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      冬凌草甲素通過G2/M期阻滯和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡增強人胃癌細(xì)胞放療敏感性

      2022-09-08 01:26:22高靈犀
      關(guān)鍵詞:增敏劑冬凌草甲素

      高靈犀,張 妍,汪 文,張 騰

      (皖南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院 弋磯山醫(yī)院 消化內(nèi)科,安徽 蕪湖 241001)

      胃癌是世界上第五大最常見的癌癥[1]。75%以上的新診斷患者處于晚期,約有50%的晚期胃癌患者失去了手術(shù)機會[2]。放療在胃癌治療中具有重要作用,主要運用于術(shù)前新輔助化療及術(shù)后輔助化療[3-4]。然而胃癌的放療抵抗性及電離輻射的非特異性毒性限制了放療的應(yīng)用[5]。因此,研究有效、低毒的放療增敏劑十分迫切。植物化學(xué)物質(zhì)的低毒性和良好的抗癌作用使其成為研究放療增敏的新方向[6]。冬凌草甲素是一種天然的抗腫瘤二萜類化合物,可抑制癌細(xì)胞增殖,調(diào)節(jié)細(xì)胞周期、凋亡、侵襲、遷移等[7-8],且能增強非小細(xì)胞肺癌放療敏感性[9],但其作為胃癌放療增敏劑及其機制研究尚不充分。本研究通過冬凌草甲素聯(lián)合放療處理SGC7901細(xì)胞,檢測其對細(xì)胞增殖、周期、凋亡的影響,探究其增強人胃癌放療敏感性的機制。

      1 材料和方法

      1.1 材料 SGC7901人胃癌細(xì)胞(上海澳音生物),冬凌草甲素(美國MedChemExpress),RPMI-1640培養(yǎng)基(美國Gibco),胎牛血清(FBS,上海雙洳生物),CCK-8檢測試劑盒(麥客生物),Annexin V-FITC/PI雙染細(xì)胞凋亡試劑盒(上海貝博生物),EdU細(xì)胞增殖試劑盒、細(xì)胞周期試劑盒(上海碧云天生物),兔源Bcl-2抗體、兔源Apaf-1抗體、兔源Cytochrome C抗體(武漢ABclonal)、兔源Bax抗體、兔源Cleaved-caspase3抗體、鼠源β-actin抗體(美國Cell Signaling Technology)。逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、qPCR試劑(上海翊圣生物)。

      1.2 細(xì)胞培養(yǎng) SGC7901細(xì)胞采用含10%血清的RPMI-1640培養(yǎng)基,置于37℃、5%CO2的細(xì)胞培養(yǎng)箱。

      1.3 冬凌草甲素溶液的制備 冬凌草甲素粉末用二甲基亞砜(DMSO)稀釋制成濃度為10 mmol/L的儲存液,分裝并保存于-80℃冰箱。

      1.4 CCK-8實驗 取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板,細(xì)胞貼壁后,用不同冬凌草甲素濃度(0、2、4、8、16 μmol/L)或不同放療劑量(0、2、4、6 Gy)處理,72 h后用CCK-8試劑檢測細(xì)胞活力。CCK-8試劑加入2 h后用酶標(biāo)儀(Bio Tek Epoch2)在450 nm處測定各組的吸光度(OD),將各組孔OD值減去空白孔OD值,各重復(fù)孔OD值取平均數(shù)。細(xì)胞存活率=(加藥細(xì)胞OD-空白OD)/(對照細(xì)胞OD-空白OD)×100%;抑制率=(對照細(xì)胞OD-加藥細(xì)胞OD)/(對照細(xì)胞OD-空白OD)×100%。

      1.5 EdU細(xì)胞增殖實驗 取對數(shù)生長期的細(xì)胞接種于96孔板,設(shè)置空白對照組、冬凌草甲素組(6 μmol/L)、放療組(4 Gy)、聯(lián)合組。聯(lián)合組的細(xì)胞在放療前先用冬凌草甲素預(yù)處理1 h。48 h后將2×EdU工作液等比例加入孔板的培養(yǎng)基中,繼續(xù)孵育2 h,去除培養(yǎng)液,室溫固定、通透,每孔加入50 μL Click反應(yīng)液,室溫避光孵育30 min,然后染核,用熒光倒置顯微鏡(Nikon Ti-U)觀察并拍攝圖像,Image J 1.51K軟件計數(shù),計算細(xì)胞增殖率。

