熱毒寧注射液速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)機(jī)制研究

袁東琴，姜康，張宇，李冬，賀佳敏，范廣俊，孫娜*（.大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院藥學(xué)部，遼寧 大連 602；2.大連醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，遼寧 大連 6044；.復(fù)旦大學(xué)附屬金山醫(yī)院，上海 200540）

中藥注射劑因起效快、生物利用度高，被廣泛應(yīng)用于臨床治療中，但是相關(guān)不良反應(yīng)的報(bào)道也逐年增加。不良反應(yīng)病例報(bào)告調(diào)查結(jié)果顯示，中藥注射劑引起的不良反應(yīng)占中藥引起的所有不良反應(yīng)的40%以上[1]，過(guò)敏反應(yīng)是其中占比較高的一項(xiàng)不良反應(yīng)[2]。目前，中藥注射劑的過(guò)敏反應(yīng)已成為我國(guó)公眾關(guān)注的主要問(wèn)題之一，但是由于中藥注射劑成分復(fù)雜，對(duì)于其引發(fā)的過(guò)敏反應(yīng)的特點(diǎn)及其機(jī)制研究并沒(méi)有形成統(tǒng)一的定論，因此，建立一種簡(jiǎn)單、可靠的方法來(lái)預(yù)測(cè)中藥注射劑的過(guò)敏反應(yīng)具有廣泛應(yīng)用前景。

熱毒寧注射液是目前常用的一類清熱解毒類中藥注射液，由青蒿、金銀花和梔子3味常用中藥精制而成，具有清熱、疏風(fēng)、解毒的功效，臨床主要用于治療外感風(fēng)熱所致的感冒、咳嗽及急性支氣管炎等[3]，目前已將熱毒寧注射液加入到新型冠狀病毒肺炎（COVID-19）的診療方案中[4]。

隨著熱毒寧注射液臨床應(yīng)用范圍的擴(kuò)大，有關(guān)不良反應(yīng)的研究報(bào)道也逐漸增多。熱毒寧注射液最常見的不良反應(yīng)是過(guò)敏反應(yīng)，臨床表現(xiàn)主要為皮膚瘙癢和斑丘疹等，大多數(shù)不良反應(yīng)發(fā)生在用藥后30 min內(nèi)[5-6]；且血清免疫毒理學(xué)研究表明，熱毒寧注射液過(guò)敏反應(yīng)可能是由免疫球蛋白E（IgE）介導(dǎo)的Ⅰ型過(guò)敏反應(yīng)[7]，但也有研究顯示臨床使用劑量下，熱毒寧注射液及其主要成分綠原酸單次給藥不會(huì)誘導(dǎo)大鼠嗜堿性粒細(xì)胞白血病細(xì)胞（RBL-2H3）釋放組胺[8]。因研究方法和手段的單一性導(dǎo)致熱毒寧注射液過(guò)敏反應(yīng)的研究并沒(méi)有形成統(tǒng)一的定論，因此本研究以RBL-2H3作為評(píng)價(jià)模型，探討熱毒寧注射液對(duì)RBL-2H3的影響及其可能的致敏機(jī)制，為進(jìn)一步的基礎(chǔ)研究及臨床安全用藥提供參考。

1 材料

1.1 細(xì)胞和試藥

RBL-2H3（武漢普諾賽生命科技有限公司）。熱毒寧注射液（批號(hào)：200714，江蘇康緣藥業(yè)股份有限公司），鈣離子載體A23187（批號(hào)：128M4161M）、β-氨基己糖苷酶（β-hex）底物溶液（批號(hào)：SLBR7548V）（美國(guó)Sigma公司），0.33%中性紅染料（批號(hào)：201904216，北京索萊寶科技有限公司），MTT細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性檢測(cè)試劑盒（批號(hào)：SC122-01，北京賽文創(chuàng)新科技有限公司），大鼠白介素4（IL-4）ELISA試劑盒（批號(hào)：E-ELR0014c，武漢伊萊瑞特生物科技有限公司），F(xiàn)luo-3 AM Ca2＋熒光探針（批號(hào)：S1056，上海碧云天生物技術(shù)有限公司）。

