SD大鼠生育力與早期胚胎發(fā)育毒性試驗背景數(shù)據(jù)的建立

楊 陽，崇立明，姜 娟，王 蓉，許 麗，馬愛翠，駱永偉，賈玉玲，周 莉，孫祖越

（1.上海市生物醫(yī)藥技術研究院，中國生育調節(jié)藥物毒理檢測中心，上海 200032；2.湖北天勤生物科技有限公司安評中心，湖北 武漢 430000）

藥物生殖毒性試驗是藥物非臨床安全性評價的重要內容，是藥物進入臨床及上市的重要環(huán)節(jié)。其中生育力與早期胚胎發(fā)育毒性試驗（即Ⅰ段生殖毒性試驗）是觀察藥物對親代動物配子形成、交配行為、生育力、胚胎著床前及著床后生長發(fā)育的影響。根據(jù)人用藥物注冊技術要求國際協(xié)調會（Inter?national Council for Harmonization of Technical Requirements for Pharmaceuticals for Human Use，ICH）（S5）［1］和國家食品藥品監(jiān)督管理總局［2］的指導原則，該研究推薦的嚙齒類動物為大鼠，但由于大鼠品系、個體差異、來源、實驗室條件和測定方法及測量儀器不同等因素，其生物學數(shù)據(jù)有一定的差異。為使實驗數(shù)據(jù)的解釋更加客觀、可靠、準確，本文對本研究室2012-2019年完成的10項SD大鼠生育力與早期胚胎發(fā)育毒性試驗中溶媒對照組的數(shù)據(jù)〔共計484只SD大鼠（雌雄各半）、228只交配成功的雄性SD大鼠和219只妊娠大鼠的相關指標〕進行統(tǒng)計分析，初步建立了本研究室SD大鼠生育力與早期胚胎發(fā)育毒性指標的背景數(shù)據(jù)，為藥物生殖毒性安全性評價的開展和結果判斷提供重要數(shù)據(jù)支持。

1 材料與方法

1.1 動物、飼料和儀器

SD大鼠，雄性5～8周齡，雌性7～9周齡，SPF級，上海西普爾-必凱實驗動物有限公司，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（滬）2008-0016、SCXK（滬）2013-0016和SCXK（滬）2018-0006。大鼠均來自同一供應商，供應商采用封閉群的繁殖方法（即循環(huán)交配法），因而可以保持群體動物基因的雜合性和基因頻率的穩(wěn)定性。大鼠飼養(yǎng)在上海市計劃生育科學研究所（中國生育調節(jié)藥物毒理檢測中心）SPF級小動物房，動物使用許可證號：SYXK（滬）2008-0027、SYXK（滬）2013-0027和SYXK（滬）2018-0017。室溫20～26℃，相對濕度40%～70%，光照7∶00～19∶00；每籠4～5只，自由飲水、攝食，試驗開始前大鼠適應性飼養(yǎng)5 d。繁殖鼠料（高壓蒸汽滅菌），上海仕林生物科技有限公司。PL2002電子天平，瑞士Mettler Toledo公司；YC-2型程控電刺激器，成都儀器廠；TOX IVOS計算機輔助精子分析儀，美國Hamilton Thorne公司。

1.2 試驗方法

回顧性分析本研究室完成的10項SD大鼠生育力與早期胚胎發(fā)育毒性試驗，溶媒對照組（純水）共計484只SD大鼠，雌雄各半；交配后共有228對交配成功，最終219只雌性大鼠成功妊娠。交配前，雌性大鼠連續(xù)ig給予純水2周，雄性大鼠連續(xù)ig給予純水9周。然后按1∶1合籠交配，連續(xù)交配2周。交配期每天上午進行陰道涂片檢查，查到精子或陰栓當日定為妊娠第0天（the gestation 0 day，GD0）；雌性大鼠連續(xù)ig給予純水至GD7，于GD14處死并檢測相關指標；雄性大鼠連續(xù)ig給予純水至交配成功，當日處死并檢測相關指標。2周內未交配成功的雌、雄大鼠停止給予純水，處死并檢測相關指標，不納入數(shù)據(jù)匯總。

