)磷、有機(jī)磷和降解硅酸鹽的能力，而且可以產(chǎn)生IAA，兼具促進(jìn)植物生長(zhǎng)的能力。此外，該菌株可以產(chǎn)生蛋白酶、過氧化氫酶，可以在一定程度上清除植物體內(nèi)的活性氧，利于植物健康生長(zhǎng)。內(nèi)生細(xì)菌HLY3-2 對(duì)病原真菌Foc4和Guy11具有一定拮抗作用。因此本研究分離得到的蘇云金芽孢桿菌可以促進(jìn)植物生長(zhǎng)和抑制病原真菌，為多功能生物菌肥［40］及生防菌的應(yīng)用提供理論依據(jù)。