1.2 儀器

CO2培養(yǎng)箱MCO-20AIC（日本Sanyo公司），多功能酶標(biāo)儀SpectraMax190（美國(guó)Molecular Devices公司），倒置顯微鏡DMI1（中國(guó)Leica公司），倒置熒光顯微鏡Leica DMI8（德國(guó)徠卡公司）。

2 方法

2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及分組

RBL-2H3采用含10%胎牛血清、1%青-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，傳代比例為1∶3，每2～3日傳代一次。實(shí)驗(yàn)分組為：對(duì)照組（正常細(xì)胞未加藥處理），熱毒寧注射液（25、50、100、200 μL·mL－1）處理組，陽(yáng)性對(duì)照組（鈣離子載體A23187，1μmol·L－1）。

2.2 細(xì)胞脫顆粒

2.2.1β-hex釋放率的測(cè)定 取對(duì)數(shù)期的RBL-2H3，以1×105/孔接種于24孔板孵育過(guò)夜，棄上清液，用Tyrode’s buffer溶液洗滌細(xì)胞兩次，在室溫下加入Tyrode’s buffer溶液、不同濃度的熱毒寧注射液和1% Triton X-100、鈣離子載體A23187孵育1 h，冰浴10 min終止反應(yīng)，取50 μL上清液于96孔板中，同時(shí)加入50 μL的β-hex底物溶液孵育1 h，加入Na2CO3/NaHCO3緩沖液，5 min內(nèi)于酶標(biāo)儀上405 nm處檢測(cè)各組OD值。

2.2.2 中性紅染色 取“2.2.1”項(xiàng)下24孔板，用Tyrode’s buffer溶液洗滌細(xì)胞兩次，加入中性紅染色（0.33%）孵育5 min，棄上清液，倒置顯微鏡下觀察脫顆粒的RBL-2H3并拍照。

2.3 細(xì)胞活力測(cè)定

取對(duì)數(shù)期的RBL-2H3，以1×104/孔接種于96孔板孵育過(guò)夜，每孔加入不同濃度的熱毒寧注射液孵育1 h，每孔加入20 μL MTT工作液，孵育4 h，棄上清液，加入100 μL DMSO孵育15 min，待結(jié)晶全部溶解時(shí)于酶標(biāo)儀上570 nm處檢測(cè)各組OD值。

2.4 ELISA法檢測(cè) IL-4的釋放量

取對(duì)數(shù)期的RBL-2H3，以1×106/孔接種于6孔板，孵育過(guò)夜，每孔加入Tyrode’s buffer溶液、不同濃度的熱毒寧注射液和鈣離子載體A23187孵育1 h。使用ELISA試劑盒檢測(cè)上清液中IL-4的含量。

2.5 細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度測(cè)定

取對(duì)數(shù)期的RBL-2H3，以5×104/孔接種于24孔板，孵育過(guò)夜，用PBS洗滌細(xì)胞兩次，加入3.5 mmol·L－1Fluo-3 AM Ca2＋孵育30 min，用PBS清洗兩次，加入1 mL PBS孵育20 min，熱毒寧注射液在初始成像后10 s加入到孔中，在倒置熒光顯微鏡下拍攝不同時(shí)間（0、30、50、70、90 s）的熒光圖片。

2.6 統(tǒng)計(jì)分析

所有計(jì)量資料均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件，組間比較采用單因素方差分析，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；其中Ca2＋相對(duì)熒光強(qiáng)度曲線運(yùn)用Image J軟件分析90 s內(nèi)的細(xì)胞熒光圖片，以F/F0為縱坐標(biāo)，繪制相對(duì)熒光強(qiáng)度變化曲線圖。

3 結(jié)果

3.1 熱毒寧注射液引起RBL-2H3脫顆粒

3.1.1 熱毒寧注射液對(duì)β-hex釋放的影響 如圖1所示，與對(duì)照組相比，隨著熱毒寧注射液濃度的增加，β-hex的釋放率顯著增加，且呈劑量依賴性，其中熱毒寧注射液濃度在100、200 μL·mL－1時(shí)，β-hex的釋放率分別為（17.39±2.464）%，（26.39±4.391）%（P＜0.01）。由此可見，熱毒寧注射液可劑量依賴性地引起β-hex的釋放率增加。