1.3 分析指標

1.3.1 交配前SD大鼠

①體重：每周2次。②攝食量：每周1次。

1.3.2 交配成功后雄性SD大鼠

①臟器：取睪丸、附睪、包皮腺、前列腺、精囊腺、提肛肌和括約肌稱重，計算臟器系數(shù)〔臟器重量（g）/體重（g）×100〕。②生育力：交配率、勃起潛伏期（電刺激法）、交配成功時間；附睪尾精子數(shù)量及運動功能，包括活動率、平均路徑速度、直線運動速度、曲線運動速度、精子頭側擺幅度、鞭打頻率、前向性和直線性。

1.3.3 妊娠大鼠

①體重：GD0，GD3，GD7，GD10和 GD14測量體重；宮外增重（GD14體重-GD0體重-胎重）。②早期胚胎發(fā)育：記錄胎重（連子宮）、黃體數(shù)、活胎數(shù)、死胎數(shù)和吸收胎數(shù)，計算著床數(shù)、活胎率、死胎率、吸收胎率和著床前丟失率。

1.4 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 交配前SD大鼠體重和攝食量

交配前SD大鼠體重和攝食量及其95%CI和CV分別見表1和表2，可見雄性和雌性大鼠體重和攝食量隨時間的增加而穩(wěn)定增加。

Tab.1 Body mass of SD rats before mating

Tab.2 Food consumption of SD rats before mating

2.2 交配成功后雄性SD大鼠附屬生殖臟器重量和系數(shù)

228只雄性SD大鼠交配成功后處死，取附屬生殖臟器睪丸和附睪等稱重，計算臟器系數(shù)，并計算它們的95%CI和CV。結果見表3。

Tab.3 Accessory reproductive organ mass and coefficient of successfully mated male SD rats

2.3 交配成功后雄性SD大鼠生育力指標

242只雄性SD大鼠共有228只交配成功，交配率為94.2%，交配成功時間為（2.6±1.5）d，95%CI為2.4～2.8 d，CV為58.5%。雄性SD大鼠交配成功后，當天采用電刺激法進行陰莖勃起潛伏期檢測，潛伏期為（20.3±3.2）s，95%CI為19.9～20.7 s，CV為15.7%。對雄性SD大鼠附睪進行精子分析，精子數(shù)量為（95.1±87.5）×106·g-1附睪，95%CI為（83.7～106.5）×106g-1附睪，CV為92.0%；活動率為（56.5±18.8）%，95%CI為 54.0%～58.9%，CV 為33.3%（表4）。

Tab.4 Fertility of successfully mated male SD rats

2.4 妊娠SD大鼠妊娠期體重和宮外增重

GD14剖檢顯示，228只交配成功雌性大鼠中，共有219只成功妊娠，妊娠率為96.1%。妊娠期體重隨妊娠時間的增加而穩(wěn)定增加（表5），宮外增重為（55.2±9.7）g。

Tab.5 Body mass of pregnant rats after successful mating

2.5 妊娠SD大鼠早期胚胎發(fā)育指標

于GD14處死妊娠SD大鼠，取出子宮和黃體，稱量胎重，計數(shù)黃體數(shù)、著床數(shù)和吸收胎數(shù)等指標。結果顯示，219只妊娠大鼠黃體總數(shù)為2895個，著床數(shù)為2781個；活胎數(shù)為2637只，死胎數(shù)為8只（分布于8只妊娠大鼠），吸收胎數(shù)為136只（分布于101只妊娠大鼠）（表6）。

