茶多酚對牛乳過敏原αs1-酪蛋白構(gòu)象和抗原性的影響

郭紅蕾，周勝云，叢艷君,*，閆文杰

（1.北京工商大學(xué)食品與健康學(xué)院，北京食品營養(yǎng)與人類健康高精尖創(chuàng)新中心，北京市食品添加劑工程技術(shù)研究中心，北京 100048；2.北京聯(lián)合大學(xué)生物化學(xué)工程學(xué)院，北京 100023）

牛乳是國際公認(rèn)的最常見的過敏性食物之一，牛乳過敏影響了全球2%～3%的幼兒，主要是一種免疫球蛋白E介導(dǎo)的超敏反應(yīng)[1-2]。與嬰兒和兒童相比，青少年和成人患病率更低，這是因為大多數(shù)兒童在達(dá)到學(xué)齡時都會產(chǎn)生耐受性，過敏發(fā)病率0.6%左右[3]。目前，牛乳過敏預(yù)防措施以避免攝入牛乳過敏原為主[4]，研究有效的抗過敏方法很有必要。αs1-酪蛋白是牛乳中主要過敏原，研究αs1-酪蛋白構(gòu)象與抗原性的關(guān)系具有重要意義[5]。

茶多酚是茶葉中所含的一類多羥基酚類化合物的總稱，含量最多的是兒茶素類物質(zhì)，約占茶多酚總量的60%～80%[6-7]，并以4 種形式存在，分別為表兒茶素（epicatechin，EC）、表兒茶素沒食子酸酯（epicatechin gallate，ECG）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（epigallocatechin gallate，EGCG）及表沒食子兒茶素（epigallocatechin，EGC）[8]。其中，EGCG含量約占兒茶素類物質(zhì)總量的50%，并表現(xiàn)出很強(qiáng)的生物活性，EGC含量約占兒茶素類物質(zhì)總量的15%～20%[9-11]。茶多酚具有提供質(zhì)子的能力，具有極強(qiáng)的還原性，因此可以作為一種天然、高效的自由基清除劑，研究表明，茶多酚對人體健康也大有裨益[12-14]，例如，其具有抗氧化、抗輻射、抗腫瘤、抑菌、增強(qiáng)機(jī)體抵抗力等多種生物活性，因此茶多酚被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥生產(chǎn)、日化、食品加工等領(lǐng)域[15-16]。

有研究表明，茶多酚含有很多活性位點，主要表現(xiàn)在與蛋白質(zhì)的結(jié)合能力上，因此茶多酚和蛋白質(zhì)的結(jié)合也是目前食品領(lǐng)域研究的熱點[17]。利用茶多酚改善乳制品的功能特性和感官品質(zhì)，也是基于茶多酚和乳蛋白的結(jié)合能力[18-23]。但是牛乳蛋白和茶多酚結(jié)合后，對過敏原的結(jié)構(gòu)和抗原性的影響目前報道較少。本研究通過熒光光譜、同步熒光光譜、圓二色譜、間接競爭酶聯(lián)免疫吸附測定（enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）法及免疫印跡方法研究茶多酚中活性較高的EGCG和EGC對αs1-酪蛋白構(gòu)象和抗原性的影響，揭示茶多酚的抗過敏機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

αs1-酪蛋白（純度70%）、EGCG（純度≥90%）、EGC（純度≥90%）、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、過硫酸銨、四甲基乙二胺、α-巰基乙醇、甘油、牛血清白蛋白、四甲基聯(lián)苯胺（tetramethylbenzidine，TMB）、二甲基亞砜、氨基黑 美國Sigma公司；低分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白 天根生化科技（北京）有限公司；辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的羊抗鼠免疫球蛋白G 北京友誼中聯(lián)公司；抗血清（多克隆抗體）實驗室自制；Tris、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉（sodium dodecyl sulfate，SDS）、考馬斯亮藍(lán)、甲醇、醋酸、吐溫-20、乙醇 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；濃鹽酸 北京化學(xué)試劑公司；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、過氧化氫、碳酸氫鈉 西隴化工股份有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

