咖啡因?qū)λ邉儕Z模型大鼠腦電和免疫系統(tǒng)功能的影響

王 川，高 榮，房鑫鑫，常海霞，李云峰，王恒林，張黎明

（1.河北北方學(xué)院研究生院，河北張家口 075000；2.解放軍總醫(yī)院第八醫(yī)學(xué)中心麻醉科，北京 100094；軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院3.毒物藥物研究所，抗毒藥物與毒理學(xué)國家重點實驗室，4.軍事認(rèn)知與腦科學(xué)研究所，北京 100850）

良好的睡眠是維持人類正常學(xué)習(xí)記憶的重要過程，可以促進大腦有效地獲取新信息，鞏固以及將新信息整合到現(xiàn)有的記憶結(jié)構(gòu)中［1］。長期睡眠不規(guī)律或睡眠不足可損害人體免疫系統(tǒng)，并誘導(dǎo)抑郁、焦慮等精神疾病的發(fā)生［2］。而急性睡眠剝奪（sleep deprivation，SD）可導(dǎo)致認(rèn)知能力損害，包括感知、記憶、執(zhí)行功能、情緒、注意力和警覺性等降低［3］。

γ振蕩是神經(jīng)元同步發(fā)放所產(chǎn)生的、周期性變化的一種神經(jīng)活動模式，由興奮性錐體細(xì)胞和小清蛋白（parvalbumin，PV）中間神經(jīng)元之間復(fù)雜的突觸相互作用而產(chǎn)生［4］。研究表明，γ振蕩與興奮性錐體細(xì)胞進行的復(fù)雜信息處理過程（如信息的計算、轉(zhuǎn)移、存儲和檢索等）具有同步效應(yīng)［5］，與大腦高級功能（如感知覺、運動行為、記憶形成、警覺和注意力）聯(lián)系緊密［6-8］。多項研究發(fā)現(xiàn)，阿爾茨海默病、帕金森病、精神分裂癥和注意缺陷多動障礙均存在異常γ振蕩［9］。最近研究發(fā)現(xiàn)，SD可引起δ振蕩增強、γ振蕩減弱，并伴隨前額葉皮質(zhì)（prefrontal cortex，PFC）錐體神經(jīng)元樹突長度縮短和分支數(shù)量減少及環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白表達減少［10］。

新近研究發(fā)現(xiàn)，SD可誘導(dǎo)中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥和小膠質(zhì)細(xì)胞活化，激活外周Toll樣受體4（Tolllike receptors 4，TLR4）/NF-κB信號通路［11］。進一步研究發(fā)現(xiàn)，海馬和PFC小膠質(zhì)細(xì)胞異常激活是致SD后記憶和注意力損傷的重要誘因［2，12］。

咖啡因（caffeine，CAF）是廣泛使用的精神活性藥物，具有興奮心肌、骨骼肌和中樞神經(jīng)系統(tǒng)、松弛平滑肌及抗氧化等作用，含CAF的食品（如茶葉、咖啡和可可等）常被用來在睡眠不足情況下保持警惕和提高注意力。文獻報道，CAF可同時拮抗腺苷A1和A2A受體，提高學(xué)習(xí)記憶功能及警覺性［13］。目前，針對CAF影響SD后γ振蕩和免疫系統(tǒng)功能的研究報道較少。本研究采用腦電頻域分析技術(shù)評價CAF對SD模型大鼠腦電特征的影響，并采用Western印跡法和免疫熒光法檢測細(xì)胞因子和炎癥相關(guān)蛋白的表達及活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量的變化。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和主要儀器

CAF（TC130184），中國石藥集團新諾威制藥有限公司；大鼠白細(xì)胞介素1β（interleukin-1β，IL-1β）、腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）和IL-10 ELISA檢測試劑盒，中國武漢云克隆科技有限公司；兔抗大鼠TLR 4單抗、兔抗大鼠NF-κB單抗、鼠源GAPDH單抗、兔抗大鼠離子鈣接頭蛋白分子1（ionized calcium binding adapter molecule 1，Iba1）單抗和DAPI封固劑，美國Abcam公司；辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG和山羊抗大鼠IgG抗體，美國LifeSpan BioSciences公司；腦電遙測植入子（HD-S02），美國DSI公司；跑臺式睡眠剝奪儀（ZH-PT），中國北京創(chuàng)博生物科技有限公司；腦立體定位儀及顱骨鉆，中國瑞沃德生命科技有限公司；正置顯微鏡（Eclipse E100），日本NIKON公司；冰凍切片機（CryoStar NX50），美國Thermo公司；凝膠電泳相關(guān)器材，美國伯樂公司；Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)（OSA-0358），美國LI-COR公司；多功能酶標(biāo)儀（EnVisionTM 2104），美國PerkinElmer公司。

1.2 實驗動物和分組

雄性Wistar大鼠，體重170～190 g，斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，許可證號：SCXK（京）2019-0010。大鼠單籠飼養(yǎng)，自由攝食飲水，飼養(yǎng)環(huán)境溫度20～24℃，濕度40%～60%，光照時間8∶00～20∶00。大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后開始實驗。將大鼠隨機分為正常對照組、SD組和SD+CAF組，每組23只。

1.3 電極植入手術(shù)和腦電數(shù)據(jù)分析

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)5 d后進行HD-S02植入手術(shù)，術(shù)后恢復(fù)7 d。大鼠術(shù)前禁食12 h，ip給予2%戊巴比妥鈉（2 mL·kg-1）麻醉，待大鼠角膜反射和疼痛反射消失后，暴露顱骨，通過腦立體定位儀定位電極植入位置（AP：+2.0 mm；ML：0.0 mm；前囟）和（AP：-3.8 mm；ML：-2.0 mm；人字點），將HD-S02植入子的腦電（electroencephalogram，EEG）電極分別植入定位點，肌電（electromyogram，EMG）電極植入頸部肌肉，分別用于收集大鼠EEG和EMG信號［14］。術(shù)后，大鼠單籠飼養(yǎng)，并連續(xù)3 d每天im給予青霉素鈉抗感染。

