偏痛湯1號(hào)對(duì)硝酸甘油致偏頭痛模型大鼠藥效學(xué)影響研究

羅亞敏 葛 飛 李伊然 周冉冉 張 瑤 李 冉 陶曉華

(北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京，100029)

偏頭痛是一種臨床常見(jiàn)的原發(fā)性頭痛疾病，常伴自主神經(jīng)癥狀。其發(fā)病率較高，具有反復(fù)發(fā)作、遷延不愈的特點(diǎn)，好發(fā)于女性及青少年。女性發(fā)病率占非老年人2倍，其對(duì)本病敏感性更強(qiáng)、持續(xù)時(shí)間更長(zhǎng)、癥狀表現(xiàn)更劇烈，尤以皮膚異常疼痛感為甚[1-2]，多個(gè)國(guó)家和地區(qū)也有相關(guān)研究顯示女性偏頭痛患病率為男性的2～4倍[3-4]。我國(guó)偏頭痛患病率為9.3%，其中男性5.9%，女性12.8%[5]。偏頭痛患者常伴中風(fēng)、心房顫動(dòng)、高血壓等心血管疾病，出現(xiàn)胸痛、暈厥甚至猝死，尤以女性更甚，證明其發(fā)病程度趨于嚴(yán)重化及女性人群趨于敏感化[6-7]。偏痛湯1號(hào)是陶曉華教授對(duì)偏頭痛理論、臨床專題研究數(shù)十載及其在協(xié)定處方偏痛湯膠囊流浸膏的臨床和實(shí)驗(yàn)探究基礎(chǔ)上[8-16]，并針對(duì)本病“風(fēng)痰互結(jié)、瘀濁內(nèi)阻、清陽(yáng)失布”的病機(jī)特征，于偏痛湯組方(川芎10 g、地龍10 g、僵蠶6 g、珍珠母30 g、紅花10 g、雞血藤15 g、夏枯草15 g、細(xì)辛3 g、白芍20 g、甘草6 g)中增補(bǔ)蔓荊子一味而成的系列抗偏頭痛協(xié)定方之一，具有化痰降濁、祛瘀止痛、升清疏散的功效。本課題組前期基于UHPLC-LTQ-Orbitrap MS技術(shù)對(duì)本方化學(xué)成分信息及藥效物質(zhì)基礎(chǔ)進(jìn)行研究表明其抗偏頭痛作用與鎮(zhèn)痛抗炎、修復(fù)中樞敏化有關(guān)[17-18]。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)亦顯示偏痛湯1號(hào)顯著下調(diào)硝酸甘油致偏頭痛模型大鼠硬腦膜、血漿CGRP蛋白表達(dá)水平及硬腦膜前列腺素E2、腫瘤壞死因子-α表達(dá)水平，從而達(dá)到抑制神經(jīng)源炎性痛敏性偏頭痛的作用[19]。在此基礎(chǔ)上，本研究以大鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)為研究方法，探討偏痛湯1號(hào)對(duì)硝酸甘油致偏頭痛模型大鼠藥效學(xué)影響及雌雄大鼠罹患偏頭痛后的指標(biāo)變化。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物 SPF級(jí)雄、雌性SD大鼠84只，體質(zhì)量(200±10)g，購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，合格證號(hào)：SCXK(京)2016-0006。本次動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)術(shù)委員會(huì)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理分委員會(huì)批準(zhǔn)(倫理審批號(hào):BUCM-4-2019 111901-4062)，符合動(dòng)物倫理委員會(huì)的要求，并飼養(yǎng)于北京中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，環(huán)境溫度21～24 ℃，相對(duì)濕度60%～70%，24 h晝夜循環(huán)光環(huán)境，適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，進(jìn)行模型制備。

1.1.2 藥物 偏痛湯1號(hào)由北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院藥劑科制備，臨時(shí)用蒸餾水配成相應(yīng)濃度的混懸液；Trpv1抑制劑-SB705498(Bioruler，美國(guó)，生產(chǎn)批號(hào)：r4438)；佐米曲普坦片(萬(wàn)特制藥有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字H20061077)；硝酸甘油注射液(北京益民藥業(yè)有限公司,國(guó)藥準(zhǔn)字H11020289)。

