優(yōu)化前體供給與細(xì)胞膜通透性強化大腸桿菌合成麥角硫因

陳佳敏， 王 陽， 堵國成， 康 振*1，

（1.江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無錫 214122；2.江南大學(xué) 糖化學(xué)與生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫 214122；3.江南大學(xué) 未來食品科學(xué)中心，江蘇 無錫 214122）

麥角硫因（Ergothioneine，ERG）是組氨酸衍生的硫醇化合物，由于其較高的氧化還原電位，麥角硫因相比其他巰基化合物如谷胱甘肽（Glutathione，GSH）具有更高的熱穩(wěn)定性、pH穩(wěn)定性和極高的水溶性，在水溶液中通常以硫酮的形式存在[1-2]。此外麥角硫因是一種天然強抗氧化劑，具有獨特的生物學(xué)功能和藥理活性，包括清除自由基[3]、抗氧化[4]、緩解炎癥和多種疾病[5]、防止輻射損傷[6-8]、細(xì)胞生理保護[9]等，在醫(yī)藥、化妝品和功能食品等領(lǐng)域展現(xiàn)出廣闊的應(yīng)用前景。

目前麥角硫因的制備方法有提取法、化學(xué)合成法和微生物發(fā)酵法。提取法主要從食用菌的子實體、麥角和谷物等原料中獲取，原料消耗大，目標(biāo)產(chǎn)物含率低且雜質(zhì)多，產(chǎn)出比低，限制了麥角硫因的產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用[10]；化學(xué)合成法不僅原料昂貴、合成步驟多、處理難度大[11]，而且副產(chǎn)物對環(huán)境的污染嚴(yán)重，產(chǎn)品的安全性難以保證，影響了麥角硫因的規(guī)模化生產(chǎn)；然而，重組微生物生產(chǎn)麥角硫因具有綠色安全、發(fā)酵周期短、產(chǎn)率高、成本低等優(yōu)點，并且通過代謝調(diào)控、發(fā)酵優(yōu)化等手段可以有效提高麥角硫因的生產(chǎn)效率，是工業(yè)化生產(chǎn)麥角硫因的最優(yōu)選擇。

目前已知麥角硫因可由分枝桿菌[12-13]、甲基桿菌[14]、絲狀真菌和藍細(xì)菌[15]等少數(shù)微生物合成[16]，但由于產(chǎn)量低較難達到工業(yè)化生產(chǎn)的要求。在分枝桿菌中麥角硫因的合成路線需要5種酶的協(xié)同順序催化，首先組氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶EgtD將S-腺苷甲硫氨酸（S-Adenosyl-L-Methionine Disulfate Tosylate，SAM）的3個甲基轉(zhuǎn)移至組氨酸（Histidine，His）生成組氨酸甜菜堿（Hercynine，HER），γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶EgtA或GshA催化半胱氨酸（Cysteine，Cys）與谷氨酸（Glutamic acid，Glu）發(fā)生縮合反應(yīng)，生成γ-谷氨酰半胱氨酸 （γ-glutamycyeteine，γ-GC），在γ-谷氨酰乙酰半胱氨酸硫-氧化物合酶EgtB的催化作用下，與HER間形成C—S鍵，生成中間體海西烯基-γ-谷氨酰半胱氨酸亞砜（Hercynyl-γ-glutamycyeteine sulfoxide，γ-GCHER），再由γ-谷氨酰巰基半胱氨酸硫氧化物水解酶EgtC水解除去Glu部分，最后由硫氧化物裂解酶EgtE斷開庚基半胱氨酸亞砜（Hercynylcyeteine sulfoxide，Cys-HER）的C—S鍵，切割掉半胱氨酸殘基，形成終產(chǎn)物麥角硫因。