圖1 熱毒寧注射液對(duì)β-hex釋放率的影響Fig 1 Effect of Reduning injection on the releasing rate of β-hex

3.1.2 RBL-2H3脫顆粒后的細(xì)胞形態(tài)變化 如圖2所示，用中性紅染液對(duì)處理之后的細(xì)胞進(jìn)行染色，從倒置顯微鏡中可以觀察到，正常的RBL-2H3呈梭形，細(xì)胞膜完整（見圖2A）；而用熱毒寧注射液處理的細(xì)胞出現(xiàn)脫顆粒現(xiàn)象（見圖2B），細(xì)胞體積變大，細(xì)胞膜破裂，細(xì)胞內(nèi)有空泡產(chǎn)生；圖2C 為1% Triton X-100裂解的細(xì)胞，細(xì)胞已無(wú)清晰形態(tài)，細(xì)胞內(nèi)顆粒變少，而細(xì)胞外可看到一些被染色的顆粒。

圖2 RBL-2H3脫顆粒后的細(xì)胞形態(tài)變化（×10）Fig 2 Morphological change of RBL-2H3 after degranulation（×10）

3.2 熱毒寧注射液對(duì)細(xì)胞活力的影響

采用MTT法檢測(cè)熱毒寧注射液對(duì)RBL-2H3活力的影響，結(jié)果如圖3所示，熱毒寧注射液在25、50、100、200 μL·mL－1時(shí)，對(duì)細(xì)胞的活性無(wú)明顯影響。

圖3 熱毒寧注射液對(duì)細(xì)胞活力的影響Fig 3 Effect of Reduning injection on cell viability

3.3 熱毒寧注射液對(duì)IL-4釋放的影響

如圖4所示，隨著熱毒寧注射液濃度的增加，IL-4的釋放濃度與對(duì)照組相比顯著增加，且呈劑量依賴性，其中熱毒寧注射液濃度在50、100、200 μL·mL－1時(shí)，IL-4的釋放濃度分別為（8.009±1.1）pg·mL－1、（12.62±0.88）pg·mL－1、（15.13±1.1）pg·mL－1，與對(duì)照組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01）。

圖4 熱毒寧注射液對(duì)IL-4釋放的影響Fig 4 Effect of Reduning injection on IL-4 release

3.4 熱毒寧注射液對(duì)細(xì)胞內(nèi)Ca2＋的影響

從圖5中，可以明顯觀察到，RBL-2H3在不同濃度的熱毒寧注射液作用下，細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度發(fā)生明顯改變，在熱毒寧注射液作用細(xì)胞30 s時(shí)，Ca2＋熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng)，而隨著作用時(shí)間的推移，Ca2＋熒光強(qiáng)度呈現(xiàn)降低的趨勢(shì)。

圖5 熱毒寧注射液對(duì)RBL-2H3熒光強(qiáng)度的影響（×10）Fig 5 Effect of Reduning injection on the fluorescence intensity of RBL-2H3（×10）

運(yùn)用Image J軟件分析90 s內(nèi)記錄的各細(xì)胞熒光圖片的熒光強(qiáng)度，以F/F0為縱坐標(biāo)，繪制RBL-2H3在熱毒寧注射液作用下細(xì)胞的相對(duì)熒光強(qiáng)度變化曲線。如圖6所示，細(xì)胞在作用30 s內(nèi)有一定熒光強(qiáng)度增加的趨勢(shì)，隨著作用時(shí)間的推移，細(xì)胞的熒光強(qiáng)度開始逐漸降低，表明胞內(nèi) Ca2＋濃度在升高之后逐漸降低。

圖6 RBL-2H3相對(duì)熒光強(qiáng)度變化曲線Fig 6 Change curve of relative fluorescence intensity of RBL-2H3

4 討論

中藥注射劑誘發(fā)的過(guò)敏反應(yīng)已引起廣泛關(guān)注，雖然目前已有大量研究探索中藥注射劑過(guò)敏反應(yīng)的特點(diǎn)及其致敏機(jī)制，如有關(guān)雙黃連注射液[9-10]、清開靈注射液[11]的研究，但是由于中藥注射劑成分以及制備工藝等的復(fù)雜性，對(duì)于其引發(fā)的過(guò)敏反應(yīng)的特點(diǎn)及其機(jī)制研究并沒(méi)有形成統(tǒng)一的定論，目前通過(guò)檢測(cè)相關(guān)炎性介質(zhì)的含量變化，并深入探究其致敏機(jī)制已成為研究的趨勢(shì)。