1.1.3 試劑與儀器 Rat 5-HT ELISA KIT(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字20201015-30019B)；Rat HIS ELISA KIT(上海酶聯(lián)生物科技有限公司，國(guó)藥準(zhǔn)字20201015-31092B)；Von Frey Hairs觸覺(jué)測(cè)量套件(Ugo Basile,意大利,型號(hào)：514000-20C)；酶標(biāo)儀(Thermo Scientific，美國(guó)，型號(hào)：Multiskan MK3)；自動(dòng)洗衣板(北京拓普分析儀器有限公司，型號(hào)：DEM-3)；電熱恒溫培養(yǎng)箱(黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司，型號(hào)：SKP-02.600)。

1.2 方法

1.2.1 動(dòng)物分組與模型制備 84只SD大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后，按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組(12只)、假手術(shù)組(12只)和模型組(60只)，各組雌雄各半。模型組于大鼠頸背部皮下注射硝酸甘油10 mg/(kg·d)，2 d/次，共5次，建立偏頭痛模型；假手術(shù)組頸背部皮下注射0.9%生理鹽水20 μL/(kg·d)，注射次數(shù)同模型組。觀察每次造模時(shí)的行為學(xué)表現(xiàn)，于20 min內(nèi)出現(xiàn)前肢頻繁撓頭、往返運(yùn)動(dòng)、爬籠次數(shù)增多等現(xiàn)象，60 min左右上述表現(xiàn)達(dá)到高峰，視為造模成功[20]。

采用Oshinsky和Gomonchareonsiri[21]方法，將大鼠置于固定器中安靜30 min后，測(cè)定第1次造模前1 h及前4次造模后第2天大鼠眼眶痛覺(jué)閾值。與空白組比較，假手術(shù)組眼眶痛覺(jué)閾值變化不明顯，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，而模型組痛閾顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；與假手術(shù)組比較，模型組顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，提示硝酸甘油觸發(fā)的疼痛敏化表現(xiàn)明顯，提示偏頭痛模型大鼠造模成功。將60只成模大鼠按隨機(jī)數(shù)字表分成模型組、陽(yáng)性藥組、TRPV1抑制劑組、偏痛湯1號(hào)組、TRPV1抑制劑+偏痛湯1號(hào)組，每組12只，雌雄各半。

1.2.2 給藥方法 分組后各組大鼠給予相應(yīng)藥物連續(xù)灌胃7 d。空白組、假手術(shù)組和模型組每天給予等容積蒸餾水5 mL/(kg·d)，陽(yáng)性藥組給予0.25 mg/(kg·d)佐米曲普坦片灌胃，TRPV1抑制劑組灌胃SB705498 3 mg/(kg·d)[22]，偏痛湯1號(hào)組灌胃中藥13.5 g/(kg·d)，按生藥量計(jì)算，以上各組灌胃劑量均相當(dāng)于臨床成人用量6倍。同時(shí)在灌胃1 d、4 d、7 d時(shí)觀察大鼠行為學(xué)變化及2 d、4 d、6 d時(shí)檢測(cè)各組大鼠眼眶痛閾值。

1.2.3 行為學(xué)表現(xiàn)及觀察指標(biāo) 給藥前30 min將大鼠置于透明玻璃觀察箱內(nèi)熟悉環(huán)境，給藥后1 h內(nèi)繼續(xù)在箱內(nèi)觀察每組大鼠爬籠次數(shù)、抓撓頭部(頭皮及眶周)次數(shù)及往返運(yùn)動(dòng)次數(shù)，并記錄觀察指標(biāo)：1)抓撓頭部出現(xiàn)連續(xù)5次及以上為標(biāo)志，而消失征象以1個(gè)時(shí)間段撓抓次數(shù)少于5次并出現(xiàn)疲勞、倦怠為基準(zhǔn)；2)大鼠撓抓頭部行為以前后肢撓抓為記錄指征，爬籠行為以大鼠前后肢抓籠蓋為記錄指征，往返運(yùn)動(dòng)行為以大鼠頭部向后轉(zhuǎn)至尾部為記錄指征。