KHB ST-360酶標(biāo)儀 上?？迫A實驗系統(tǒng)有限公司；SHZ-C水浴恒溫振蕩器 上海龍躍儀器設(shè)備有限公司；BSA124S-CW電子天平 賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司；SH-2磁力攪拌器 北京東方開物科學(xué)器材有限公司；PHS-3C pH計 上海儀電科學(xué)儀器股份有限公司；DYY-7C電泳儀 北京市六一儀器廠；CR22G離心機(jī) 日本Hitachi公司；F-7000熒光分光光度計日本日立公司；J-1500圓二色譜儀 日本Jasco公司。

1.3 方法

1.3.1 EGCG-αs1-酪蛋白、EGC-αs1-酪蛋白的制備

以0.1 mol/L、pH 7.0磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）為溶劑，配制1 g/100 mLαs1-酪蛋白溶液、0.02 mol/L EGCG溶液，然后將二者等體積混合，分別于25、50、75、100 ℃溫度下反應(yīng)20 min，以不加EGCG的1 g/100 mLαs1-酪蛋白溶液為空白對照，反應(yīng)結(jié)束后，將樣品放置于4 ℃條件下用5 000 Da半透膜進(jìn)行透析過夜，去除沒有與αs1-酪蛋白結(jié)合的EGCG，樣品置于-20 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

EGC-αs1-酪蛋白的制備方法同上。

1.3.2 熒光光譜和同步熒光光譜測定

通過熒光分光光度計檢測EGCG和EGC與αs1-酪蛋白于不同條件下反應(yīng)得到的產(chǎn)物熒光強(qiáng)度的變化情況。熒光分光光度計發(fā)射波長280 nm，掃描波長300～450 nm。同步掃描激發(fā)波長220 nm，掃描光譜280～400 nm，間距60 nm。同步掃描激發(fā)波長235 nm，掃描光譜250～400 nm，間距15 nm。

1.3.3 圓二色譜測定

用0.05 mol/L、pH 7.4 PBS將樣品稀釋至蛋白濃度1.0×10-6mol/L，25 ℃下測定其遠(yuǎn)紫外區(qū)的圓二色譜。每份樣品測定6 次，取平均值。圖譜經(jīng)過儀器本底消除和溶液空白差減，利用楊氏算法得出αs1-酪蛋白、EGC-αs1-酪蛋白、EGCG-αs1-酪蛋白中α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲等二級結(jié)構(gòu)的含量。

1.3.4 抗αs1-酪蛋白多克隆抗體制備

參考Peng Juan[24]、Yeung[25]等的方法：取6 只體質(zhì)量為20～25 g的C3H/He小鼠，將0.2 mL 0.5 mg/mL的αs1-酪蛋白與等體積的弗氏完全佐劑充分混合并乳化后，在小鼠背部皮下分6 點免疫；第22天，取0.1 mL 0.5 mg/mL的αs1-酪蛋白和等體積弗氏不完全佐劑乳化至混合物在水中不擴(kuò)散，小鼠腹腔免疫；第36天，取0.1 mL 0.5 mg/mL的αs1-酪蛋白小鼠腹腔免疫；第50天，取0.2 mL 0.5 mg/mL的αs1-酪蛋白小鼠腹腔免疫；第60天，取6 只小鼠全血，離心制備血清備用。1 只未免疫的小鼠血清為陰性血清，作為對照。

1.3.5αs1-酪蛋白間接競爭ELISA抑制曲線的建立

優(yōu)化酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)、抗原稀釋倍數(shù)、抗血清稀釋倍數(shù)、包被抗原和抗血清反應(yīng)溫度和時間，在底物最佳反應(yīng)條件基礎(chǔ)上，按照間接競爭ELISA程序，于競爭抗原質(zhì)量濃度0～1 400 ng/mL范圍內(nèi)建立間接競爭ELISA抑制曲線，作該質(zhì)量濃度范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線。