重組微生物發(fā)酵生產(chǎn)是提高麥角硫因生產(chǎn)效率的重要策略[17]，目前已在大腸桿菌、釀酒酵母、米曲霉[18]等微生物中得到了驗證。有研究者在釀酒酵母中整合了粗糙脈孢菌來源的麥角硫因合成酶NcEgt1和麥角菌來源的麥角硫因合成酶CpEgt2，在1 L反應(yīng)器中分批補料發(fā)酵84 h后麥角硫因產(chǎn)量達到598 mg/L[19]；在此基礎(chǔ)上，進一步利用有毒的組氨酸類似物篩選TRA抗性菌株，基因組整合單拷貝的MET14并敲除SPE2基因，1 L反應(yīng)器分批補料發(fā)酵160 h后，產(chǎn)量提高到了2.39 g/L[20]。Osawa等在大腸桿菌異源表達了恥垢分枝桿菌中麥角硫因的合成基因簇egtBDCE，通過直接添加硫代硫酸鹽解除底物供應(yīng)限制，麥角硫因產(chǎn)量達到24 mg/L[21]；Tanaka等[22]在此基礎(chǔ)上通過重組大腸桿菌過表達egtA，敲除編碼Met代謝轉(zhuǎn)錄抑制因子metJ，并增強半胱氨酸與S-腺苷甲硫氨酸的生物合成提高代謝通量，分批補料發(fā)酵216 h后麥角硫因產(chǎn)量進一步增加到了1.31 g/L。Chen等[23]在大腸桿菌中共表達里氏木霉來源的麥角硫因合成基因tregt1和tregt2，通過2 L罐分批補料發(fā)酵，培養(yǎng)143 h后麥角硫因產(chǎn)量達到4.34 g/L，是目前國內(nèi)外報道的最高水平。

本研究團隊前期在Escherichia coli BL21（DE3）中異源成功表達了恥垢分枝桿菌來源的egtBDCE合成基因簇與粟酒裂殖酵母來源的麥角硫因合成酶Egt1，同時強化表達了GshA的同工酶EgtA與前體氨基酸代謝途徑中的關(guān)鍵酶，包括天冬氨酸激酶ThrA和磷酸甘油酸脫氫酶SerA；利用3 L罐分批補料發(fā)酵，培養(yǎng)108 h時麥角硫因的產(chǎn)量達到710 mg/L[24]。在此基礎(chǔ)上，通過優(yōu)化前體供應(yīng)進一步提高發(fā)酵強化工程菌生產(chǎn)麥角硫因的效率。

為了使菌體具有更高的代謝活力，增強麥角硫因的生產(chǎn)效率，作者以E1-A1-thrA-serAc.g*菌株[24]為出發(fā)菌株，首先通過外源添加組氨酸強化前體供應(yīng)，接著為了平衡代謝合成通路，對工程菌發(fā)酵的胞內(nèi)外氨基酸濃度進行了分析，采取三因素五水平正交試驗策略，組合添加半胱氨酸、檸檬酸鐵胺和維生素B6對培養(yǎng)基組分進行優(yōu)化，增強酶催化性能；進一步添加甲基供體甲硫氨酸與甜菜堿強化麥角硫因的合成；最后加入CaCl2增強大腸桿菌細(xì)胞膜的通透性、促進物質(zhì)運輸、提高麥角硫因的產(chǎn)量，見圖1。在全部優(yōu)化的基礎(chǔ)上，通過3 L發(fā)酵罐分批補料發(fā)酵放大優(yōu)化結(jié)果，培養(yǎng)108 h最終麥角硫因的發(fā)酵水平為2.01 g/L，生產(chǎn)強度為18.61 mg/（L·h），實現(xiàn)了麥角硫因短周期的高效生產(chǎn)，為麥角硫因的規(guī)?；I(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

圖1 麥角硫因的合成示意Fig.1 Biosynthesis diagram of ergothioneine

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌株Escherichia coli E1-A1-thrA-serAc.g*為作者所在實驗室保藏菌株[24]。

1.1.2 試劑麥角硫因標(biāo)準(zhǔn)樣品：購于上海麥克林生化科技有限公司；蛋白胨、酵母粉：購于美國OXOID公司；各類氨基酸標(biāo)準(zhǔn)品、異丙基-β-D-硫代半乳糖苷（Isopropyl β-D-Thiogalactoside，IPTG）、硫 酸 卡 那 霉 素 （Kanamycin，Kana）、 鏈 霉 素（Streptomycin，Str）：購于上海生工生物工程公司；其余試劑均為國產(chǎn)分析純試劑。