1.2.4 Von Frey纖維絲測(cè)眼周皮膚痛覺(jué)閾值 大鼠在固定器中進(jìn)行5 d適應(yīng)性訓(xùn)練，每天15 min。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí)從Von Frey最小纖維絲型號(hào)開(kāi)始(log值1.65，對(duì)應(yīng)0.008 g)對(duì)大鼠眼眶周圍皮膚進(jìn)行刺激，逐漸增加至最大纖維絲型號(hào)(log值6.65，對(duì)應(yīng)300 g)，每根纖維絲需刺激5次，其中出現(xiàn)3次及以上陽(yáng)性反應(yīng)，如大鼠縮頭、用前爪撥開(kāi)纖維絲及發(fā)聲等表現(xiàn)時(shí)，可將大鼠陽(yáng)性反應(yīng)對(duì)應(yīng)的log值記錄為疼痛閾值。

1.2.5 樣本采集 以50 mg/(kg·d)劑量腹腔注射1%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，腹主動(dòng)脈取血5 mL，置于抗凝真空采血管中，輕輕搖勻，4 ℃，3 000 r/min，離心10 min，分離血漿，-20 ℃保存，用酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)法檢測(cè)。

1.2.6 各組大鼠外周血漿中5-羥色胺、組胺蛋白含量測(cè)定 運(yùn)用ELISA技術(shù)檢測(cè)，依照試劑盒說(shuō)明書(shū)，對(duì)外周血漿組胺、5-羥色胺進(jìn)行檢測(cè)和分析。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，當(dāng)每組數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布時(shí)，組間比較采用One-way ANOVA法。若方差齊性，組間差異比較采用LSD法；若方差不齊性，組間差異比較采用Tamhane法，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 頸背部皮下注射硝酸甘油會(huì)誘導(dǎo)偏頭痛樣行為和眼眶皮膚痛敏反應(yīng) 與空白組比較，模型組大鼠每次造模后撓頭及往返運(yùn)動(dòng)等偏頭痛樣行為評(píng)分均顯著上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，而爬籠行為僅于第2次造模后評(píng)分顯著增加，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；假手術(shù)組大鼠每次造模后撓頭、爬籠、往返運(yùn)動(dòng)等偏頭痛樣行為評(píng)分與模型組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠每次造模后撓頭行為評(píng)分均顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，往返運(yùn)動(dòng)評(píng)分在1 T、2 T、3 T、5 T造模后的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)；2組大鼠每次造模后爬籠行為評(píng)分比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。見(jiàn)圖1A～1C。

如圖1D所示，第1次造模前1 h 3組大鼠基礎(chǔ)疼痛閾值比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。模型組大鼠在前4次造模后第2天眼眶痛覺(jué)閾值均下降，與空白組比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)；假手術(shù)組大鼠前4次造模后眼眶痛覺(jué)閾值差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。模型組大鼠前4次造模后眼眶痛覺(jué)閾值均呈顯著下調(diào)，與假手術(shù)組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。故根據(jù)以上結(jié)果顯示皮下多次注射硝酸甘油會(huì)誘導(dǎo)偏頭痛樣行為，且引起模型大鼠敏化性痛覺(jué)反應(yīng)，提示從行為學(xué)角度痛敏性偏頭痛模型造模成功。