在450 nm波長處用酶標(biāo)儀讀取光密度（OD450nm），根據(jù)OD450nm按照以下公式計算抑制率。

式中：B為梯度稀釋的不同質(zhì)量濃度αs1-酪蛋白作為競爭抗原測得的OD450nm；B0為無αs1-酪蛋白競爭體系測得的OD450nm；B1為未免疫小鼠血清作為一抗測得的OD450nm。

間接競爭ELISA步驟：以αs1-酪蛋白作為包被抗原，用0.05 mol/L、pH 9.6的碳酸鹽緩沖液將αs1-酪蛋白稀釋至5 μg/mL，100 μL/孔加入酶標(biāo)板中，于4 ℃冰箱中過夜；αs1-酪蛋白抗原與一抗初級反應(yīng)：在反應(yīng)管中加入1∶1的αs1-酪蛋白抗原或待測樣品（EGCG-αs1-酪蛋白和EGC-αs1-酪蛋白樣品）和1∶4 000稀釋的鼠多抗，不加αs1-酪蛋白抗原或樣品的反應(yīng)管作為無競爭反應(yīng)體系，4 ℃冰箱中反應(yīng)12 h；之后傾去酶標(biāo)板孔內(nèi)液體，用200 μL/孔PBST洗板3 次，每次5 min，甩干；加入添加1 g/100 mL牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）的PBST封閉液進(jìn)行封閉，每孔100 μL，37 ℃放置1 h，200 μL/孔PBST洗板3 次，每次5 min，甩干；將抗原與一抗混合物以100 μL/孔加入酶標(biāo)板內(nèi)，于37 ℃溫育2 h；用PBST洗板4 次，200 μL/孔，每次5 min，甩干；用含1 g/100 mL BSA的PBST將HRP-羊抗鼠IgG稀釋5 000 倍，以100 μL/孔加入，加蓋37 ℃反應(yīng)1 h；用200 μL/孔PBST洗板3 次，200 μL/孔雙蒸水洗板2 次，每次5 min，甩干；加入新鮮配制的TMB應(yīng)用液100 μL/孔，常溫暗處反應(yīng)25 min，顯示藍(lán)色；加入50 μL/孔2 mol/L硫酸終止反應(yīng)，顏色由藍(lán)變黃，用酶標(biāo)儀測定OD450nm[26-29]。

1.3.6 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE）分析

12.5%分離膠、4.5%濃縮膠、膠聯(lián)度為3.6%，進(jìn)行垂直電泳，單板恒流10 mA。具體步驟為：αs1-酪蛋白抗原或樣品溶液與電泳稀釋液以體積比3∶1的比例混合，于沸水浴處理5 min，上樣量10 μL。電泳結(jié)束后的分離膠用考馬斯亮藍(lán)R-250染色15 min，顯現(xiàn)蛋白條帶，以低相對分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，用凝膠成像系統(tǒng)分析其相對分子質(zhì)量。

1.3.7 免疫印跡鑒定

首先進(jìn)行SDS-PAGE，然后將膠上的蛋白轉(zhuǎn)印到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，將膜用加樣梳、鉛筆作標(biāo)記，將PVDF膜剪裁，與SDSPAGE凝膠中分離膠大小一樣，再將PVDF膜、濾紙和海綿一同浸泡于電極緩沖液（含20%甲醇的Tris緩沖溶液）中30～60 min。將電泳完畢的SDS-PAGE分離膠取下，放入電轉(zhuǎn)緩沖液中平衡20～30 min，在干凈、平整的實驗臺上按以下順序從正極到負(fù)極鋪于凝膠夾上：凝膠夾板→海綿→3 層濾紙→PVDF膜→凝膠→3 層濾紙→海綿→凝膠夾板（此過程中應(yīng)避免氣泡產(chǎn)生，用光滑的玻璃棒從一側(cè)向另一側(cè)慢慢滾動，趕出氣泡），夾緊“凝膠三明治”插入轉(zhuǎn)移電泳槽，灌滿緩沖液。將PVDF膜端靠近正極，凝膠面靠近負(fù)極，打開電源，定流192 mA，電轉(zhuǎn)移4.0 h。轉(zhuǎn)印后的PVDF膜一式兩份，1 份用氨基黑10B溶液染色5 min，脫色5 min，觀察轉(zhuǎn)印效果及蛋白質(zhì)位置，另1 份用于免疫印跡。