1.1.3 培養(yǎng)基

1）LB培養(yǎng)基：蛋白胨10 g/L，酵母提取物5 g/L，氯化鈉10 g/L，蒸餾水1 L；固體培養(yǎng)基另添加瓊脂粉1.5 g/dL。

2）微量元素：六水合氯化鐵2.4 g/L，六水合氯化鈷0.8 g/L，二水合氯化銅0.15 g/L，氯化鋅0.3 g/L，二水合鉬酸鈉0.3 g/L，硼酸0.075 g/L，硫酸錳1.2 g/L，二水合氯化鈣10 g/L；120 mmol/L鹽酸1 L，過濾除菌。

3）發(fā)酵培養(yǎng)基：葡萄糖20 g/L，酵母提取物6 g/L，蛋白胨4 g/L，檸檬酸2 g/L，硫酸銨6 g/L，十二水合磷酸氫二鈉25 g/L，磷酸二氫鉀4 g/L，七水硫酸鎂1 g/L，維生素H 1×10-4g/L，微量元素1 mL，蒸餾水1 L；pH 6.8~7.0。

4）補料培養(yǎng)基：葡萄糖500 g/L，酵母提取物6 g/L，蛋白胨4 g/L，蒸餾水1 L。

所有配制的培養(yǎng)基中均要加入50 mg/L的硫酸卡那霉素和鏈霉素對菌株進行發(fā)酵培養(yǎng)。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent1260高效液相色譜儀：美國安捷倫公司產(chǎn)品；UV2450紫外分光光度計：日本Shimadzu公司產(chǎn)品；蒸汽滅菌器：致微（廈門）公司產(chǎn)品；臺式振蕩培養(yǎng)箱ZQTY-70：上海知楚儀器有限公司產(chǎn)品；葡萄糖-乳酸生物傳感分析儀：深圳西爾曼科技有限公司產(chǎn)品；Avanti J-26XP低溫高速冷凍離心機：美國Beckman公司產(chǎn)品；VCX750型超聲破碎儀：美國Sonics公司產(chǎn)品；3 L全自動發(fā)酵罐：迪必爾上海生物工程有限公司產(chǎn)品。

1.3 實驗方法

1.3.1 搖瓶發(fā)酵種子液的制備：挑取活化平板上的單菌落接種于5 mL液體LB中，置于37℃、220 r/min彈簧搖床中過夜培養(yǎng)8~10 h。

搖瓶發(fā)酵：種子液接種體積分?jǐn)?shù)為2%，250 mL搖瓶裝液量為25 mL，置于37℃、220 r/min條件下培養(yǎng)至菌體OD600為0.8~1.0，此時添加濃度為0.2 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)，并提前將搖瓶培養(yǎng)溫度降低至25℃進行低溫誘導(dǎo)表達108 h。

1.3.2 發(fā)酵罐發(fā)酵

1）一級種子液的制備 同1.3.1種子液的制備。

2）二級種子液的制備 一級種子液轉(zhuǎn)接體積分?jǐn)?shù)為1%，500 mL搖瓶裝液量為50 mL，置于37℃、220 r/min條件下培養(yǎng)8~9 h。

3）發(fā)酵罐發(fā)酵 使用3 L發(fā)酵罐進行分批補料發(fā)酵，二級種子液轉(zhuǎn)接體積分?jǐn)?shù)為20%，3 L發(fā)酵罐裝液量為1.5 L。發(fā)酵初始培養(yǎng)溫度為37℃，當(dāng)菌體生長至OD600為20左右時，提前將溫度降低至25℃，并添加濃度為0.2 mmol/L的IPTG誘導(dǎo)。用體積分?jǐn)?shù)50%的氨水自動調(diào)控pH在6.8左右，通過控制攪拌槳轉(zhuǎn)速及通氣量來控制溶氧在35%左右。當(dāng)發(fā)酵培養(yǎng)基中的初始葡萄糖消耗完畢之后，開始補料流加以維持發(fā)酵液中的葡萄糖質(zhì)量濃度在5~10 g/L最佳。發(fā)酵過程中定期取樣測量相關(guān)參數(shù)，記錄備用。

