谷子幾丁質(zhì)酶基因家族鑒定及在白發(fā)病菌脅迫下的表達(dá)分析

韓海麗，王 鶴，董夢迪，馬芳芳， 韓淵懷，韓彥卿*

（1. 山西農(nóng)業(yè)大學(xué) a. 植物保護(hù)學(xué)院；b. 創(chuàng)新創(chuàng)業(yè)學(xué)院；c. 農(nóng)學(xué)院，太谷 030801；2. 雜糧種質(zhì)創(chuàng)新與分子育種山西省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，太原 030031）

幾丁質(zhì)酶是一類與植物病害相關(guān)的蛋白質(zhì)［1-2］，在高等植物生長發(fā)育過程和抗病過程中起著重要的作用［3-5］。Tabei等［3］將水稻的幾丁質(zhì)酶基因?qū)朦S瓜后，轉(zhuǎn)基因黃瓜對(duì)灰霉病的抗性顯著提高。Yamamoto等［4］將水稻的Ⅰ類幾丁質(zhì)酶基因?qū)肫咸阎刑岣吡似咸褜?duì)白粉病的抗性。近年來，幾丁質(zhì)酶基因已經(jīng)被廣泛地轉(zhuǎn)入到不同作物種中，如水稻［5-6］、棉花［7］、大豆［8-9］、花生［10］、煙草［11-12］等，以提高植物的抗病性。關(guān)于植物幾丁質(zhì)酶的研究比較常見，而且在真菌抗病研究中也有相關(guān)報(bào)道［13］。該基因最早是在菜豆中研究的［14］，相關(guān)研究人員將菜豆幾丁質(zhì)酶載入油菜、煙草中，發(fā)現(xiàn)菜豆幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)上升，死苗率下降，發(fā)病率顯著降低［15］。Rohini等［16］將煙草幾丁質(zhì)酶基因?qū)牖ㄉ?，發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶的基因表達(dá)量顯著上升，花生褐斑病的發(fā)病率顯著下降。2002年，Kishimoto等［17］將水稻幾丁質(zhì)酶基因RCC2導(dǎo)入煙草中，發(fā)現(xiàn)其對(duì)灰霉病的抗性顯著提高。王果萍等［18］通過對(duì)西瓜植株進(jìn)行接菌，并對(duì)轉(zhuǎn)基因西瓜進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶基因顯著表達(dá)，且對(duì)西瓜枯萎病的發(fā)生有顯著的抑制作用。劉偉華等［19］通過對(duì)小麥的愈傷組織進(jìn)行接菌，并對(duì)轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)幾丁質(zhì)酶基因成功表達(dá)，與對(duì)照植株相比，幾丁質(zhì)酶活性顯著增強(qiáng)，對(duì)白粉病的發(fā)生起到了很強(qiáng)的抑制作用。

幾丁質(zhì)酶根據(jù)酶活結(jié)構(gòu)域差異分為糖苷水解酶家族 18（glycoside hydroase family 18，GH18）和糖苷水解酶家族 19（glycoside hydroase family 19，GH19）2個(gè)亞家族。GH18在細(xì)菌、真菌、植物、哺乳動(dòng)物、昆蟲和病毒中廣泛存在，而GH19亞家族僅出現(xiàn)在植物和鏈霉菌屬中，且其成員具有幾丁質(zhì)結(jié)合域（chitin-bind domain，CBD）結(jié)構(gòu)，可與幾丁質(zhì)結(jié)合，增強(qiáng)植物體的抵抗能力［20-22］。

谷子是我國北方特色雜糧作物［23］，不僅耐脊薄、耐貯藏、適應(yīng)性強(qiáng)、水分利用率高［24］，而且營養(yǎng)豐富、可糧草兼用［25］，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，也是禾本科作物抗逆基因挖掘的模式植物［26-28］。但隨著谷子品種的單一化種植，谷子白發(fā)病逐漸成為其主要病害之一。該病害的發(fā)生嚴(yán)重影響了谷子的生長發(fā)育，對(duì)谷子產(chǎn)量和品質(zhì)構(gòu)成了極大的威脅［29］。本研究通過谷子響應(yīng)白發(fā)病菌侵染的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析獲得了30 個(gè)幾丁質(zhì)酶基因，并對(duì)谷子抗病相關(guān)幾丁質(zhì)酶家族基因的基本信息、理化性質(zhì)、染色體定位、基因結(jié)構(gòu)、系統(tǒng)發(fā)育樹、蛋白基序等進(jìn)行分析，擬明確幾丁質(zhì)酶基因的基本特征和潛在功能，研究結(jié)果可為幾丁質(zhì)酶基因的深入抗病機(jī)制解析及分子育種提供一定的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 谷子幾丁質(zhì)酶基因染色體定位、基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析