將轉(zhuǎn)印后的PVDF膜于大小合適的平皿中用dH2O洗滌5 min，再用TBST溶液（添加體積分?jǐn)?shù)0.05%吐溫-20的pH 7.4 Tris緩沖溶液）于37 ℃下漂洗4 次，每次15 min。加入10～20 mL封閉液平皿中，于37 ℃下孵育1 h，封閉PVDF膜，然后用dH2O洗滌5 min。將PVDF膜與1∶4 000稀釋的多抗于37 ℃孵育2 h，再用dH2O洗滌5 min，用TBST溶液洗滌3 次，每次10 min。將PVDF膜與HRP標(biāo)記羊抗鼠二抗（1∶5 000稀釋）于37 ℃孵育1 h，再用dH2O洗滌5 min，TBST溶液洗滌3 次，每次10 min。將漂洗后的PVDF膜浸沒在新鮮配制的0.05 mol/L 4-氯-1-萘酚底物溶液中，顯色（37 ℃、35～40 min），待蛋白帶顯色清晰，即可用dH2O漂洗，終止反應(yīng)。用dH2O沖凈PVDF膜，置于雙層濾紙中風(fēng)干保存[30-31]。

1.4 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均做3 個平行，3 次重復(fù)。用Excel 2013軟件繪制圖表，SPSS 17.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，采用Duncan’s multiple range test方法進(jìn)行顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 熒光光譜和同步熒光光譜分析結(jié)果

由圖1可知，經(jīng)EGC和EGCG處理的αs1-酪蛋白的熒光發(fā)射強(qiáng)度有所減弱，EGC和EGCG均對αs1-酪蛋白內(nèi)部熒光有猝滅作用，EGCG幾乎完全猝滅αs1-酪蛋白的內(nèi)部熒光，EGC對αs1-酪蛋白內(nèi)部熒光的猝滅效率低于EGCG。表明EGC和EGCG分別與αs1-酪蛋白相互結(jié)合，覆蓋在αs1-酪蛋白的表面。

圖1 EGC和EGCG對αs1-酪蛋白的熒光猝滅圖譜Fig. 1 Fluorescence quenching effect of EGC and EGCG on αs1-casein

為深入探究αs1-酪蛋白與EGCG、EGC結(jié)合前后蛋白構(gòu)象的變化，進(jìn)一步通過同步熒光光譜進(jìn)行分析。從同步熒光光譜圖中可獲得生色基團(tuán)分子周圍的結(jié)構(gòu)情況。αs1-酪蛋白的熒光主要來自酪氨酸（tyrosine，Tyr）、色氨酸（tryptophan，Trp）和苯丙氨酸（phenylalanine，Phe）。當(dāng)Δλ=15 nm時，只能得出Tyr熒光的特征光譜；當(dāng)Δλ=60 nm時，只能得出Trp熒光的特征光譜，因此可以通過發(fā)射波長和掃描波長范圍的改變推斷Tyr和Trp殘基周圍結(jié)構(gòu)的變化情況，進(jìn)而推斷出αs1-酪蛋白構(gòu)象的變化[32]。

