海洋中堿性磷酸酶及其活性的研究進(jìn)展

宋憲銳,宋暉,王丹,蘇貝

(1.山東大學(xué)海洋研究院 青島 266237;2.南方海洋科學(xué)與工程廣東省實(shí)驗(yàn)室(珠海) 珠海 519000;3.自然資源部海洋減災(zāi)中心 北京 100194)

0 引言

堿性磷酸酶(AP)是海洋中廣泛存在的酶,是磷酸單酯酶或磷酸單酯水解酶的亞類之一,催化酯鍵(C-O-P)斷裂,最適宜p H值為堿性[1]。AP包括組成型和誘導(dǎo)型2種[2]:通常在磷酸鹽濃度低于某閾值時(shí)AP表達(dá)大量增加,表明AP是誘導(dǎo)酶[3];但在磷酸鹽不缺乏的環(huán)境中也檢測(cè)到少量AP表達(dá),表明少部分AP是組成酶[4]。目前已發(fā)現(xiàn)3個(gè)主要的原核AP家族即Pho A、PhoD和Pho X,其底物特異性和所需金屬輔助因子均存在差異。

磷酸鹽限制(磷限制)又被稱為磷酸鹽壓力或磷酸鹽缺乏,主要是指周圍環(huán)境中的生物可利用的溶解態(tài)無(wú)機(jī)磷(DIP)的濃度明顯低于生物對(duì)其的需求,即氮等元素相對(duì)于磷的化學(xué)計(jì)量比顯著高于Redfield比值(N∶P=16∶1),從而限制生物生長(zhǎng)[5]。在極度缺磷的海區(qū),海洋微生物最主要的應(yīng)對(duì)方式是產(chǎn)生AP,即通過(guò)水解大分子溶解態(tài)有機(jī)磷(DOP)為小分子DIP來(lái)緩解磷限制[6],因此堿性磷酸酶活性(APA)被認(rèn)為是磷限制的重要指標(biāo)[7-8]。

AP對(duì)海洋碳、氮、磷循環(huán)和調(diào)節(jié)生物群落組成都具有非常重要的意義。①AP可緩解浮游植物的磷限制,有利于提高其初級(jí)生產(chǎn)力[9-10],增強(qiáng)海洋對(duì)大氣中二氧化碳的固定作用并增加隨后流入深海的有機(jī)碳通量,進(jìn)而對(duì)全球碳循環(huán)和海洋碳匯功能產(chǎn)生重要影響[11]。②AP水解DOP產(chǎn)生的DIP可刺激固氮生物的生長(zhǎng),有利于生物固氮[12]。模型研究結(jié)果表明,緩解磷限制可提高全球生物固氮速率的30%～60%[13-15],而在北大西洋甚至高達(dá)3倍左右[16]。③某些細(xì)菌在深海受到碳限制時(shí)會(huì)產(chǎn)生AP水解磷酸單酯,釋放出可利用的溶解態(tài)有機(jī)碳(DOC)[17-18],從而緩解深海細(xì)菌的碳限制。④在磷限制環(huán)境中,大量產(chǎn)生AP的海洋微生物可在資源競(jìng)爭(zhēng)中占據(jù)優(yōu)勢(shì)[19-20],因此對(duì)海洋生物群落組成產(chǎn)生重要影響(圖1,其中I-AP表示細(xì)胞膜內(nèi)的AP,C-AP表示附著在細(xì)胞膜或存在于周質(zhì)空間的AP,D-AP表示海水中游離態(tài)的AP)。

圖1 AP參與海洋碳、氮、磷循環(huán)的過(guò)程

本研究綜述海洋中AP的來(lái)源和分類以及APA的研究方法、調(diào)節(jié)機(jī)制模型、時(shí)空分布特征和環(huán)境影響因子,旨在揭示其在海洋生物地球化學(xué)循環(huán)過(guò)程中的重要作用。

1 堿性磷酸酶的來(lái)源

AP主要由浮游植物[21-23]、浮游動(dòng)物[24-25]和細(xì)菌[1,26]產(chǎn)生,并存在于細(xì)胞膜內(nèi)、周質(zhì)空間和海水中[27]。