1.3.3 發(fā)酵樣品處理發(fā)酵結(jié)束后，將發(fā)酵液于10 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心10 min，上清液稀釋適當(dāng)倍數(shù)后經(jīng)0.22 μm水系濾膜過濾，保留于液相瓶中待測；菌體沉淀首先用pH 7.4的20 mmol/L Tris-HCl緩沖液洗滌并重懸恢復(fù)至原體積，隨后放置在冰上低溫超聲破碎（功率300 W，工作4 s，間歇6 s，10 min），對細(xì)胞裂解液離心取上清液過膜，保留于液相瓶中待測。

1.3.4 麥角硫因定量測定高效液相色譜法（High Performance Liquid Chromatography，HPLC）測定麥角硫因質(zhì)量濃度。使用Agilent 1200高效液相檢測系統(tǒng)，C18柱（Thermo Scientific Hypersil GOLD AQ，250 mm×4.6 mm，5 μm），UV檢測器，檢測波長為257 nm，體積分?jǐn)?shù)1%甲醇為流動相，純甲醇為有機相，進樣流量為0.7 mL/min，進樣體積為5 μL，單樣分析時長為20 min，全程控制柱溫保持30℃。

麥角硫因的標(biāo)準(zhǔn)曲線：分別配置質(zhì)量濃度為5、25、50、100、200 mg/L的麥角硫因標(biāo)準(zhǔn)樣品。根據(jù)HPLC法分別測定各個質(zhì)量濃度下對應(yīng)的峰面積，以麥角硫因標(biāo)準(zhǔn)樣品的質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.3.5 其他參數(shù)測定

1）菌體生長情況 定期取樣，稀釋適當(dāng)倍數(shù)后使用紫外分光光度計測定OD600的值。

2）葡萄糖質(zhì)量濃度 定期取樣，10 000 r/min轉(zhuǎn)速下離心2 min，取上清液并稀釋適當(dāng)倍數(shù)，使用葡萄糖-乳酸生物傳感分析儀測定發(fā)酵液中各個階段剩余的葡萄糖質(zhì)量濃度。

本實驗中，所有樣品相關(guān)參數(shù)的測定均進行3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 添加關(guān)鍵前體組氨酸促進麥角硫因的合成

麥角硫因?qū)儆诖紊x產(chǎn)物，一般涉及的合成路徑與代謝途徑較為復(fù)雜，因此一些前體氨基酸、維生素和輔因子等通常是此類代謝物生物合成的營養(yǎng)因子與調(diào)節(jié)因子[25]。麥角硫因合成過程中涉及3個前體氨基酸，分別為組氨酸提供骨架、半胱氨酸提供巰基和甲硫氨酸（Methionine，Met）提供甲基。

向培養(yǎng)基中直接添加氨基酸前體是提高前體供應(yīng)最直接的策略。為探究初始狀態(tài)下麥角硫因合成的主要前體限制，分別向發(fā)酵初始培養(yǎng)基中外源加入0.1 g/L的組氨酸、半胱氨酸和甲硫氨酸，結(jié)果見圖2（a）。添加組氨酸顯著提高了麥角硫因的產(chǎn)量，而添加其他2種氨基酸產(chǎn)量并沒有明顯提高，說明組氨酸的缺乏是限制麥角硫因的合成效率的最主要因素。進一步探究組氨酸的梯度添加情況下麥角硫因的產(chǎn)量變化及菌體生長情況，見圖2（b）。當(dāng)外源添加0.1 g/L組氨酸時，麥角硫因在搖瓶水平上的發(fā)酵質(zhì)量濃度最高，達到（175.81±1.19）mg/L，相比初始麥角硫因工程菌產(chǎn)量（143.82±1.18）mg/L提高了22.3%。由于組氨酸是麥角硫因結(jié)構(gòu)的基本骨架，其咪唑環(huán)和側(cè)鏈來源也是合成麥角硫因的直接前體，因此組氨酸的充足供應(yīng)是麥角硫因高效合成的基本保證。