由圖2可知，經(jīng)EGC和EGCG處理的αs1-酪蛋白中Tyr的熒光發(fā)射強(qiáng)度有所降低，其最大發(fā)射峰發(fā)生藍(lán)移（分別為2、5 nm），說明EGC和EGCG與αs1-酪蛋白結(jié)合后對αs1-酪蛋白中Tyr殘基的周圍結(jié)構(gòu)有影響。且與αs1-酪蛋白結(jié)合后，EGCG相比EGC對αs1-酪蛋白中Tyr殘基周圍環(huán)境的影響更大。

圖2 EGCG和EGC結(jié)合αs1-酪蛋白在Δλ=15 nm時的同步熒光圖譜Fig. 2 Synchronous fluorescence spectra of interaction of αs1-casein with EGCG and EGC at Δλ = 15 nm

由圖3可知，經(jīng)EGC和EGCG處理的αs1-酪蛋白中Trp的熒光發(fā)射強(qiáng)度有所降低，其最大發(fā)射峰發(fā)生紅移（分別為1、2 nm），說明EGC和EGCG與αs1-酪蛋白結(jié)合后對αs1-酪蛋白中Trp殘基的周圍結(jié)構(gòu)有影響。且與αs1-酪蛋白結(jié)合后，EGCG相比EGC對αs1-酪蛋白中Trp殘基周圍環(huán)境的影響更大。

圖3 EGCG和EGC結(jié)合αs1-酪蛋白在Δλ=60 nm的同步熒光圖譜Fig. 3 Synchronous fluorescence spectra of interaction of αs1-casein with EGCG and EGC at Δλ = 60 nm

熒光光譜和同步熒光光譜結(jié)果表明，隨著EGCG和EGC與αs1-酪蛋白的結(jié)合，αs1-酪蛋白發(fā)光基團(tuán)的熒光強(qiáng)度有所降低。EGCG和EGC結(jié)合到αs1-酪蛋白上對αs1-酪蛋白的Tyr和Trp殘基均有影響，推測EGCG和EGC與αs1-酪蛋白的Tyr和Trp殘基本身結(jié)合或者與Tyr和Trp附近的結(jié)構(gòu)相結(jié)合[33]，同時，其對Trp殘基的影響強(qiáng)于Tyr殘基，但是具體的結(jié)合位置需要深入探究。

2.2 圓二色譜分析結(jié)果

蛋白質(zhì)的二級結(jié)構(gòu)有α-螺旋、β-折疊、β-轉(zhuǎn)角和無規(guī)卷曲4 種類型，不同類型所產(chǎn)生圓二色譜帶吸收的位置和強(qiáng)弱不同。圓二色譜中，192 nm波長附近α-螺旋結(jié)構(gòu)有1 個正特征峰譜帶，波長208、222 nm附近有2 個負(fù)譜帶，同時在波長222 nm附近的摩爾橢圓度（θ）絕對值越大，則蛋白中α-螺旋結(jié)構(gòu)也越多；波長185～200 nm附近β-折疊有1 個正峰，波長216 nm附近有1 個負(fù)峰；波長206 nm附近β-轉(zhuǎn)角有1 個正峰。因此，可以通過分析蛋白質(zhì)樣品的圓二色譜圖，推測其二級結(jié)構(gòu)組成。

由圖4～5可知：樣品的圓二色譜顯示，在208～212 nm和218～222 nm附近有峰存在，這是α-螺旋結(jié)構(gòu)的典型特征，說明有α-螺旋產(chǎn)生；在波長224～230 nm附近有微弱且較寬的譜帶，說明存在β-折疊或富含L-脯氨酸序列的區(qū)域。EGCG-αs1-酪蛋白復(fù)合物和EGC-αs1-酪蛋白復(fù)合物在波長222 nm附近的θ絕對值比天然αs1-酪蛋白略大，表明EGCG和EGC結(jié)合αs1-酪蛋白后，αs1-酪蛋白中α-螺旋結(jié)構(gòu)可能有所增加。整體而言，與天然αs1-酪蛋白的圓二色譜相比，EGCG-αs1-酪蛋白復(fù)合物的圓二色譜曲線變化比EGC-αs1-酪蛋白略大，表明EGCG結(jié)合后對αs1-酪蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響比EGC明顯。