      1.6 平板克隆形成實驗 取對數(shù)生長期的細(xì)胞,分組如“1.5”。聯(lián)合組的細(xì)胞在放療前先用冬凌草甲素預(yù)處理1 h。細(xì)胞以800個/孔的密度接種于6孔板,孵育10~12 d。固定、染色、漂洗后自然晾干并拍攝圖像,Image J 1.51K軟件計數(shù)克隆團,計算實驗組與對照組的比值。

      1.7 細(xì)胞周期實驗 取對數(shù)生長期的細(xì)胞,分組如“1.5”。聯(lián)合組的細(xì)胞在放療前先用冬凌草甲素預(yù)處理1 h。48 h后收集細(xì)胞,預(yù)冷PBS重懸并離心。用預(yù)冷70%乙醇吹打混勻,4℃固定30 min后離心,預(yù)冷PBS重懸并離心。每組加入0.5 mL碘化丙啶染色液重懸,37℃避光溫浴30 min,流式細(xì)胞儀(Beckman CytoFLEX)檢測細(xì)胞周期。

      1.8 細(xì)胞凋亡實驗 取對數(shù)生長期的細(xì)胞,分組如“1.5”。聯(lián)合組的細(xì)胞在放療前先用冬凌草甲素預(yù)處理1 h。72 h后收集細(xì)胞,預(yù)冷PBS洗滌2次。用400 μL 1×Annexin V結(jié)合液重懸,加入5 μL Annexin V-FITC染色液并混勻,4℃避光孵育15 min,加入5 μL碘化丙啶染色液于4℃避光孵育5 min,用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率。

      1.9 qPCR 取對數(shù)生長期的細(xì)胞,分組如前。聯(lián)合組的細(xì)胞在放療前先用冬凌草甲素預(yù)處理1 h。48 h后用Trizol試劑提取總RNA,合成cDNA,最后用qPCR儀(ABI QuantStudio 3)分析基因表達(dá)情況。所有數(shù)據(jù)歸一化到GAPDH表達(dá)。使用計算公式2-ΔΔCt計算相對基因表達(dá)水平。相關(guān)引物序列如表1所示。

      表1 qPCR所用引物序列

      1.10 Western blot實驗 取對數(shù)生長期的細(xì)胞,分組如前。聯(lián)合組的細(xì)胞在放療前先用冬凌草甲素預(yù)處理1 h。48 h后提取細(xì)胞總蛋白并用Bicinchoninic acid(BCA)法檢測濃度。蛋白(30 μg)在SDS-聚丙烯酰胺凝膠上電泳,轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。5%牛血清白蛋白溶液室溫封閉2 h,一抗在水平搖床上4℃孵育過夜。次日與二抗室溫孵育2 h。最后用ECL化學(xué)發(fā)光試劑和化學(xué)發(fā)光成像系統(tǒng)(Tanon 5500)檢測蛋白表達(dá)量,Image J 1.51K軟件分析灰度值,計算目的蛋白與內(nèi)參β-actin的灰度比值。

      2 結(jié)果

      2.1 冬凌草甲素抑制人胃癌細(xì)胞增殖 不同放療劑量處理SGC-7901人胃癌細(xì)胞72 h,與空白對照組相比,放療組細(xì)胞活力均下降,并隨放療劑量升高而下降(P<0.05)。見圖1A。放療組的SGC-7901人胃癌細(xì)胞半數(shù)抑制劑量為4.70 Gy。不同濃度冬凌草甲素處理SGC-7901人胃癌細(xì)胞72 h后,與空白對照組相比,冬凌草甲素組細(xì)胞活力均下降,并隨藥物濃度升高而下降(P<0.01)。見圖1B。冬凌草甲素組的SGC-7901人胃癌細(xì)胞半數(shù)抑制濃度為8.67 μmol/L。

      A.不同放療劑量對SGC-7901人胃癌細(xì)胞活力的影響。F=84.361,P<0.001;B.不同冬凌草甲素濃度對SGC-7901人胃癌細(xì)胞活力的影響。F=242.964,P<0.001。*P<0.05,**P<0.01 vs. NC。