1.1 浮游植物

海洋中的多種浮游植物在DIP缺乏的環(huán)境中能夠產(chǎn)生AP,周圍海水中的APA隨之升高。例如:紅海北部的磷酸鹽濃度很低,其APA沿深度分布與聚球藻分布呈相關(guān)性,表明聚球藻是AP的重要貢獻(xiàn)者[7];采用細(xì)胞特異性法可在束毛藻中測(cè)出APA[28];隨著藍(lán)藻的大量暴發(fā),海水中的APA隨之升高[29];單細(xì)胞APA分析結(jié)果表明,甲藻和硅藻都能活躍地產(chǎn)生AP[30-31]。

此外,不同種類的浮游植物對(duì)AP的貢獻(xiàn)具有較大的空間差異性。例如:日本廣島灣的甲藻暴發(fā)依賴其他硅藻產(chǎn)生的AP[32];我國(guó)南海大亞灣在春季藻華外的時(shí)間段,硅藻是造成APA變化的主要原因[2];蒙特利海灣和我國(guó)東海的甲藻是APA的最重要來(lái)源,而硅藻對(duì)于AP的貢獻(xiàn)較微小[19,22-33];馬尾藻海表層海水中的束毛藻貢獻(xiàn)總APA的81%[21,23]。

1.2 浮游動(dòng)物

很多浮游動(dòng)物也是AP的重要生產(chǎn)者。例如:地中海浮游動(dòng)物的APA呈春季高和冬季低的特點(diǎn),其中橈足類和水蚤類對(duì)整體AP的貢獻(xiàn)較大,而蔓足類對(duì)特定AP的貢獻(xiàn)較大[24];法國(guó)Toulon Bay浮游動(dòng)物的APA占顆粒態(tài)APA的60%以上[25],此外該海域浮游動(dòng)物的APA在5-8月較高且橈足類豐度較高,表明橈足類是AP的重要貢獻(xiàn)者[34];由于浮游動(dòng)物的晝夜遷移,北大西洋亞熱帶海區(qū)夜晚的表層APA比白天高2～3倍[35]。

1.3 細(xì)菌

細(xì)菌同樣是AP的重要生產(chǎn)者,其水解DOP不僅能夠提供自身生長(zhǎng)所必需的DIP,而且能夠提供DOC以緩解碳限制[18,36-37]。一方面,異養(yǎng)細(xì)菌對(duì)磷的需求比浮游植物高,對(duì)磷限制更加敏感[38-39],因此AP對(duì)于細(xì)菌生長(zhǎng)具有更加重要的意義,如在日本海[1]、東北大西洋[26]和我國(guó)南海[2]等海域均發(fā)現(xiàn)細(xì)菌產(chǎn)生AP的過(guò)程;另一方面,當(dāng)有機(jī)碳成為細(xì)菌生長(zhǎng)的限制因子時(shí),細(xì)菌將通過(guò)產(chǎn)生AP水解DOP釋放DOC供自身利用,如在阿拉伯海中層水[40]和地中海近岸海域[17]均發(fā)現(xiàn)細(xì)菌產(chǎn)生AP的主要作用是水解DOP以提供其生長(zhǎng)所需的DOC。

2 堿性磷酸酶活性的研究方法

APA通常采用水解熒光模擬底物法測(cè)定:將不發(fā)熒光的熒光模擬底物加入待測(cè)定的樣品后,樣品中的AP會(huì)水解熒光模擬底物的磷酸單酯鍵,使發(fā)熒光的標(biāo)準(zhǔn)熒光物質(zhì)釋放出來(lái);這一過(guò)程伴隨著熒光強(qiáng)度的改變,因此可通過(guò)檢測(cè)培養(yǎng)前和達(dá)到最大水解速率后的熒光強(qiáng)度變化率來(lái)表征樣品中的APA[41-42]。