圖2 不同氨基酸添加量對麥角硫因發(fā)酵的影響Fig.2 Effects of differrent additions of amino acids on ergothioneine fermentation

為了初步驗證麥角硫因工程菌株的生產(chǎn)能力，根據(jù)外源添加前體氨基酸的最優(yōu)結(jié)果，向發(fā)酵培養(yǎng)基中添加0.1 g/L組氨酸，初步采取3 L發(fā)酵罐發(fā)酵策略進行分批補料發(fā)酵，實現(xiàn)發(fā)酵放大，結(jié)果見圖3。菌體在0~18 h生長迅速，培養(yǎng)36 h時OD600的值超過了60，36 h后OD600趨于穩(wěn)定；葡萄糖消耗速率自36 h開始逐漸下降，48 h后保持穩(wěn)定，整個發(fā)酵過程共消耗136 g/L葡萄糖；麥角硫因在前48 h積累迅速，后期產(chǎn)量變化增幅較小，發(fā)酵108 h時麥角硫因的發(fā)酵水平達到了1.25 g/L，有效提高了麥角硫因的生產(chǎn)效率。

圖3 分批補料發(fā)酵過程曲線圖Fig.3 Time courses of ergothioneine production under fed-batch fermentation

2.2 胞內(nèi)外氨基酸質(zhì)量濃度的定量化分析

對分批補料發(fā)酵合成麥角硫因過程中各個時間點胞內(nèi)外相關(guān)重要氨基酸質(zhì)量濃度的變化情況進行了分析，進一步探究氨基酸前體限制，從而針對性地提高麥角硫因的產(chǎn)量，結(jié)果見圖4。甲硫氨酸作為麥角硫因合成過程中的甲基供體，整個發(fā)酵過程中胞內(nèi)外的質(zhì)量濃度較為平衡，始終保持0.1 g/L左右的水平。同時，半胱氨酸的胞外和胞內(nèi)質(zhì)量濃度都很低，胞外半胱氨酸隨著發(fā)酵時間的推移逐漸呈上升趨勢，而胞內(nèi)半胱氨酸大體呈下降趨勢，都在0.002 g/L左右浮動，存在嚴(yán)重缺乏，表明除了前體組氨酸外，前體半胱氨酸是目前限制麥角硫因生產(chǎn)的另一關(guān)鍵氨基酸。

圖4 胞內(nèi)外氨基酸分析圖Fig.4 Analysis of intracellular and extracellular amino acids

2.3 正交試驗優(yōu)化組分添加提高麥角硫因的產(chǎn)量

檸檬酸鐵胺（Ammonium Ferric Citrate，AFC）是一種有機化合物，其有助于蛋白質(zhì)表達，并可適用于微生物培養(yǎng)[26]。麥角硫因合成途徑中間步驟的關(guān)鍵酶EgtB是一種單核非血紅素鐵酶，其活性需要特定的輔因子即Fe2+的存在[27]。由于發(fā)酵培養(yǎng)基中包含檸檬酸和硫酸銨，為避免引入其他有機離子，采取向培養(yǎng)基中添加檸檬酸鐵胺以提高酶的催化活性，促進γ-GC最大程度向γ-GC-HER的轉(zhuǎn)化。維生素B6（Vitamin B6，VB6），又稱吡哆素，是一種水溶性維生素，維生素常以輔酶形式參與酶的催化，能幫助和促進微生物體內(nèi)氨基酸的合成。麥角硫因合成過程中的EgtE為5-磷酸吡哆醛（Pyridoxal-5'-phosphate，PLP）依賴性β-裂解酶，而PLP又是維生素B6的代謝活性形式，主要負(fù)責(zé)參與氨基酸代謝中的大量生物轉(zhuǎn)化。為了增強EgtE酶的催化活性，促進終產(chǎn)物麥角硫因的不斷產(chǎn)生，考慮向培養(yǎng)基中另外添加維生素B6。

通過以上分析，采取正交組合添加半胱氨酸、檸檬酸鐵胺與維生素B6的策略，促進代謝流向增強麥角硫因合成的方向進行，提高麥角硫因產(chǎn)量。

以麥角硫因的產(chǎn)量作為考察指標(biāo)，在培養(yǎng)基添加0.1 g/L組氨酸的基礎(chǔ)上，采用正交設(shè)計助手LATIN 3.1按照L25（56）展開三因素五水平正交試驗并進行分析，考察對麥角硫因最終合成的影響，因素水平見表1。