圖4 不同處理的αs1-酪蛋白和EGC-αs1-酪蛋白的圓二色譜Fig. 4 CD spectra of free αs1-casein and EGC-αs1-casein

圖5 不同處理的αs1-酪蛋白和EGCG-αs1-酪蛋白的圓二色譜Fig. 5 CD spectra of free αs1-casein and EGCG-αs1-casein

由表1可知，αs1-酪蛋白結(jié)合EGC和EGCG后其構(gòu)象均有變化，α-螺旋和β-折疊含量略有增加，無規(guī)卷曲含量略有降低，并且EGCG對αs1-酪蛋白二級結(jié)構(gòu)的影響比EGC略大。但是，EGC-αs1-酪蛋白和EGCG-αs1-酪蛋白較αs1-酪蛋白的二級結(jié)構(gòu)變化并不顯著。然而，因圓二色譜分析結(jié)果算法較多，且算法原理不同，導(dǎo)致結(jié)果有較大差異，圓二色譜的分析結(jié)果只能作為參考。Hasni等[34]發(fā)現(xiàn)，茶多酚的結(jié)合改變了牛乳酪蛋白的二級結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致無規(guī)卷曲和β-轉(zhuǎn)角數(shù)量增加，而α-螺旋和β-折疊數(shù)量減少。

表1 αs1-酪蛋白、EGCG-αs1-酪蛋白和EGC-αs1-酪蛋白的二級結(jié)構(gòu)含量Table 1 Secondary structure composition of free αs1-casein, EGCG-αs1-casein and EGC-αs1-casein %

2.3 αs1-酪蛋白間接競爭ELISA競爭抑制曲線

為進(jìn)一步研究茶多酚對αs1-酪蛋白抗原性的影響，建立αs1-酪蛋白間接競爭ELISA方法。優(yōu)化條件為酶標(biāo)二抗稀釋倍數(shù)1∶5 000、抗原稀釋為質(zhì)量濃度5 μg/mL、抗血清稀釋倍數(shù)1∶4 000，包被抗原和抗血清37 ℃條件下反應(yīng)2 h，底物最適反應(yīng)條件為25 ℃、25 min?；趦?yōu)化結(jié)果，繪制間接競爭ELISA抑制曲線。由圖6可知，競爭抗原（αs1-酪蛋白）質(zhì)量濃度0～1 400 ng/mL范圍內(nèi)，抑制率與競爭抗原質(zhì)量濃度具有較好的線性關(guān)系，曲線方程為y=-0.019 5x+93.938 0（R2=0.989 2）。

圖6 αs1-酪蛋白間接競爭ELISA競爭抑制曲線Fig. 6 Competitive inhibition curve of ic-ELISA for αs1-casein