通常使用的熒光模擬底物包括MUF-P[41]、MFP[43]、DiFMUP[44]和p NPP[7]。最 早 使 用MFP測(cè)定環(huán)境樣品中的APA[43],其在測(cè)定熒光強(qiáng)度之前無(wú)須用緩沖液調(diào)節(jié)p H值,因此可連續(xù)測(cè)定,但價(jià)格昂貴;DiFMUP也可連續(xù)測(cè)定,但價(jià)格也較昂貴;p NPP可連續(xù)或單點(diǎn)測(cè)定,使用更安全,但穩(wěn)定性較差。目前最常用的熒光模擬底物是MUF-P,其靈敏度高,即使在低溫和低APA條件下也能提供可靠的測(cè)定結(jié)果,但缺點(diǎn)為不適合活細(xì)胞或連續(xù)測(cè)定[41]。

此外,酶標(biāo)記熒光(ELF-97)單細(xì)胞APA技術(shù)可用來(lái)評(píng)估單個(gè)細(xì)胞的磷狀況,主要用于APA的定性和半定量測(cè)定[45-47]。單細(xì)胞APA技術(shù)的原理是熒光標(biāo)記底物與AP結(jié)合后產(chǎn)生不溶性的熒光沉淀物,可用顯微鏡觀察產(chǎn)生AP的細(xì)胞及其亞細(xì)胞定位。該方法是測(cè)定浮游植物群落磷限制的輔助方法,在相關(guān)研究中被廣泛使用[22,33,44,48]。

3 堿性磷酸酶的分類方法

AP的分類方法如表1所示。最常見(jiàn)的分類依據(jù)是根據(jù)濾膜有無(wú)和孔徑大小,使用0.22μm(或0.20μm)的濾膜可將AP分為顆粒態(tài)和溶解態(tài)[49]:就亞細(xì)胞定位來(lái)說(shuō),顆粒態(tài)AP通常存在于細(xì)胞膜內(nèi)和周質(zhì)空間或附著于細(xì)胞膜上;溶解態(tài)AP則在細(xì)胞產(chǎn)生后,通過(guò)細(xì)胞分泌或裂解作用釋放到自然環(huán)境中并發(fā)揮作用[50]。最近的研究表明,溶解態(tài)AP并不是完全溶解在海水中,而是部分附著于納米顆粒或病毒上,因此該研究將傳統(tǒng)意義上的溶解態(tài)AP細(xì)分為非溶解無(wú)細(xì)胞態(tài)(附著于納米顆?；虿《旧?和溶解無(wú)細(xì)胞態(tài)[51]。

分類依據(jù) 類別 說(shuō)明濾膜有無(wú)和孔徑大小整體 無(wú)濾膜溶解態(tài) ＜0.22μm(或0.20μm)顆粒態(tài)/細(xì)胞附著態(tài) ＞0.22μm(或0.20μm)來(lái)源細(xì)菌產(chǎn) 來(lái)自細(xì)菌浮游植物產(chǎn) 來(lái)自浮游植物浮游動(dòng)物產(chǎn) 來(lái)自浮游動(dòng)物親和力高親和力 主要來(lái)自細(xì)菌(溶解態(tài))低親和力 主要來(lái)自浮游動(dòng)物表達(dá)方式組成型 不受環(huán)境影響誘導(dǎo)型 受環(huán)境影響

根據(jù)AP來(lái)源,部分研究將顆粒態(tài)AP分為細(xì)菌產(chǎn)、浮游植物產(chǎn)和浮游動(dòng)物產(chǎn)[3,52]。在一些研究中,AP被分為高親和力和低親和力2個(gè)類型,且不同粒徑AP的貢獻(xiàn)不同[25,53-54]。高親和力AP主要來(lái)自細(xì)菌(溶解態(tài))[55],占高親和力部分比重達(dá)77%[54];低親和力AP主要來(lái)自浮游動(dòng)物[55],占低親和力部分比重達(dá)83%[54]。此外,根據(jù)表達(dá)方式可將AP分為不受環(huán)境影響的組成型AP和受環(huán)境中低DIP影響的誘導(dǎo)型AP[4]。