表1 正交試驗設(shè)計因素及水平Table 1 Factors and levels of orthogonal experimental design

麥角硫因發(fā)酵正交試驗數(shù)據(jù)見表2。由極差分析可知，各因素影響的主次順序為Cys＞AFC＞VB6（A＞B＞C）；由方差分析結(jié)果所示，半胱氨酸影響最為顯著，AFC和VB6對麥角硫因產(chǎn)量的影響較小。在25個組合中，最優(yōu)組合為序列號2，即添加0.01 g/L Cys、0.01 g/L AFC、0.01 g/L VB6，產(chǎn) 量 達 到178.56 mg/L，對正交試驗的篩選結(jié)果進行重復(fù)驗證，重復(fù)3次，最終麥角硫因平均的發(fā)酵質(zhì)量濃度為（182.61±3.92）mg/L，重復(fù)驗證結(jié)果與正交試驗結(jié)果一致。

表2 正交試驗結(jié)果Table 2 Results of orthogonal test

續(xù)表2

表3 正交試驗方差分析Table 3 Variance analysis of orthogonal test

2.4 補充甲基供體甲硫氨酸與甜菜堿強化麥角硫因的合成

在已補充前體組氨酸和前體半胱氨酸的基礎(chǔ)上，進一步向培養(yǎng)基中補充甲基供體以增強麥角硫因的生成，在培養(yǎng)基基礎(chǔ)上分別直接加入0.1、0.3、0.6、0.9、1.5 g/L的甲硫氨酸，由圖5（a）發(fā)現(xiàn)，添加1.5 g/L甲硫氨酸時，搖瓶發(fā)酵質(zhì)量濃度達到（190.46±0.89）mg/L，提高了4.3%。

甜菜堿（Betaine）是一種季銨堿類物質(zhì)，1分子甜菜堿包括3個非穩(wěn)態(tài)甲基，是有效且高效的甲基供體，且麥角硫因的分子中包含有甜菜堿的結(jié)構(gòu)[25]，因此，甜菜堿具有替代甲硫氨酸提供甲基的功能。在培養(yǎng)基基礎(chǔ)上平行添加相同質(zhì)量濃度梯度的甜菜堿，從圖5（b）可知，當(dāng)添加0.6 g/L甜菜堿時，發(fā)酵質(zhì)量濃度達到（191.26±2.10）mg/L，提高了4.7%。在此基礎(chǔ)上，組合添加1.5 g/L甲硫氨酸與0.6 g/L甜菜堿，最終搖瓶發(fā)酵質(zhì)量濃度為（199.33±4.96）mg/L，相比未添加甲基供體提高了11.9%，相比初始產(chǎn)量提高了38.6%，見圖5（c）。說明甲基供體的補充是非常重要的，前體的充足供應(yīng)有益于麥角硫因的生產(chǎn)。

圖5 甲基供體添加對麥角硫因發(fā)酵的影響Fig.5 Effects of additions of methyl donor on ergothioneine fermentation

2.5 增加細(xì)胞膜通透性提高麥角硫因的產(chǎn)量

據(jù)報道，許多表面活性劑已用于氨基酸類物質(zhì)的生產(chǎn)，江潔等[28]通過添加0.3%曲拉通X-100可以改善釀酒酵母中谷胱甘肽的胞外分泌；張媛媛等[29]添加0.1 g/L十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）后大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)L-鳥氨酸提高了1.25倍。表面活性劑的適量添加能夠提高大腸桿菌細(xì)胞外膜的滲透性，促進胞內(nèi)外物質(zhì)的傳遞運輸，加強細(xì)胞與外界物質(zhì)的交換，最終達到增強麥角硫因胞外分泌的目的，提高麥角硫因產(chǎn)量。在搖瓶發(fā)酵誘導(dǎo)后，向已優(yōu)化的發(fā)酵培養(yǎng)基中繼續(xù)補充添加0.2 g/dL的十二烷基磺酸鈉（SDS）、吐溫80（Tween-80）、曲拉通X-100、甘氨酸（Glycine）和CaCl2，考察以上能夠增強細(xì)胞膜通透性的物質(zhì)對麥角硫因合成及菌體生長的影響，見圖6。添加CaCl2整體效果較好，其對菌體的生長情況影響較小，最終搖瓶發(fā)酵質(zhì)量濃度達到（243.06±7.85）mg/L，提高了21.9%，相比初始產(chǎn)量提高了69.0%。