自從1981年以來(lái)，RBL-2H3已被廣泛用作肥大細(xì)胞模型，RBL-2H3易培養(yǎng)且對(duì)FcεRI介導(dǎo)的機(jī)制具有特異性反應(yīng)等特點(diǎn)[12]，近些年興起的檢測(cè)藥物致敏性的體外模型[13]，為了探究熱毒寧注射液引起的速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)的特點(diǎn)及其機(jī)制，本研究選用RBL-2H3作為細(xì)胞模型，研究發(fā)現(xiàn)在用不同濃度的熱毒寧注射液與RBL-2H3孵育30 min，通過(guò)中性紅染色可明顯看出細(xì)胞出現(xiàn)脫顆?，F(xiàn)象。脫顆粒是肥大細(xì)胞發(fā)生過(guò)敏反應(yīng)時(shí)的重要現(xiàn)象，細(xì)胞脫顆粒之后，由中性紅染色法或者甲苯胺藍(lán)染色法可以明顯看出細(xì)胞有空泡形成，由此可見，熱毒寧注射液引起RBL-2H3脫顆粒，推斷熱毒寧注射液可能會(huì)引起速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)。

同時(shí)選用過(guò)敏反應(yīng)的重要標(biāo)志物β-hex、IL-4作為釋放介質(zhì)的檢測(cè)指標(biāo)[14]，對(duì)熱毒寧注射液引發(fā)的速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià)。研究發(fā)現(xiàn)隨著熱毒寧注射液濃度的升高，β-hex以及IL-4的釋放率明顯增加，且呈劑量依賴性。研究表明熱毒寧注射液可引起RBL-2H3的脫顆粒，但是如果實(shí)驗(yàn)所設(shè)置的藥物濃度對(duì)細(xì)胞有毒性作用，影響細(xì)胞的活力，同樣會(huì)使細(xì)胞出現(xiàn)脫顆粒現(xiàn)象，為排除此影響因素，選用MTT法探究所設(shè)置濃度下熱毒寧注射液對(duì)細(xì)胞活力的影響，研究表明在熱毒寧注射液所設(shè)置濃度下對(duì)細(xì)胞活力并沒(méi)有影響，進(jìn)一步證實(shí)熱毒寧注射液可引起RBL-2H3的脫顆粒，引發(fā)速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)。

鈣運(yùn)動(dòng)與肥大細(xì)胞脫顆粒的機(jī)制密切相關(guān)，當(dāng)肥大細(xì)胞被激活時(shí)，細(xì)胞間Ca2＋濃度增加，釋放細(xì)胞質(zhì)顆粒中包含的炎癥介質(zhì)，引起肥大細(xì)胞脫顆粒[15]。本研究用Fluo-3 AM Ca2＋熒光探針探究熱毒寧注射液作用于RBL-2H3時(shí)，細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度變化，結(jié)果細(xì)胞均在作用30 s內(nèi)有一定熒光強(qiáng)度增加的趨勢(shì)，隨著作用時(shí)間的推移，細(xì)胞的熒光強(qiáng)度開始逐漸降低，表明胞內(nèi)鈣離子濃度在致敏90 s內(nèi)逐漸升高之后逐漸降低，提示熱毒寧注射液可能通過(guò)調(diào)節(jié)Ca2＋內(nèi)流而引起RBL-2H3的脫顆粒。

綜上所述，熱毒寧注射液可劑量依賴性地引起RBL-2H3脫顆粒，其機(jī)制可能是通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)Ca2＋濃度而發(fā)揮作用，本研究進(jìn)一步證實(shí)了熱毒寧注射液過(guò)敏反應(yīng)患者的血清免疫毒理學(xué)研究結(jié)果，為探究熱毒寧注射液誘發(fā)的速發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)提供一定的實(shí)驗(yàn)依據(jù)，其具體的作用機(jī)制，需要進(jìn)一步深入研究。