4 堿性磷酸酶活性的調(diào)節(jié)機(jī)制模型

有學(xué)者以球形褐藻為例,首次嘗試在已建立的浮游藻類模型中加入磷存儲(chǔ)和AP表達(dá)等過(guò)程,該模型明確描述AP(去)抑制調(diào)節(jié)機(jī)制,并能夠定性描述DIP轉(zhuǎn)運(yùn)、聚磷酸鹽的細(xì)胞內(nèi)積累、AP誘導(dǎo)和APA等觀測(cè)結(jié)果[56]。采用該APA調(diào)節(jié)機(jī)制模型開(kāi)展DIP限制和溶解態(tài)無(wú)機(jī)氮(DIN)富集的模擬實(shí)驗(yàn),得到結(jié)論為如果DOP濃度不是限制因素,AP可顯著提高浮游植物的生物量;該結(jié)論有沿海[22,53,57-58]和大洋生態(tài)系統(tǒng)[21,49,59-60]的大量現(xiàn)場(chǎng)觀測(cè)數(shù)據(jù)支持,表明DOP對(duì)于維持DIP缺乏海域的初級(jí)生產(chǎn)力至關(guān)重要。

5 堿性磷酸酶活性的時(shí)空分布特征

5.1 水平分布特征

APA研究主要集中于熱帶和亞熱帶的太平洋、大西洋和地中海海域[10]。由于生物可利用DIP濃度較低,這些海域是全球主要的磷限制海域[5]。

在海上調(diào)查實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn),在同樣的磷酸鹽濃度環(huán)境下,亞熱帶大西洋的APA高于亞熱帶太平洋[10]。北大西洋接收大量來(lái)自撒哈拉沙漠的含鐵沙塵,使其固氮生物的固氮效率提高,進(jìn)一步加劇磷限制,因此其APA高于南大西洋,且據(jù)估算北大西洋的DOP可支持高達(dá)30%的初級(jí)生產(chǎn)力[60]。與同緯度的北太平洋相比,印度洋的APA較高,可能的原因是該海域充足的鐵輸入有利于浮游生物群落生長(zhǎng),營(yíng)養(yǎng)鹽被大量利用后須產(chǎn)生AP以緩解磷限制[61]。

5.2 垂直分布特征

磷限制主要出現(xiàn)在表層海水,深海磷酸鹽通常不會(huì)是微生物生長(zhǎng)的限制因素,因此APA研究主要集中于100 m以淺的海域,而深海APA研究較少。研究表明同一海域100 m以淺海水的APA較高且變化不大,而100 m以深海水的APA逐漸降低甚至低于檢測(cè)限值。有學(xué)者在西北地中海觀察到APA隨深度增大而降低的現(xiàn)象[62-63],甚至有研究發(fā)現(xiàn)1 000 m處海水的APA比表層海水低1個(gè)數(shù)量級(jí)[64]。我國(guó)黃海有相同的規(guī)律,2007年夏季表層海水的APA約為100 nmol/(L·h),而深層海水的APA低于10 nmol/(L·h)甚至低于檢測(cè)限值,這表明由于夏季黃海冷水團(tuán)的存在,表層海水得不到營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)補(bǔ)給,浮游植物可能遭受較強(qiáng)的磷限制,而底層冷水團(tuán)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)充足,浮游植物不會(huì)遭受磷限制[65]。

5.3 季節(jié)分布特征

研究表明,同一海域的APA往往存在季節(jié)性變化,如在大西洋BATS站[66]、地中海亞得里亞海[67]、法國(guó)Toulon Bay[34]、舊金山和蒙特利海灣[22]、日本附近海灣[68]和我國(guó)黃海冷水團(tuán)海域[65],APA的最高值均在春季和夏季測(cè)得,該時(shí)期由于浮游植物生長(zhǎng)須利用大量DIP,海洋中的DIP濃度很低,使浮游植物通過(guò)大量產(chǎn)生AP以緩解磷限制。此外,有學(xué)者發(fā)現(xiàn)地中海APA的最高值出現(xiàn)在冬季[69],可能的原因是冬季的磷循環(huán)更加有效。

6 堿性磷酸酶活性的影響因子

APA在海洋生態(tài)系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)機(jī)制十分復(fù)雜,研究表明多種環(huán)境因子可以影響APA,且共同發(fā)揮作用調(diào)節(jié)不同時(shí)空的APA分布。影響APA的典型環(huán)境因子包括太陽(yáng)輻射[70-71]、海水溫度[72]、河流輸入[17,33]、上 升 流[73-75]、DOP[10,60,76]、DIP[44,49,77]、DIN[17,33,44,49]、金屬離子[10,78-79]以及病毒裂解、浮游動(dòng)物捕食和排遺作用等[80]。