      2.2 冬凌草甲素增強人胃癌細(xì)胞的放療敏感性 SGC-7901人胃癌細(xì)胞經(jīng)冬凌草甲素(6 μmol/L)和(或)放療(4 Gy)處理后,平板克隆形成實驗結(jié)果顯示:冬凌草甲素組和放療組的細(xì)胞克隆形成能力較空白對照組下降(P<0.05);而聯(lián)合組的細(xì)胞克隆形成能力較放療組降低更顯著(P<0.05)。見圖2A。EdU細(xì)胞增殖實驗結(jié)果顯示:與空白對照組[(54.20±1.20)%]相比,冬凌草甲素組[(41.10±1.10)%]和放療組[(26.40±1.40)%]的細(xì)胞增殖率下降(P<0.05),而聯(lián)合組的細(xì)胞增殖率[(18.65±1.35)%]低于放療組(P<0.05)。見圖2B。

      A.平板克隆實驗檢測冬凌草甲素和(或)放療對細(xì)胞克隆形成能力的影響,F(xiàn)=123.975,P<0.001;B.EdU細(xì)胞增殖實驗熒光圖像及統(tǒng)計結(jié)果,F=154.860,P<0.001。NC為空白對照組;Ori為冬凌草甲素組;IR為放療組;IR+Ori為聯(lián)合組;*P<0.05 vs. NC;#P<0.05 vs. IR。

      2.3 冬凌草甲素誘導(dǎo)SGC-7901人胃癌細(xì)胞的G2/M期阻滯 SGC-7901人胃癌細(xì)胞用冬凌草甲素(6 μmol/L)和(或)放療(4 Gy)處理,48 h后檢測細(xì)胞周期。結(jié)果顯示:與空白對照組[(5.75±0.03)%]相比,冬凌草甲素組[(10.83±0.59)%]和放療組[(13.25±0.49)%]G2/M期細(xì)胞比例升高(P<0.05);而聯(lián)合組G2/M期細(xì)胞比例[(21.61±0.21)%]高于放療組(P<0.05)。見圖3。

      流式細(xì)胞術(shù)檢測冬凌草甲素和(或)放療對人胃癌細(xì)胞周期的影響,F(xiàn)1=291.035,F2=22.553,F3=408.532,均P<0.01。*P<0.05 vs. NC;#P<0.05 vs. IR。NC為空白對照組;Ori為冬凌草甲素組;IR為放療組;IR+Ori為聯(lián)合組。

      2.4 冬凌草甲素增強SGC-7901人胃癌細(xì)胞凋亡 SGC-7901人胃癌細(xì)胞用冬凌草甲素(6 μmol/L)和/或放療(4 Gy)處理,72 h后檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果顯示:與空白對照組[(5.60±0.31)%]相比,冬凌草甲素組[(17.89±1.35)%]和放療組[(30.01±1.51)%]的細(xì)胞凋亡率升高(P<0.05);而聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡率[(50.73±2.69)%]高于放療組(P<0.05)。見圖4A。qPCR和Western blot結(jié)果顯示:與空白對照組相比,冬凌草甲素組和放療組的凋亡相關(guān)蛋白Apaf-1、Bax、Cytochrome C、Cleaved-caspase3表達(dá)升高(P<0.05);抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下降(P<0.05)。聯(lián)合組的Apaf-1、Bax、Cytochrome C、Cleaved-caspase3表達(dá)升高較放療組更明顯(P<0.05);Bcl-2表達(dá)下降較放療組更顯著(P<0.05)。見圖4B、C。

      A.流式細(xì)胞儀檢測人胃癌細(xì)胞凋亡圖像,F(xiàn)=258.505,P<0.001;B.qPCR檢測凋亡相關(guān)基因mRNA表達(dá),F(xiàn)1=123.943,F(xiàn)2=40.731,F(xiàn)3=314.877,F(xiàn)4=82.319,F(xiàn)5=151.778,P<0.001;C.Western blot檢測凋亡相關(guān)蛋白表達(dá),F(xiàn)1=109.544,F(xiàn)2=31.830,F(xiàn)3=247.234,F(xiàn)4=61.209,F(xiàn)5=117.249,P<0.001。*P<0.05 vs. NC;#P<0.05vs. IR。NC為空白對照組;Ori為冬凌草甲素組;IR為放療組;IR+Ori為聯(lián)合組。

