正交試驗設計法優(yōu)選夏枯草的提取工藝*

吳勇輝，楊定霖

(1.南方醫(yī)科大學第七附屬醫(yī)院藥劑科，廣東 佛山 528244；2.佛山市仁匯醫(yī)藥科技有限公司，廣東 佛山 528000)

夏枯草為唇形科夏枯草屬的果穗，多年生草本植物。中醫(yī)認為其具有散結(jié)消腫、清熱解毒、清火明目等功效，可治療目赤腫痛、瘰 疬、癭瘤、乳癰腫痛、乳癖等[1]。現(xiàn)代藥理研究發(fā)現(xiàn)，夏枯草對乳腺增生、乳腺腫瘤等具有較好的療效[2-3]。前期，采用細胞膜固相色譜法篩選出夏枯草中抗人乳腺癌細胞 MDA-MB-231的效應成分為迷迭香酸、蘆丁等[4]。本研究擬以迷迭香酸、蘆丁的總提取率作為考察指標，通過正交試驗設計法優(yōu)選夏枯草的最佳提取工藝，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1儀器與試劑 島津LC-20A效液相色譜儀(包括 LC-20AT型四元泵系統(tǒng)，Prominence SIL-20A自動進樣器，SPD-M20A型DVD檢測器)購自日本SHIMADZU公司，電子天平(型號：JJ224BC型)購自常熟市雙杰測試儀器廠，數(shù)控超聲波清洗器(型號：0605T型)購自深圳市華策科技有限公司公司，蘆丁對照品為成都埃法科技有限公司生產(chǎn)(批號：AZ21080201，規(guī)格：98%)，迷迭香酸對照品為成都埃法科技有限公司生產(chǎn)(批號：AF21020951，規(guī)格：98%)，夏枯草(產(chǎn)地：江蘇)購自康美藥業(yè)股份有限公司，乙腈(批號：20201124，規(guī)格：色譜純)、甲醇(批號：20200806，規(guī)格：色譜純)均購自霍尼韋爾貿(mào)易(上海)有限公司，磷酸(批號：20210403，規(guī)格：分析純)購自天津市富宇精細化工有限公司，雙蒸水為自制。

1.2方法

1.2.1色譜條件 色譜柱：Cosmosil C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流動相：乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)，梯度洗脫(0～10 min，25%～40%A；10～30 min，40%～48%A；30～35 min，48%～60%A；35～40 min，60%～60%A)；檢測波長：340 nm；流速：1.0 mL/mL；柱溫：室溫；進樣量：20 μL。

1.2.2溶液的配制

1.2.2.1混合對照品溶液的配制 精密稱取蘆丁對照品2 mg、迷迭香酸對照品10 mg，加甲醇超聲溶解，配制成每1毫升含20 μg蘆丁、100 μg迷迭香酸的混合對照品溶液。

1.2.2.2供試品溶液的配制 取夏枯草合并的提取液，過濾，濾液采用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50 ℃下減壓回收乙醇并濃縮得到浸膏，稱重，取10 mg樣品加甲醇定容到5 mL，超聲溶解，過濾，制得供試品溶液。

1.2.3方法學考察

1.2.3.1系統(tǒng)適用性試驗 吸取供試品溶液、對照品溶液按擬定色譜條件進樣測定，對系統(tǒng)適用參數(shù)進行考察。

1.2.3.2線性范圍考察 精密吸取混合對照品溶液適量，加甲醇稀釋成蘆丁濃度為20、15、10、5、2.5 μg/mL，迷迭香酸質(zhì)量濃度為100.0、75.0、50.0、25.0、12.5 μg/mL的系列混合對照品溶液，精密吸取上述溶液各20 μL，按1.2.1項色譜條件注入液相色譜儀，記錄色譜圖，以濃度(X)為橫坐標、以峰面積(Y)為縱坐標繪制線性回歸標準曲線，分別計算出蘆丁、迷迭香酸的回歸方程。

1.2.4正交試驗設計優(yōu)選夏枯草提取工藝 參照文獻[5-7]及預試驗結(jié)果基礎上采用L9(34)正交試驗表進行設計，以迷迭香酸、蘆丁的總提取率作為考察指標，選取對迷迭香酸、蘆丁總提取率影響較大的因素，即乙醇濃度(A)、溶劑用量(B)、提取時間(C)、提取次數(shù)(D)作為考察因素，夏枯草提取正交設計因素水平見表1。按處方比例稱取夏枯草，按正交試驗表安排實驗，測定提取液的體積、迷迭香酸與蘆丁濃度，分別計算迷迭香酸、蘆丁提取率[提取率=(提取量/實驗中最高提取量)×100%]，以總提取率[(總提取率=(迷迭香酸提取率+蘆丁提取率)/2]作為考察指標，進行直觀分析、方差分析，優(yōu)選夏枯草的最佳提取工藝。

表1 夏枯草提取正交設計因素水平

1.2.5工藝驗證 按優(yōu)選的最佳提取工藝提取3批夏枯草，制備夏枯草提取液，并對提取液進行蘆丁、迷迭香酸含量測定，計算夏枯草中蘆丁、迷迭香酸提取率量，并計算總提取率?？偺崛÷?[(蘆丁提取量/正交試驗中最高提取量)×100%+(蘆丁提取量/正交試驗中最高提取量)×100%]/2。

2 結(jié) 果

2.1系統(tǒng)適用性試驗 蘆丁、迷迭香酸色譜峰保留時間分別為4.408、9.299 min；2個色譜峰與相鄰色譜峰的分離度均大于1.5，蘆丁、迷迭香酸色譜峰的理論板數(shù)分別為5 981、18 499。見圖1。