6.1 太陽(yáng)輻射

有研究發(fā)現(xiàn)UV-B可通過(guò)光降解作用顯著降低顆粒態(tài)和溶解態(tài)APA,且對(duì)于溶解態(tài)APA的影響更大[70]。環(huán)境強(qiáng)度水平的紫外線也會(huì)降低游離態(tài)APA[71]。

6.2 海水溫度

有研究發(fā)現(xiàn)紅海海水升溫導(dǎo)致APA降低[7],東北大西洋[26]和波羅的海[72]海水升溫導(dǎo)致溶解態(tài)APA占比降低,在全球變暖趨勢(shì)下將導(dǎo)致總APA降低,進(jìn)而對(duì)DOP的水解作用造成影響。有實(shí)驗(yàn)表明,隨著溫度的升高,AP與其他胞外酶相比增加最慢。海水升溫會(huì)減少微生物異養(yǎng)群落的營(yíng)養(yǎng)供應(yīng),尤其是磷碳比的降低會(huì)減緩營(yíng)養(yǎng)循環(huán),進(jìn)一步導(dǎo)致海洋貧營(yíng)養(yǎng)化[81]。

6.3 河流輸入

河流輸入會(huì)降低近海的海水鹽度,而鞭毛藻等可產(chǎn)生AP的浮游植物群落對(duì)于海水鹽度的變化比較敏感,因此河流輸入導(dǎo)致的海水鹽度變化將調(diào)節(jié)浮游植物的AP表達(dá)[33]。此外,河流輸入會(huì)帶來(lái)大量營(yíng)養(yǎng)鹽,如河流輸入為波河與亞得里亞海交界處的浮游生物提供大量營(yíng)養(yǎng)鹽,滿足其對(duì)DIP的需求,位于該交界處的站點(diǎn)所測(cè)APA較交界處外的站點(diǎn)更低[17]。

6.4 上升流

海洋上升流通過(guò)將底層海水的營(yíng)養(yǎng)鹽帶到海表以維持生物生長(zhǎng)。例如:秋季地中海的上升流將磷酸鹽輸送到海表,緩解磷對(duì)浮游生物生長(zhǎng)的限制并導(dǎo)致APA降低[52,59,73]。APA的高低往往取決于底層海水與表層海水之間的交換量[74,82],而上升流是影響該交換量的重要因素。

6.5 DOP

AP降解DOP對(duì)于貧營(yíng)養(yǎng)海域的微生物生長(zhǎng)十分重要,這些微生物能夠根據(jù)DOP的生物可利用性來(lái)調(diào)節(jié)其對(duì)DOP的利用[76]。APA與DOP的相關(guān)關(guān)系在不同研究中呈現(xiàn)差異性:有研究表明APA與DOP呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[10,60],可能的原因是較活躍的DOP可支持較高的APA,因此被大量降解;另有研究表明在DOP濃度較低的海水中,即使磷限制廣泛存在而APA也較低,此時(shí)APA與DOP呈正相關(guān)關(guān)系,這表明DOP作為浮游生物(如束毛藻)的重要磷源,其濃度較低時(shí)會(huì)成為海水中APA的主要影響因子[77,83]。

6.6 DIP

生物APA往往受到細(xì)胞內(nèi)磷狀況和環(huán)境中磷酸鹽濃度的影響。大量研究表明,當(dāng)細(xì)胞內(nèi)和環(huán)境中的DIP濃度較低時(shí),往往需要細(xì)胞產(chǎn)生AP分解利用DOP,以產(chǎn)生DIP供細(xì)胞利用,因此APA較高,即APA與DIP呈負(fù)相關(guān)關(guān)系[17,44,49,57,73,77,84-87]。然而也有實(shí)驗(yàn)表明,盡管環(huán)境中的DIP濃度很高,但游離型APA仍維持較高水平,可能的原因是游離型AP能夠在海洋環(huán)境中存在很長(zhǎng)時(shí)間,且其產(chǎn)生和發(fā)揮作用是解耦聯(lián)的[88]。