首先從谷子的基因庫中獲得它們的染色體位置信息，接著利用TBtools軟件分析30個(gè)幾丁質(zhì)酶基因的染色體位置［30］，隨后對(duì)其進(jìn)行串聯(lián)重復(fù)分析。判斷串聯(lián)重復(fù)的原則為：1）相鄰基因間的距離小于100 kb ；2）基因間相識(shí)度大于70%［31］。利用MEGA 7.0軟件對(duì)30個(gè)幾丁質(zhì)酶基因的保守基序及保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，得出Motif示意圖，進(jìn)而用TBtools軟件對(duì)其進(jìn)行可視化作圖。

1.2 谷子幾丁質(zhì)酶基因家族結(jié)構(gòu)及系統(tǒng)發(fā)育分析

利用 MEGA 7.0對(duì)30個(gè)幾丁質(zhì)酶基因的蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，進(jìn)而構(gòu)建進(jìn)化樹，校驗(yàn)參數(shù)Bootstrap設(shè)置為1 000，其余參數(shù)為默認(rèn)值。

1.3 谷子幾丁質(zhì)酶基因家族成員蛋白理化性質(zhì)分析及亞細(xì)胞定位

結(jié)合網(wǎng)站phytozome V12.1（https://phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html V12.1），從在線公共網(wǎng)站上下載30個(gè)幾丁質(zhì)酶基因的基本信息，再利用Expasy在線網(wǎng)站（https://www.genscript.com/psort.htm）對(duì)幾丁質(zhì)酶基因家族成員進(jìn)行理化性質(zhì)分析。

1.4 谷子幾丁質(zhì)酶基因表達(dá)模式分析

本課題組前期以抗病品種JG42及感病品種JG21為試驗(yàn)材料，通過RNA的提取及公司測序后，我們獲得了12、24和48 h的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)。經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)，幾丁質(zhì)酶基因在抗感谷子品種中表達(dá)差異顯著。從谷子基因數(shù)據(jù)庫下載30個(gè)幾丁質(zhì)酶基因的數(shù)據(jù)，用TBtools軟件繪制基因表達(dá)熱圖。

1.5 谷子幾丁質(zhì)酶基因在干旱脅迫下的表達(dá)分析

選擇抗旱谷子（AN04）和干旱敏感谷子（豫谷1號(hào)）為材料，以不同光照條件（早：中等光照；中：強(qiáng)光照；晚：弱光照）為試驗(yàn)組，正常未脅迫植株作為對(duì)照組，取其葉片進(jìn)行RNA的提取，送公司進(jìn)行二代測序后，利用TBtools軟件繪制基因表達(dá)熱圖。

1.6 差異表達(dá)基因的實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析

分別對(duì)感病品種JG21及抗病品種JG42 兩葉一心時(shí)期的谷子進(jìn)行孢子囊懸浮液噴灑接菌，接菌后12、24、48 h對(duì)抗感品種的葉片進(jìn)行取樣，提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA后進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）驗(yàn)證基因表達(dá)水平。采用Primer Premier設(shè)計(jì)基因特異引物（表1）。使用TaKaRa實(shí)時(shí)熒光定量試劑盒，以谷子β-Actin（Seita.3G265400.1）為內(nèi)參基因，反應(yīng)體系為10 μL，包括5 μL 2×PCR混合酶、1 μL 上下游引物混合液（10 μmol/L）、1 μL cDNA、3 μL無菌水。PCR程序?yàn)?：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，39個(gè)循環(huán) ；95℃ 1 min ；60℃ 30 s。試驗(yàn)設(shè)3次重復(fù)，計(jì)算谷子幾丁質(zhì)酶基因在白發(fā)病侵染下的相對(duì)表達(dá)量［32］。