2.2標準曲線制備及線性范圍 蘆丁、迷迭香酸回歸方程分別為Y=66 365X-1 1891、Y=70 931X-70 915(r2=0.999 4、0.999 6)。見圖2。蘆丁、迷迭香酸質(zhì)量濃度分別為2.5～20.0、12.50～100.00 μg/mL范圍內(nèi)均與峰面積線性關(guān)系良好。

2.3正交試驗設計優(yōu)選夏枯草提取工藝

2.3.1直觀分析 各因素對實驗結(jié)果影響主次為A>D>B>C，即乙醇濃度>提取次數(shù)>乙醇體積>提取時間，直觀分析優(yōu)選出的組合為A2B1C2D3，即加12倍量的60%乙醇，提取3次，每次1.0 h。見表2。

表2 夏枯草提取的正交試驗直觀分析

2.3.2方差分析 乙醇濃度(A)、提取次數(shù)(D)對實驗結(jié)果影響明顯，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；乙醇體積(B)、提取時間(C)對實驗結(jié)果均無明顯影響，差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

表3 夏枯草提取的正交試驗方差分析

2.3.3工藝驗證 3批夏枯草測定并計算夏枯草中蘆丁、迷迭香酸的提取率量及總提取率結(jié)果,見表4。按優(yōu)選的最佳提取工藝提取3批夏枯草提取液中蘆丁、迷迭香酸的總提取率較高(92.5%)，超過正交試驗號4工藝得到的總提取率(88.4%)，且提取量批次間差異較小，重復性較好。

表4 夏枯草最佳提取工藝驗證試驗

3 討 論

乳腺癌是僅次于肺癌的第二大癌癥，為女性發(fā)病率、病死率均較高的惡性腫瘤，發(fā)病率每年以2%～3%速度增加，病死率超過10%[8]。目前主要采用放、化療和手術(shù)切除等治療為主[9]。中醫(yī)藥治療也有文獻報道[10]，但較少見。夏枯草在治療乳腺癌方面有基礎和臨床研究，并且效果均較明顯[11-13]，但對其活性成分的研究較少見。

本研究在前期采用細胞膜固相色譜法篩選出夏枯草中抗人乳腺癌細胞 MDA-MB-231的效應成分為迷迭香酸、蘆丁[4]，繼續(xù)開展夏枯草的最佳提取工藝的研究，以迷迭香酸、蘆丁的總提取率作為考察指標，通過正交試驗設計法優(yōu)選夏枯草的最佳提取工藝。

夏枯草提取工藝的研究較多見，包括應用正交試驗設計法優(yōu)化夏枯草的最佳提取工藝的文獻報道也較多見，楊輝等[14]以齊墩果酸含量作為指標，采用正交試驗設計法開展了優(yōu)選夏枯草提取工藝的研究，優(yōu)選結(jié)果：乙醇濃度為90%，用量為藥材量的20倍，提取時間為40 min。陳富超等[15]以木犀草素含量作為指標，采用正交試驗設計法開展了優(yōu)選夏枯草提取工藝的研究，結(jié)果顯示：乙醇濃度為60%，用量為藥材量的10倍，提取3次，每次提取時間為30 min。李萬林等[16]以總黃酮提取率作為指標，采用正交試驗設計法開展了優(yōu)選夏枯草提取工藝的研究，結(jié)果顯示：乙醇濃度為70%，用量為藥材量的16倍，提取時間為50 min。朱鶴云等[5]以迷迭香酸含量作為指標，采用正交試驗設計法開展了優(yōu)選夏枯草提取工藝的研究，結(jié)果顯示：乙醇濃度為70%，用量為藥材量的30倍，超聲功率為400 W，提取時間為60 min。劉秀梅等[6]以蘆丁含量作為指標，采用正交試驗設計法開展了優(yōu)選夏枯草提取工藝的研究，結(jié)果顯示：乙醇濃度為65%，用量為藥材量的12倍，提取2次，每次提取時間為120 min。李丹等[17]以齊墩果酸含量作為指標，采用正交試驗設計法開展了優(yōu)選夏枯草提取工藝的研究，結(jié)果顯示：乙醇濃度為95%，用量為藥材量的8倍，提取3次，每次提取時間為120 min。袁萍等[7]以總黃酮提取率作為指標，采用正交試驗設計法開展了優(yōu)選夏枯草提取工藝的研究，結(jié)果顯示：乙醇濃度為60%，用量為藥材量的10倍，提取2次，每次提取時間為90 min。目前缺少文獻報道以迷迭香酸、蘆丁總提取率作為考察指標，采用正交試驗設計法開展優(yōu)選夏枯草的提取工藝的研究。因此，開展以迷迭香酸、蘆丁總提取率作為考察指標，通過正交試驗設計法優(yōu)選夏枯草的最佳提取工藝的研究具有一定價值。本研究結(jié)果顯示，夏枯草最佳提取工藝中蘆丁、迷迭香酸提取率均超過0.17、1.92 mg/g，與文獻報道的蘆丁、迷迭香酸提取率較為接近或超過[5-6,18]。本研究采用正交設計試驗方法研究夏枯草中蘆丁、迷迭香酸的最佳提取工藝，穩(wěn)定、可行，但也存在試驗的連續(xù)性、提取時間長等問題，下一步研究可考慮嘗試采用其他方法，如均勻設計試驗法、超聲提取等方法。