圖1 造模后偏頭痛樣行為及眼眶皮膚超敏反應(yīng)變化

2.2 偏痛湯1號(hào)對(duì)硝酸甘油誘導(dǎo)的偏頭痛樣行為及眼眶皮膚痛敏反應(yīng)影響 大鼠灌胃后各組行為學(xué)評(píng)分如圖2A～2C所示。與空白組比較，模型組大鼠灌胃第1天、第4天、第7天撓頭及往返運(yùn)動(dòng)評(píng)分顯著提高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05，P<0.01)，爬籠評(píng)分于灌胃第7天顯著下降(P<0.01)，表明硝酸甘油造模成功后爬籠行為會(huì)因大鼠出現(xiàn)偏頭痛樣疲倦而降低。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠亦表現(xiàn)為撓頭顯著性上升，而往返運(yùn)動(dòng)評(píng)分僅在第4天及第7天明顯增加差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)。與模型組比較，陽(yáng)性藥組大鼠灌胃第4天、第7天撓頭行為學(xué)評(píng)分顯著性下調(diào)，灌胃第1天往返運(yùn)動(dòng)評(píng)分顯著下降，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)；TRPV1抑制劑組、偏痛湯1號(hào)組、TRPV1抑制劑+偏痛湯1號(hào)組撓頭評(píng)分明顯下降，而往返運(yùn)動(dòng)于灌胃第1天見(jiàn)偏痛湯1號(hào)組顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，其余時(shí)間偏痛湯1號(hào)組下降趨勢(shì)均較其余組下降明顯，表示偏痛湯1號(hào)組對(duì)偏頭痛樣行為抑制效果較佳。

如圖2-D所示，與空白組及假手術(shù)組比較，模型組大鼠灌胃第2天、第4天、第6天疼痛閾值顯著降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)。而與模型組比較，陽(yáng)性藥組及TRPV1抑制劑組大鼠灌胃第2天、第4天眼眶疼痛閾值顯著上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)，TRPV1抑制劑+偏痛湯1號(hào)組大鼠灌胃第2天、第6天疼痛閾值明顯上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，偏痛湯1號(hào)組大鼠灌胃第2天、第4天、第6天眼眶痛敏閾值顯著性升高，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05，P<0.01)。與陽(yáng)性藥組比較，TRPV1抑制劑+偏痛湯1號(hào)組大鼠灌胃第4天痛敏反應(yīng)較為顯著，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，而與TRPV1抑制劑組比較，偏痛湯1號(hào)組灌胃第6天痛敏反應(yīng)下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，表明偏痛湯1號(hào)組上調(diào)疼痛閾值，抑制痛敏性偏頭痛效果最為明顯。

圖2 灌胃后偏頭痛樣行為及眼眶皮膚超敏反應(yīng)變化

2.3 偏痛湯1號(hào)對(duì)外周血漿5-羥色胺、組胺蛋白表達(dá)水平影響 如圖3所示，假手術(shù)組大鼠血漿5-羥色胺、組胺蛋白表達(dá)與空白組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；而模型組大鼠組胺蛋白含量顯著上調(diào)，5-羥色胺蛋白含量顯著下調(diào)，與空白組比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05，P<0.01)。模型組大鼠組胺蛋白表達(dá)水平顯著上升，與假手術(shù)組比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；表明作為偏頭痛發(fā)作的標(biāo)志性物質(zhì)血管活性胺濃度變化顯示本次偏頭痛模型造模成功。與模型組比較，陽(yáng)性藥組、偏痛湯1號(hào)組大鼠血漿組胺蛋白表達(dá)均顯著性下調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.01)；而除TRPV1抑制劑組外，其余組大鼠血漿中5-羥色胺蛋白表達(dá)水平均顯著上調(diào)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05，P<0.01)，表示偏痛湯1號(hào)對(duì)偏頭痛標(biāo)志性蛋白顯示改善作用。