2.4 間接競爭ELISA檢測結(jié)果

通過間接競爭ELISA檢測不同反應(yīng)溫度下得到的EGCG-αs1-酪蛋白、EGC-αs1-酪蛋白復(fù)合物的αs1-酪蛋白殘留量。由圖7可知，αs1-酪蛋白與EGCG分別于25、50、75、100 ℃反應(yīng)20 min，所得復(fù)合物的αs1-酪蛋白殘留量差異極顯著（P＜0.01），其中αs1-酪蛋白殘留量最高的條件為25 ℃處理20 min，為（3 720.39±0.93） ng/mL，殘留量最低的條件為100 ℃處理20 min，為（3 589.72±0.61） ng/mL。αs1-酪蛋白與EGC分別于25、50、75、100 ℃反應(yīng)20 min，所得復(fù)合物的αs1-酪蛋白殘留量差異極顯著（P＜0.01），其中αs1-酪蛋白殘留量最高的條件為25 ℃處理20 min，為（3 979.27±0.97） ng/mL，殘留量最低的條件為100 ℃處理20 min，為（3 895.44±1.53） ng/mL。另外，αs1-酪蛋白分別與EGCG、EGC于25、50、75、100 ℃反應(yīng)20 min，所得復(fù)合物的αs1-酪蛋白殘留量差異均極顯著（P＜0.01），并且其中αs1-酪蛋白殘留量最低的條件均為與EGCG發(fā)生反應(yīng)，分別為（3 720.39±1.04）、（3 643.96±0.49）、（3 710.53±0.93）、（3 589.72±0.61）ng/mL，未經(jīng)茶多酚處理的αs1-酪蛋白殘留量最高。因此可以得出，αs1-酪蛋白經(jīng)EGCG和EGC接枝后，其免疫原性減弱。

圖7 EGCG和EGC對αs1-酪蛋白殘留量的影響Fig. 7 Effects of EGCG and EGC on the residual quantity of αs1-casein

茶多酚與牛乳蛋白可通過氫鍵、疏水鍵和范德華力等結(jié)合，形成多酚-蛋白質(zhì)偶聯(lián)物[35]。因此推測本研究EGCG、EGC與αs1-酪蛋白結(jié)合后，可能修飾了αs1-酪蛋白作用表位的氨基酸結(jié)構(gòu)，進(jìn)而降低了免疫原性。吳序櫟[36]通過EGCG和EGC接枝β-乳球蛋白，結(jié)果顯示，β-乳球蛋白分別與EGCG、EGC結(jié)合后，二者與多克隆抗體的結(jié)合能力均有所降低，且EGCG的效果比EGC明顯，與本研究結(jié)論較一致。

2.5 SDS-PAGE結(jié)果

由圖8可知，αs1-酪蛋白分別與EGCG和EGC于不同溫度下反應(yīng)相同時間，得到的復(fù)合物分子質(zhì)量沒有變化，這與EGCG和EGC為小分子化合物有關(guān)。

圖8 茶多酚接枝αs1-酪蛋白電泳圖Fig. 8 Electrophoretogram of αs1- casein grafted with tea polyphenols

2.6 免疫印跡鑒定結(jié)果

由圖9可知，陰性血清與經(jīng)茶多酚接枝后的αs1-酪蛋白未發(fā)生反應(yīng)，表明小鼠多克隆抗體與經(jīng)茶多酚接枝后的αs1-酪蛋白發(fā)生特異性免疫反應(yīng)。

圖9 αs1-酪蛋白及其復(fù)合物免疫印跡譜圖Fig. 9 Western blot patterns of αs1-casein and its complexes

3 結(jié) 論

茶多酚中的EGCG、EGC與αs1-酪蛋白接枝后，對αs1-酪蛋白內(nèi)部熒光有猝滅作用，與EGCG相比，EGC對αs1-酪蛋白內(nèi)部熒光的猝滅效率低于EGCG；對αs1-酪蛋白的Tyr和Trp殘基均有影響，對Trp殘基熒光的影響強(qiáng)于Tyr殘基，但是具體的結(jié)合位置需要深入研究；αs1-酪蛋白的α-螺旋和β-折疊含量略有增加，無規(guī)卷曲含量略有降低。間接競爭ELISA方法發(fā)現(xiàn)，EGCG、EGC均使αs1-酪蛋白的抗原性顯著降低，但是免疫印跡實驗中小鼠多克隆抗體依然與EGCG-αs1-酪蛋白、EGC-αs1-酪蛋白復(fù)合物發(fā)生特異性免疫反應(yīng)，建議進(jìn)一步通過動物實驗揭示其致敏機(jī)制。本研究結(jié)論可以為低致敏乳制品開發(fā)提供重要的理論依據(jù)和思路。