6.7 DIN

在海洋環(huán)境中,DIN的輸入會(huì)進(jìn)一步加劇磷限制,導(dǎo)致APA升高,如APA在亞熱帶北大西洋[44,49]、美國(guó)俄勒岡州海灣[75]、我國(guó)東海[33]和我國(guó)南海[89]等海域由于該原因而較高。此外,由于富氮化肥、城市廢物和化石燃料等燃燒產(chǎn)生的氮氧化物進(jìn)入海洋而造成人為氮輸入,使相應(yīng)海域的氮磷比變高,導(dǎo)致藻類生長(zhǎng)受到磷限制[90],因此藻類會(huì)產(chǎn)生AP以緩解磷限制。

6.8 金屬離子

AP催化活性中心的成分包括金屬離子[91],其中Pho A型和Pho V型AP催化活性中心為鋅離子[78,92],Pho X型AP催化活性中心為鐵離子[79],因此AP在發(fā)揮作用時(shí)須有金屬離子的參與。例如:在向亞熱帶北大西洋表層海水中添加鋅離子后,水體中的APA升高,表明該海域較低的鋅離子濃度抑制APA;而在向該海域表層海水中添加鐵離子后,水體中的APA并沒(méi)有升高,表明在該海域鐵離子是APA的非限制性環(huán)境因子[10]。此外,由于不同類型的AP需要不同的金屬離子作為輔助因子,低磷海水中鐵離子和鋅離子的濃度通過(guò)影響APA而成為決定浮游植物群落組成的關(guān)鍵因素[79]。

6.9 病毒裂解、浮游動(dòng)物捕食和排遺作用等

病毒裂解、浮游動(dòng)物捕食(使被捕食者的細(xì)胞破裂)和排遺作用等均為海洋中溶解態(tài)AP的來(lái)源[50,93]。此外,細(xì)菌應(yīng)激和死亡增加溶解態(tài)胞外酶占總胞外酶的比重,其中AP的占比增加高達(dá)10.5%[80]。

7 展望

目前針對(duì)AP的大量研究主要集中在地中海、北大西洋和西北太平洋[10]等磷限制海域,而針對(duì)其他海域的AP研究較少,因此應(yīng)逐步開(kāi)展對(duì)其他海域的相關(guān)研究,從而為深入理解海洋環(huán)境中AP參與碳、氮、磷循環(huán)的過(guò)程提供重要條件[12]。盡管AP在海洋生物地球化學(xué)循環(huán)過(guò)程中發(fā)揮的作用被不斷發(fā)現(xiàn),但能夠明確描述AP作用機(jī)制的模型鮮有報(bào)道[56],可能的原因是APA數(shù)據(jù)缺乏和數(shù)據(jù)庫(kù)尚未建立,因此應(yīng)整理現(xiàn)有APA數(shù)據(jù)并建立相應(yīng)數(shù)據(jù)庫(kù),從而推動(dòng)建模的發(fā)展。目前已對(duì)全球陸地生態(tài)系統(tǒng)的APA分布及其影響因子開(kāi)展較為系統(tǒng)的研究[94],但對(duì)海洋生態(tài)系統(tǒng)的APA分布缺乏系統(tǒng)研究,因此應(yīng)進(jìn)一步研究典型海域APA的分布規(guī)律及其特征,厘清APA的調(diào)節(jié)機(jī)制,定位影響APA的關(guān)鍵環(huán)境因子,將APA納入海洋生物地球化學(xué)和海洋生態(tài)系統(tǒng)模型的構(gòu)建,從而提高海洋生態(tài)系統(tǒng)功能預(yù)測(cè)的準(zhǔn)確性和完整性。目前許多研究選用的底物和方法存在差異[48,65],因此應(yīng)制定統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn),規(guī)范APA測(cè)定流程,從而實(shí)現(xiàn)APA數(shù)據(jù)的比對(duì)。雖然目前已對(duì)AP的作用機(jī)制有一些研究,但AP對(duì)不同海域浮游植物群落生長(zhǎng)和物種組成的調(diào)節(jié)程度仍不明確,對(duì)于鹽度等重要環(huán)境因子如何影響AP表達(dá)和APA仍研究不足,因此應(yīng)進(jìn)一步研究以得到明確的結(jié)論。