圖3 各組大鼠血漿5-羥色胺、組胺蛋白表達(dá)水平變化

2.4 雌雄大鼠偏頭痛樣行為評(píng)分及痛敏反應(yīng)閾值比較 偏頭痛發(fā)作時(shí)間、疼痛敏感、強(qiáng)度與性別關(guān)聯(lián)密切，故根據(jù)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)結(jié)果進(jìn)一步分析雌雄大鼠偏頭痛樣行為評(píng)分及痛敏反應(yīng)的差異。如圖4所示，與雌性-模型組比較，雄性-模型組在1 T造模后撓頭評(píng)分顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，爬籠行為學(xué)評(píng)分在3 T造模后顯著下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)，往返運(yùn)動(dòng)行為學(xué)評(píng)分在2T、3T、4T、5T造模后均明顯降低，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，P<0.01)，且前4次造模后第2天眼眶痛覺(jué)閾值均呈下降趨勢(shì)，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P>0.05)。

圖4 模型組雌雄大鼠偏頭痛樣行為學(xué)評(píng)分及痛閾值比較

如圖5所示，與雌性-偏痛湯1號(hào)組比較，雄性-偏痛湯1號(hào)組灌胃第1天、第4天、第7天撓頭行為學(xué)評(píng)分呈下降趨勢(shì)，爬籠評(píng)分在第4天顯著下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，至第7天差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，疼痛閾值在第2天、第4天顯著降低，而在第6天明顯上升，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(均P<0.05，P<0.01)。

圖5 偏痛湯1號(hào)組雌雄大鼠偏頭痛樣行為學(xué)及痛閾值差異比較

以上結(jié)果顯示，模型組雌雄大鼠撓頭、爬籠行為評(píng)分及痛敏反應(yīng)差異趨勢(shì)較小，往返運(yùn)動(dòng)行為評(píng)分差異顯著，經(jīng)灌胃治療后，雄性大鼠撓頭現(xiàn)象下降趨勢(shì)較為明顯，而爬籠、往返運(yùn)動(dòng)等偏頭痛樣行為評(píng)分下調(diào)趨勢(shì)與雌性大鼠差別不大，疼痛閾值顯著上升，推測(cè)偏頭痛發(fā)作時(shí)雌性大鼠煩躁不安表現(xiàn)明顯，疼痛耐受感表現(xiàn)較強(qiáng)烈，用藥后療效較雄性大鼠差，耐藥性較高。

2.5 雌雄大鼠外周血漿5-羥色胺、組胺蛋白水平比較 如圖6所示，與雌性-模型組比較，雄性-模型組外周血漿組胺蛋白表達(dá)水平顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與雌性-偏痛湯1號(hào)組比較，雄性-偏痛湯1號(hào)組組胺蛋白表達(dá)顯著上升，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。與雌性大鼠比較，推測(cè)偏頭痛發(fā)作時(shí)雄性大鼠組胺表達(dá)上升顯著，5-羥色胺表達(dá)亦有上調(diào)趨勢(shì)，而經(jīng)藥物治療后組胺、5-羥色胺表達(dá)變化趨勢(shì)不甚明顯，具體因素需進(jìn)一步通過(guò)代謝組學(xué)研究其機(jī)制差異。