表1 本試驗(yàn)所用PCR擴(kuò)增引物Tab. 1 Primers used in this study

2 結(jié)果與分析

2.1 谷子幾丁質(zhì)酶基因家族的基因定位分析

通過染色體定位分析發(fā)現(xiàn)，谷子的30個(gè)幾丁質(zhì)酶基因定位在除6號(hào)染色體外的其余8條染色體上（圖1）。其中，7號(hào)染色體上定位到的基因最多，為8個(gè)，其次是5號(hào)染色體，共定位到6個(gè)基因。1號(hào)染色體和3號(hào)染色體上的幾丁質(zhì)酶基因最少，僅1個(gè)。2號(hào)、4號(hào)、8號(hào)和9號(hào)染色體上定位到的基因分別有4、2、3和4個(gè)，而其中Seita.J0579300定位在尚未組裝完整的scaffold上。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，在5號(hào)、7號(hào)、8號(hào)、9號(hào)染色體上，10個(gè)串聯(lián)重復(fù)涉及到14個(gè)基因（紅色矩形方框表示），如Seita.9G263100和Seita.9G263200屬于一個(gè)串聯(lián)重復(fù)，可推測所有形成的幾丁質(zhì)酶基因串聯(lián)重復(fù)屬于同一亞家族。

圖1 谷子幾丁質(zhì)酶基因的染色體定位Fig. 1 Chromosome mapping of chitinase genes in foxtail millet

2.2 谷子幾丁質(zhì)酶系統(tǒng)進(jìn)化分析

為明確幾丁質(zhì)酶蛋白基因的進(jìn)化關(guān)系，本文利用MEGA 7.0軟件對(duì)查找到的30個(gè)幾丁質(zhì)酶基因構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。根據(jù)幾丁質(zhì)酶基因的功能可將其分為3大亞類（圖2）。第一大亞類含有2 個(gè)基因，第二大亞類含有11個(gè)基因，第三大亞類含有15個(gè)基因。第一大亞類具有相同的結(jié)構(gòu)域，其2個(gè)基因都含有GRAS結(jié)構(gòu)域，為赤霉素信號(hào)傳導(dǎo)的主要參與者，修飾或者結(jié)合小分子物質(zhì)，能夠參與調(diào)節(jié)植物生長發(fā)育的各個(gè)方面；第二大類的11個(gè)基因主要為GH18，具有GH18的保守結(jié)構(gòu)域；第三大亞類的15個(gè)基因?yàn)镚H19，GH19家族幾丁質(zhì)酶主要存在于植物中，作為真菌細(xì)胞壁的主要成分參與植物抗逆等過程［33］。

圖2 谷子幾丁質(zhì)酶基因系統(tǒng)進(jìn)化樹Fig. 2 Phylogenetic tree of the chitinase gene family of foxtail millet

2.3 谷子幾丁質(zhì)酶基因蛋白理化性質(zhì)分析

通過理化性質(zhì)分析發(fā)現(xiàn)，該基因家族的氨基酸等電點(diǎn)（pI）為4.28（Seita.5G275500）～9.86（Seita.4G286000），相對(duì)分子質(zhì)量為24 369.27（Seita.J0579300）～64 469.26 kD（Seita.2G343700）。蛋白質(zhì)的不穩(wěn)定指數(shù)（instability index，II）為19.17（Seita.7G150200）～50.91（Seita.2G298100），其中有12個(gè)幾丁質(zhì)酶基因不穩(wěn)定指數(shù)大于40，屬于不穩(wěn)定蛋白。脂肪系數(shù)（aliphatic index）為53.80（Seita.4G286000）～84.49（Seita.5G229700），平均為72.71，說明它們的熱穩(wěn)定性較為一致。依據(jù)平均疏水指數(shù)介于-0.5～0.5的為兩性蛋白的原則，這些幾丁質(zhì)酶基因都為兩性蛋白，其中Seita.2G298100最大（0.250），Seita.2G343700最小（-0.482）（表2）。

表2 谷子幾丁質(zhì)酶蛋白基本理化性質(zhì)Tab. 2 Basic physicochemical properties of chitinase in foxtail millet

2.4 谷子幾丁質(zhì)酶蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測和亞細(xì)胞定位

對(duì)30個(gè)谷子幾丁質(zhì)酶蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測，發(fā)現(xiàn)該家族含有α-螺旋、延伸鏈、β-折疊和無規(guī)則卷曲。其中，延伸鏈占7%～19%，β-折疊在8% 左右，無規(guī)則卷曲和α-螺旋占二級(jí)結(jié)構(gòu)總量的20%～40%。亞細(xì)胞定位預(yù)測表明，谷子幾丁質(zhì)酶基因全部定位在細(xì)胞外（extracelluar），屬于分泌蛋白（表3），其所有基因表達(dá)蛋白質(zhì)均在細(xì)胞外發(fā)揮作用。

表3 谷子幾丁質(zhì)酶蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測和亞細(xì)胞定位Tab. 3 Secondary structure prediction and subcellular localization of chitinase foxtail millet