Tab.6 Early embryonic development of pregnant rats

3 討論

在藥物開發(fā)過程中，生殖毒性研究的目的是通過動物試驗反映受試物對哺乳動物生殖功能和發(fā)育過程的影響，預測其對生殖細胞及動物妊娠、分娩和哺乳等親代生殖功能可能產(chǎn)生的不良影響，以及對子代胚胎-胎兒發(fā)育和出生后發(fā)育的不良影響，其中生育力與早期胚胎發(fā)育毒性試驗（即Ⅰ段）是在SD大鼠由交配前到交配期直至胚胎著床期給藥，觀察其對親代配子形成、交配行為、生育力、胚胎著床前及著床后生長發(fā)育的影響，評價其對大鼠的生殖毒性，為臨床試驗提供參考。

生育力與早期胚胎發(fā)育毒性試驗中，體重和攝食量的異常會直接影響后續(xù)的交配行為，可以提供最直接和清晰的關于藥物毒性的評價。在本研究室雄性和雌性大鼠交配前持續(xù)給藥9周和2周，每周稱量體重2次，24 h攝食1次。交配前雄性SD大鼠前期體重CV偏大，是由于不同批次購買大鼠周齡有差異，導致給藥時初始體重相差較大。根據(jù)《藥物生殖毒性研究技術指導原則》要求，選用年輕、性成熟的成年動物，個體動物初始體重不應超出平均體重±20%。本實驗室在單批次試驗中均滿足該條件。隨著時間的增加，動物體重增長減緩，CV變小，攝食量的變化與體重增長減緩有一定的相關性。雌性SD大鼠體重和攝食量隨著時間的增長而增加，CV均較小。這與朱華等［3］報道“隨著年齡增長，動物體重平穩(wěn)增加，雄性動物的增長幅度大于雌性”的結論相一致。

雄性SD大鼠在交配成功后，進行生育力檢測和解剖取材。通常要求對睪丸和附睪稱量，計算臟器系數(shù)。本研究室增加了對附屬生殖臟器如包皮腺、前列腺和精囊腺等的稱重，其中包皮腺CV較大，由于包皮腺取材較困難，人為因素影響較大，提示實驗中應由熟練的技術人員操作。生育力檢測結果顯示，交配率為94.2%，交配成功時間（2.6±1.5）d，這與葉向鋒等［4］報道相吻合。本研究采用計算機輔助精子分析儀檢測附睪尾精子的運動能力。結果顯示，雄性大鼠精子活動率為（56.5±18.8）%，與宋翼升等［5］研究結果〔活動率（58.3±6.8）%〕基本一致，其他指標如平均路徑速度、直線運動速度和曲線運動速度等也基本接近。

妊娠大鼠體重變化是評價受試物對母體毒性的一個重要指標。本研究室妊娠大鼠GD0體重為（229±17）g，GD14為（295±19）g，體重隨妊娠期延長而增加，CV較小，生長發(fā)育良好。黃體數(shù)、著床數(shù)和活胎數(shù)等指標是衡量早期胚胎發(fā)育毒性的重要指標。本研究室雌性大鼠妊娠率為96.1%，平均黃體數(shù)為（13.2±1.7）個，平均著床數(shù)為（12.7±1.9）個，平均活胎數(shù)為（12.0±2.1）只，活胎率為94.8%。由于現(xiàn)有文獻缺乏相關的背景數(shù)據(jù)，通過與其他機構發(fā)表的案例比較，各研究機構妊娠大鼠平均黃體數(shù)、著床數(shù)和活胎數(shù)等指標相差較?。?-8］。國外學者研究報道，Wistar大鼠妊娠率為94.0%，平均黃體數(shù)為（13.3±2.1）個，平均著床數(shù)為（12.0±2.3）個，平均活胎數(shù)為（11.0±2.4）只，活胎率為93.0%［9］，本實驗室數(shù)據(jù)與此略有差別，可能與動物種屬不同有關。

本研究為本研究室近幾年來不同批次生殖毒性研究數(shù)據(jù)的積累，隨著研究的開展，后續(xù)還會補充更多的數(shù)據(jù)，進行動態(tài)研究匯總。希望這些背景數(shù)據(jù)可為受試物生殖毒性評價提供重要支撐，使評價結果更加科學、合理并貼合實際。