圖6 模型組、偏痛湯1號(hào)組雌雄大鼠5-羥色胺、組胺蛋白表達(dá)水平比較

3 討論

偏頭痛發(fā)病機(jī)制復(fù)雜多端，致使基礎(chǔ)研究缺乏完整復(fù)制本病的動(dòng)物模型。而硝酸甘油轉(zhuǎn)化的偏頭痛模型對(duì)本病特點(diǎn)還原度較高，其可誘發(fā)“頭痛持續(xù)發(fā)作4～72 h、搏動(dòng)樣表現(xiàn)、惡心和/或嘔吐、異常性疼痛”等癥狀，符合國(guó)際頭痛協(xié)會(huì)偏頭痛的診斷標(biāo)準(zhǔn)[23]，且研究表明偏頭痛患者靜脈注射一氧化氮供體硝酸甘油可誘發(fā)偏頭痛樣頭痛發(fā)作[24]。一氧化氮通過(guò)肥大細(xì)胞脫顆粒介導(dǎo)血管活性胺變化、神經(jīng)源性炎癥閉環(huán)級(jí)聯(lián)反應(yīng)、神經(jīng)肽及神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子變化等途徑參與三叉神經(jīng)血管系統(tǒng)(Trigeminovascular System，TGVS)的致敏和激活[26-28]，并增加三叉神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的敏感性和興奮性，致使本病反復(fù)發(fā)作、遷延難愈。有報(bào)道經(jīng)硝酸甘油處理制備的偏頭痛動(dòng)物模型廣泛應(yīng)用于偏頭痛的基礎(chǔ)研究，均證實(shí)了硝酸甘油不僅觸發(fā)偏頭痛樣頭痛，且誘導(dǎo)模型動(dòng)物產(chǎn)生痛覺(jué)過(guò)敏[29-31]。在此次研究中，基于硝酸甘油建立大鼠偏頭痛模型以探索模型有效性及偏痛湯1號(hào)藥效學(xué)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，頸背部皮下注射硝酸甘油會(huì)導(dǎo)致模型大鼠偏頭痛樣行為及敏化痛覺(jué)反應(yīng)，與文獻(xiàn)記載該模型的研究結(jié)果相似[32-33]。而偏痛湯1號(hào)可緩解大鼠偏頭痛樣行為及痛敏反應(yīng)，表明偏痛湯1號(hào)可通過(guò)改善偏頭痛大鼠行為學(xué)及疼痛閾值治療偏頭痛。

5-羥色胺是一種在腦內(nèi)保護(hù)神經(jīng)元免受“興奮神經(jīng)毒素”損害的單胺抑制類神經(jīng)遞質(zhì)，在外周促進(jìn)血管收縮、血液凝固的血管收縮因子[34]。已有臨床研究證明靜脈滴注5-羥色胺可抑制自發(fā)性偏頭痛發(fā)作[35]。臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究亦提出血漿和腦中5-羥色胺低表達(dá)間接增加TGVS敏感性，可導(dǎo)致偏頭痛的反復(fù)發(fā)作[36-38]，且在本病發(fā)作期間尿液中5-羥色胺代謝物增加[39]，表明血漿5-羥色胺低表達(dá)在偏頭痛發(fā)作中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示模型組大鼠血漿5-羥色胺表達(dá)顯著下調(diào)，與以上文獻(xiàn)研究結(jié)果一致，而中藥復(fù)方偏痛湯1號(hào)可顯著上調(diào)血漿5-羥色胺表達(dá)水平，說(shuō)明偏痛湯1號(hào)可通過(guò)促進(jìn)5-羥色胺高表達(dá)而抑制偏頭痛發(fā)作。

組胺是一種由嗜堿性球和附近結(jié)締組織肥大細(xì)胞產(chǎn)生的含氮生物胺，其參與局部免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)，亦是一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)[40]。在偏頭痛發(fā)作期間血漿組胺水平顯著升高，且靜脈滴注組胺會(huì)促進(jìn)偏頭痛樣頭痛[41-42]。實(shí)驗(yàn)研究表明組胺能夠刺激小膠質(zhì)細(xì)胞釋放炎癥介質(zhì)[43]。在偏頭痛發(fā)作期間，通過(guò)TGVS激活導(dǎo)致肥大細(xì)胞脫顆粒釋放組胺引起離子通道及炎癥閉環(huán)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，維持神經(jīng)源性炎癥及中樞敏化特征，表明組胺在偏頭痛的發(fā)病機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用[44]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果亦顯示，模型組大鼠血漿組胺表達(dá)顯著上升，與以上文獻(xiàn)結(jié)果闡述一致，且偏痛湯1號(hào)對(duì)血漿組胺表達(dá)顯著下調(diào)，證明偏痛湯1號(hào)方可通過(guò)抑制組胺所造成的神經(jīng)源性炎癥狀態(tài)而治療偏頭痛。