2.5 谷子幾丁質(zhì)酶基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析

對(duì)30個(gè)幾丁質(zhì)酶基因家族基因結(jié)構(gòu)分析和蛋白基序分析發(fā)現(xiàn)：它們含有10類蛋白基序（Motif 1～Motif 10），長度分別在15～50 個(gè)氨基酸之間（表4），其中，Seita.5G229700沒有鑒定到保守的Motif結(jié)構(gòu)，Seita.2G369400只含有Motif 10 ；Motif 1、Motif 3 和 Motif 4 在 14 個(gè)蛋白中均被鑒定到 ；含有Motif 9 的蛋白最多，共19個(gè)，這19個(gè)蛋白被聚類在一起，說明這些蛋白可能發(fā)揮類似的功能。其次是Motif 2，在18個(gè)蛋白中被鑒定到。此外，Motif 8在11個(gè)蛋白中被鑒定到；Motif 7在9個(gè)蛋白中被鑒定到，且它們聚集在一起，推測具有相似的功能。Motif 5 和 Motif 6 分別在 7 個(gè)和 5 個(gè)蛋白中被鑒定到（圖3）。基因結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn)，30個(gè)幾丁質(zhì)酶基因都含有上下游調(diào)控區(qū)（UTR），所有成員均包含外顯子、內(nèi)含子，但在具體的數(shù)量和位置上存在差異（圖3）。

圖3 谷子幾丁質(zhì)酶基因結(jié)構(gòu)和保守結(jié)構(gòu)域分析Fig. 3 Chitinase gene structure and conserved domain in foxtail millet

表4 谷子幾丁質(zhì)酶基因家族成員10個(gè)蛋白基序分析Tab. 4 Protein motif analysis of ten members of chitinase gene family in foxtail millet

2.6 谷子幾丁質(zhì)酶基因參與谷子逆境脅迫響應(yīng)

對(duì)抗旱和干旱敏感兩個(gè)谷子品種的轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，由圖4 可知，多數(shù)幾丁質(zhì)酶基因在抗旱和敏感谷子品種中未見顯著表達(dá)差異。 其中，5個(gè)幾丁質(zhì)酶在抗旱和敏感谷子品種中基因表達(dá)在不同時(shí)期存在差異。Seita.7G150200在干旱敏感品種，中等光照（早）中上調(diào)表達(dá)，而在強(qiáng)光照（午）、弱光照（晚）下調(diào)表達(dá)或幾乎不表達(dá)；Seita.7G150400和Seita.7G150500及Seita.7G150700有著相同的表達(dá)模式，在抗旱品種，中等光照（早）中上調(diào)表達(dá)，強(qiáng)光照（午）下調(diào)表達(dá)；Seita.5G390000和Seita.7G065100有著相同的表達(dá)模式，在干旱敏感品種弱光照（晚）中上調(diào)表達(dá)，而在中等光照（早）、強(qiáng)光照（午）中不表達(dá)或下調(diào)表達(dá)。這說明部分幾丁質(zhì)酶的基因表達(dá)受到光照和品種的影響，在抗旱和干旱敏感的表達(dá)存在明顯差異（圖4）。

圖4 谷子幾丁質(zhì)酶基因在干旱脅迫下的表達(dá)分析Fig. 4 Relative expression patterns of chitinase genes under drought stress in foxtail millet

2.7 谷子幾丁質(zhì)酶基因響應(yīng)白發(fā)病菌侵染的表達(dá)分析

為明確谷子幾丁質(zhì)酶應(yīng)對(duì)白發(fā)病菌侵染的響應(yīng)，我們分析了抗感谷子在接種白發(fā)菌12、24和48 h后的基因表達(dá)模式。由熱圖可以看出：在抗病品種中，除Seita.2G369400在12 h表達(dá)明顯下調(diào)外，其他幾丁質(zhì)酶基因大部分在抗病品種中12、24和48 h這3個(gè)時(shí)間段中均上調(diào)表達(dá)；在感病品種中，除了Seita.9G263100、Seita.8G117200和Seita.7G150400這3個(gè)基因在12 h表達(dá)上調(diào)外，其余大部分幾丁質(zhì)酶基因在感病品種中3個(gè)時(shí)間段均表現(xiàn)為下調(diào)表達(dá)（圖5）。由此可推測，這些幾丁質(zhì)酶基因在響應(yīng)白發(fā)病菌侵染過程中發(fā)揮了重要的抗病調(diào)控作用。

圖5 谷子幾丁質(zhì)酶基因在抗感品種中3個(gè)時(shí)間段的表達(dá)分析Fig. 5 Expression analysis of chitinase gene in foxtail millet during three time periods in resistant cultivars