      3 討論

      胃癌一直是一個嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題,患者5年生存率低于30%[10]。除了手術(shù)治療以外,放療是胃癌的主要治療方法之一,特別是中晚期胃癌[11]。臨床上常用放療與順鉑、紫杉醇等常規(guī)化療相結(jié)合來增加癌細(xì)胞死亡,但對提升放療敏感性收效微弱,且增加了對正常組織的毒性[12]。因此,研究新型放療增敏劑是十分必要的。研究發(fā)現(xiàn)冬凌草甲素在肺癌、胃癌、卵巢癌等多種癌癥中均可發(fā)揮顯著抗癌作用[13-15],冬凌草甲素在非小細(xì)胞肺癌中可通過增強DNA損傷達(dá)到放療增敏的效果[9]。然而,有關(guān)冬凌草甲素作為胃癌放療增敏劑的研究仍不充分,其潛在機制尚不清楚。本研究以人胃癌細(xì)胞SGC7901作為研究對象,探討了冬凌草甲素作為胃癌放療增敏劑的可能性及其潛在機制。

      在本研究中,我們首先驗證了冬凌草甲素抑制SGC7901細(xì)胞增殖,且呈劑量依賴性。隨后我們進(jìn)行了細(xì)胞平板克隆形成實驗和EdU細(xì)胞增殖實驗。結(jié)果顯示聯(lián)合組的細(xì)胞增殖抑制作用高于放療組,提示冬凌草甲素預(yù)處理可以提高SGC7901細(xì)胞對放療的敏感性。影響放療敏感性的主要因素有細(xì)胞凋亡、周期分布、缺氧、DNA損傷修復(fù)和信號通路的調(diào)節(jié)[12]。G2/M期是細(xì)胞周期中輻射最敏感的階段,因此可以誘導(dǎo)G2/M期阻滯的藥物是潛在的放療增敏劑。在本研究中,單獨使用冬凌草甲素處理使細(xì)胞周期阻滯在G2/M期,與以往報道相符合[16-17]。值得注意的是,聯(lián)合組的G2/M期較放療組增加,S期和G1期均略微減少。G2/M期的細(xì)胞對放療更為敏感,而G1、S期的細(xì)胞對放療相對耐受,因此冬凌草甲素對SGC7901細(xì)胞的放療增敏作用可能部分是由于細(xì)胞周期的G2/M期阻滯所致。

      細(xì)胞凋亡是放療介導(dǎo)癌細(xì)胞死亡的主要形式之一[18]。放療增敏劑可通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡來提高放療的療效[19]。在本研究中,細(xì)胞凋亡實驗結(jié)果顯示聯(lián)合組的細(xì)胞凋亡率明顯高于放療組。研究表明,冬凌草甲素可通過多種信號通路誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡[20-21]。在細(xì)胞凋亡線粒體途徑中,Cytochrome C的釋放或抑制取決于Bcl-2和Bax之間的平衡。當(dāng)?shù)蛲龃碳ぎa(chǎn)生,線粒體外膜滲透性增加,Cytochrome C釋放至胞質(zhì),與Apaf-1相結(jié)合并激活Caspase級聯(lián)反應(yīng),最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[22]。在本研究中,與放療組相比,聯(lián)合組的凋亡相關(guān)蛋白Apaf-1、Cytochrome C、Bax、Cleaved-caspase3表達(dá)上調(diào),抗凋亡蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)。以上結(jié)果提示冬凌草甲素增強了放療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,線粒體凋亡途徑關(guān)鍵分子Cytochrome C在聯(lián)合組明顯升高,提示存在線粒體損傷。

      綜上所述,冬凌草甲素可增強SGC7901人胃癌細(xì)胞的放療敏感性,其機制可能與誘導(dǎo)G2/M期阻滯,增強放療誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡有關(guān),這為冬凌草甲素在放療增敏中的應(yīng)用提供了廣闊的前景。未來仍需要更多的分子機制研究及動物實驗來進(jìn)一步證實冬凌草甲素的放療增敏作用。

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