圖6 改善細(xì)胞膜通透性對麥角硫因發(fā)酵的影響Fig.6 Effects of improving cell membrane permeability on ergothioneine fermentation

2.6 分批補料發(fā)酵生產(chǎn)麥角硫因

為了驗證麥角硫因高產(chǎn)菌株經(jīng)過一系列培養(yǎng)基優(yōu)化之后實際的工業(yè)化生產(chǎn)能力，采取3 L發(fā)酵罐發(fā)酵策略進行分批補料發(fā)酵，實現(xiàn)發(fā)酵放大，結(jié)果見圖7。菌體在前24 h生長迅速，OD600超過了60，最高可達到65，后期OD600趨于穩(wěn)定，84 h后菌體開始降解；葡萄糖消耗速率自24 h開始下降，在30~72 h保持穩(wěn)定，與麥角硫因的產(chǎn)量積累速率一致，72 h后葡萄糖消耗速率逐漸降低，整個發(fā)酵過程共消耗235.9 g/L葡萄糖。麥角硫因在前期快速積累，后期產(chǎn)量相對小幅提升，發(fā)酵108 h，麥角硫因的發(fā)酵水平達到了2.01 g/L，生產(chǎn)強度為18.61 mg/（L·h），在較短周期內(nèi)實現(xiàn)了麥角硫因的高效生產(chǎn)，為實現(xiàn)穩(wěn)定可靠的大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。

圖7 分批補料發(fā)酵生產(chǎn)麥角硫因Fig.7 Ergothioneine production under fed-batch fermentation

3 結(jié)語

在本研究中，對麥角硫因合成過程中涉及的氨基酸前體以及途徑酶所需的活性物質(zhì)的添加量進行了優(yōu)化。首先，為了增加麥角硫因代謝通路的前體供應(yīng)量，通過外源添加0.1 g/L的前體組氨酸，麥角硫因搖瓶水平上的發(fā)酵質(zhì)量濃度達到（175.81±1.19）mg/L，相比初始菌株產(chǎn)量提高了22.3%，并通過3 L發(fā)酵罐放大培養(yǎng)，分析了工程菌發(fā)酵的胞內(nèi)外相關(guān)氨基酸質(zhì)量濃度，通過三因素五水平正交試驗，組合添加0.01 g/L的半胱氨酸、檸檬酸鐵胺和維生素B6，解除了氨基酸前體供應(yīng)限制，產(chǎn)量達到（182.61±3.92）mg/L；在此基礎(chǔ)上，進一步補充甲基供體，優(yōu)化添加1.5 g/L甲硫氨酸與0.6 g/L甜菜堿后，產(chǎn)量提高到（199.33±4.96）mg/L，進一步提高了11.9%。最后，為了增強大腸桿菌細(xì)胞膜通透性，提高胞內(nèi)外物質(zhì)的運輸強度，搖瓶誘導(dǎo)后培養(yǎng)基中添加0.2 g/dL CaCl2，最終搖瓶水平的發(fā)酵質(zhì)量濃度達到（243.06±7.85）mg/L，相比初始工程菌產(chǎn)量提高了69.0%。以優(yōu)化后的培養(yǎng)基進行3 L發(fā)酵罐分批補料發(fā)酵策略結(jié)合外源物質(zhì)的添加，最終在發(fā)酵培養(yǎng)108 h時，麥角硫因的發(fā)酵水平達到了2.01 g/L，生產(chǎn)強度為18.61 mg/（L·h），為實現(xiàn)麥角硫因的規(guī)?；I(yè)生產(chǎn)奠定了基礎(chǔ)。