2.8 谷子幾丁質(zhì)酶基因參與抗病響應(yīng)的表達(dá)驗(yàn)證

為進(jìn)一步驗(yàn)證幾丁質(zhì)酶基因參與谷子抗白發(fā)病響應(yīng)的表達(dá)差異，本文選擇Seita.1G225300、Seita.4G286000、Seita.5G389900、Seita.7G150600、Seita.7G150700和Seita.8G076900共6個(gè)基因進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量表達(dá)分析。通過驗(yàn)證可知：Seita.1G225300在抗病品種中12、24和48 h 3個(gè)時(shí)間段均上調(diào)表達(dá)，而在感病品種中12 h時(shí)基因不表達(dá)；Seita.4G286000基因在抗病品種中48 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高，而在感病品種中在這3個(gè)時(shí)間段內(nèi)均呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢；Seita.5G389900在抗病品種中3個(gè)時(shí)間段表達(dá)量上調(diào)，而在感病品種中表達(dá)量下調(diào)；Seita.7G150600在3個(gè)時(shí)間段內(nèi)表達(dá)量明顯上調(diào)，而在感病品種中表達(dá)量較抗病品種均下調(diào)；Seita.8G076900基因在感病品種中48 h時(shí)顯著下調(diào)。

圖6 谷子幾丁質(zhì)酶基因在白發(fā)病侵染后脅迫下的表達(dá)分析Fig. 6 Relative expression patterns of chitinase genes under adversity stress in foxtail millet

3 討論

幾丁質(zhì)酶基因已在水稻［34］上被證明可參與調(diào)控植物的生長發(fā)育、抗逆性等過程。本研究對(duì)谷子中的幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行結(jié)構(gòu)以及氨基酸保守結(jié)構(gòu)域分析，發(fā)現(xiàn)其基因結(jié)構(gòu)上表現(xiàn)出了一定的變異性，這與水稻和高粱中的結(jié)果相似［35］。對(duì)30個(gè)幾丁質(zhì)酶基因進(jìn)行染色體定位分析發(fā)現(xiàn)，分布在同一條染色體上的幾丁質(zhì)酶基因具有相似的保守結(jié)構(gòu)域。定位在第7條染色體上的幾個(gè)基因具有相似的Motif及相似的UTR及CDS區(qū)域。根據(jù)相似的結(jié)構(gòu)域推測其具有相似的功能（圖3）。保守結(jié)構(gòu)域分析顯示，幾丁質(zhì)酶基因家族具有相同或相似的結(jié)構(gòu)域，證明了幾丁質(zhì)酶基因在進(jìn)化過程中存在一定的保守性。

植物幾丁質(zhì)酶基因的表達(dá)形式可以分為兩種：組成型表達(dá)和誘導(dǎo)型表達(dá)。植物幾丁質(zhì)酶廣泛分布于植物的根、莖、葉、花及胚等部位。在外源因子的刺激下，植物體內(nèi)的幾丁質(zhì)酶大幅上調(diào)表達(dá)。本研究根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹及染色體定位分析發(fā)現(xiàn)，同一條染色體上的基因在系統(tǒng)發(fā)育樹的分類相同，且有相似的保守結(jié)構(gòu)域，結(jié)合熱圖分析可知，它們在抗病或抗旱過程中具有相似的調(diào)控方式（圖3～5）。幾丁質(zhì)酶基因家族在植物抗病過程中發(fā)揮了重要作用［35］。在甘藍(lán)型油菜黑脛病和菌核病過程中，一些幾丁質(zhì)酶基因家族成員被特異地誘導(dǎo)表達(dá)［36］。另外，荔枝的果皮幾丁質(zhì)酶參與霜疫霉菌的抗病過程［37］。而本研究發(fā)現(xiàn)，Seita.7G150700和Seita.8G076900兩個(gè)基因共同參與抗旱和抗病過程。在這兩個(gè)過程中，抗病品種表達(dá)上調(diào)，而在感病過程中表達(dá)下調(diào)，且與轉(zhuǎn)錄組的結(jié)果一致，說明這兩個(gè)基因可能同時(shí)參與抗病和抗旱的過程。

本研究通過對(duì)其染色體定位、理化性質(zhì)、基因結(jié)構(gòu)與保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行分析，明確谷子幾丁質(zhì)酶基因在抗感品種中的表達(dá)模式。其研究結(jié)果可為后期研究相關(guān)幾丁質(zhì)酶基因?qū)茸拥目共⌒蕴峁┮欢ǖ睦碚摶A(chǔ)，為谷子分子育種發(fā)掘潛在的基因資源。