硝酸甘油誘導(dǎo)的偏頭痛模型大鼠腦內(nèi)神經(jīng)元激活存在性別差異[45]，表明性別是導(dǎo)致偏頭痛發(fā)病率差異的重要因素，其可能與雌激素通過(guò)腦神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子及細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶途徑促進(jìn)中樞致敏有關(guān)。在硝酸甘油觸發(fā)的偏頭痛模型中，雌性大小鼠對(duì)機(jī)械性痛覺(jué)過(guò)敏感覺(jué)更為強(qiáng)烈，其會(huì)出現(xiàn)延遲發(fā)作的現(xiàn)象，同時(shí)在后爪皮內(nèi)注射硝酸甘油亦導(dǎo)致雌性大鼠痛覺(jué)反應(yīng)更為敏感[46]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型組雌雄大鼠撓頭、爬籠行為、痛敏反應(yīng)及5-羥色胺表達(dá)差異趨勢(shì)較小，往返運(yùn)動(dòng)行為評(píng)分及組胺表達(dá)差異顯著，經(jīng)灌胃治療后，雄性大鼠撓頭現(xiàn)象下降趨勢(shì)較為明顯，而爬籠、往返運(yùn)動(dòng)等評(píng)分下調(diào)趨勢(shì)與雌性大鼠差別不大，疼痛閾值顯著上升，5-羥色胺、組胺表達(dá)下調(diào)趨勢(shì)不甚明顯，具體需進(jìn)一步以代謝組學(xué)方法評(píng)估性別特征在本病中發(fā)病率的差異。

偏痛湯1號(hào)以川芎、蔓荊子為君，善活血行氣、祛風(fēng)止痛，協(xié)同為用。地龍、僵蠶、珍珠母、夏枯草、紅花、雞血藤共為臣藥，化痰降濁、祛瘀止痛。細(xì)辛，入陰經(jīng)，引藥上行。白芍、甘草，取甘酸化陰、緩急止痛之意，共為佐使。全方配伍，剛?cè)嵯酀?jì)，升降有常，主輔有序，針對(duì)本病風(fēng)痰互結(jié)、瘀濁內(nèi)阻、清陽(yáng)失布的核心病機(jī)，有效改善偏頭痛反復(fù)發(fā)作的特性?，F(xiàn)代藥理研究認(rèn)為，川芎含生物堿川芎嗪，能通過(guò)血腦屏障，可通過(guò)影響單胺類遞質(zhì)的釋放，緩解神經(jīng)源炎癥而改善偏頭痛[47]。蔓荊子、夏枯草、細(xì)辛、白芍均有不同程度的鎮(zhèn)痛、抗炎作用[48-51]。雞血藤、紅花均具有抗凝、改善微循環(huán)作用[52-54]，提示本方可以通過(guò)多途徑-多方向發(fā)揮抗偏頭痛療效，而具體分子生物學(xué)機(jī)制需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

偏頭痛是腦內(nèi)多區(qū)域、多途徑、多機(jī)制相互作用形成的一種復(fù)雜疾病。在過(guò)去幾十年中，基于硝酸甘油處理制備的臨床及動(dòng)物模型為偏頭痛潛在發(fā)病因素研究做出了重要貢獻(xiàn)。故進(jìn)一步以本模型研究偏頭痛不僅能預(yù)測(cè)潛在藥物靶標(biāo)，還將為本病發(fā)病原因及其內(nèi)在分子生物學(xué)機(jī)制探索提供新線索。本研究結(jié)果亦顯示，硝酸甘油在誘導(dǎo)偏頭痛樣行為及痛敏反應(yīng)上的作用，并深入以血漿血管活性胺水平變化表明模型的有效性。而經(jīng)硝酸甘油誘導(dǎo)的偏頭痛經(jīng)偏痛湯1號(hào)干預(yù)后均有不同程度的改善，證明偏痛湯1號(hào)方劑具有抗偏頭痛的作用，具體分子生物學(xué)機(jī)制需要進(jìn)一步探究。此外，本研究還基于以上數(shù)據(jù)結(jié)果分析了性別特征在偏頭痛中的差異，但如何引起雌雄大鼠在偏頭痛發(fā)生率中的差異還需運(yùn)用代謝組學(xué)方法深入研究。