使用Ponemah 3.0數(shù)據(jù)采集軟件收集EEG和EMG信號，通過NeuroScore軟件自動對信號進行分析、整理，將大鼠睡眠時相分為覺醒（wake）期、非快眼動睡眠（non-rapid eye movement sleep，NREM）期和快眼動睡眠（rapid eye movement sleep，REM）期，并計算各期分布時間。通過傅里葉變換將覺醒期γ振蕩（30～80 Hz）信號轉(zhuǎn)換為振蕩功率譜密度。用SD前、后γ振蕩功率譜密度強度的比值表示γ振蕩相對強度。

1.4 實驗流程

手術(shù)恢復(fù)期后第0天（D0）10∶00～D1 10∶00，連續(xù)24 h記錄EEG和EMG信號作為基線期信號。D1 11∶00～D4 11∶00，持續(xù)72 h采用跑臺式睡眠剝奪儀制備SD大鼠模型，跑步機速度設(shè)定為10 cm·s-1，運行3 s、停止12 s交替進行，期間大鼠自由飲水和攝食。D1～D4，每天13∶00 ig給予CAF 50 mg·kg-1（SD+CAF組）或同體積生理鹽水（正常對照組和SD組），給藥體積1 mL·kg-1。每組取10只大鼠，D4 11∶00-19∶00記錄EEG和EMG信號，并統(tǒng)計末次給藥后4 h內(nèi)大鼠睡眠各時相分布時間及γ振蕩功率譜密度；每組取8只大鼠，末次給藥后2 h取脾、海馬和PFC，-80℃冰箱保存；每組取5只大鼠，末次給藥后2 h用2%戊巴比妥鈉（2 mL·kg-1）麻醉，用生理鹽水和4%多聚甲醛經(jīng)心臟灌注后取全腦，置4%多聚甲醛中保存（圖1）。

Fig.1 Experimental procedures.Rats were randomly divided into the normal control，sleep deprivation（SD）and SD+caffeine（CAF）group.After 5-day adaptive feeding，HD-S02 was implanted into the brain of rats to collect electroencephalogram（EEG）signals.After postoperative recovery（D0 10∶00-D1 10∶00），the EEG baseline was recorded continuously for 24 h.D1 11∶00-D4 11∶00，a 72 h-SD model of rats was established by a treadmill instru?ment.Rats were ig given CAF 50 mg·kg-1（SD+CAF group）or saline（normal control and SD group）at 13∶00 once per day.EEG signals were recorded to analyze the sleep time and power spectral density within 4 h of the last administration.The brain，spleen，hippocampus and prefrontal cortex（PFC）of rats were collected 2 h after the last drug administration.

1.5 ELISA檢測脾、海馬和PFC組織IL-1 β，TNF- α和IL-10含量

取1.4制備的脾、海馬和PFC組織，研磨后制成組織勻漿，4℃，1000×g離心15 min取上清，按照ELISA試劑盒說明書步驟測定IL-1β，TNF-α和IL-10含量。

1.6 Western印跡法檢測脾組織TLR 4和NF- κB蛋白表達水平

取1.4制備的脾組織，研磨，RIPA裂解后離心取上清液；BCA法測蛋白濃度，每組上樣量為20 μg，進行 SDS-PAGE 電泳，轉(zhuǎn)印至 PVDF 膜，BSA封閉后加入對應(yīng)的一抗〔稀釋倍數(shù)：TLR 4（1∶1000），NF-κB（1∶1000），GAPDH（1∶5000）〕，4℃孵育過夜，TBST清洗；加入二抗辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG抗體（1∶400）和辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG抗體（1∶100），室溫孵育后，采用Odyssey雙色紅外熒光成像系統(tǒng)觀察并拍照，用軟件Image J對蛋白條帶進行半定量分析，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白條帶積分吸光度值的比值反映目標(biāo)蛋白相對表達水平。

1.7 免疫熒光染色檢測海馬齒狀回（dentate gyrus，DG）及內(nèi)側(cè)PFC（medial PFC，mPFC）活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)

取1.4分組制備的全腦，用4%多聚甲醛固定24 h，用20%和30%蔗糖梯度脫水，固定后連續(xù)切片（厚度25 μm）。取DG和mPFC的腦片，PBS漂洗3次，加5%BSA封閉1 h，吸凈液體；加入抗Iba 1抗體（1∶200），4℃恒溫孵育過夜；用 PBS 漂洗3次；避光加入山羊抗兔IgG抗體（1∶500）孵育1 h；PBS漂洗3次；用DAPI封片后于熒光顯微鏡下觀察并拍照。每只大鼠分別選取2～4張海馬DG和mPFC切片，采用Image J軟件計數(shù)Iba陽性細(xì)胞數(shù)，取平均值。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 CAF對SD模型大鼠睡眠時相的影響

EEG檢測結(jié)果（圖2）顯示，與正常對照組相比，SD組大鼠給藥前、后每小時覺醒期均縮短（P<0.05，圖2A1），給藥前1 h及給藥后4 h內(nèi)每小時NREM期延長（P<0.05，圖2A2），每小時REM期無統(tǒng)計學(xué)差異（圖2A3）；而給藥后4 h內(nèi)總覺醒期縮短（P<0.01），總NREM期（P<0.01）和總REM期（P<0.05）延長（圖2B）。與SD組相比，SD+CAF組大鼠給藥前各睡眠時相持續(xù)時間無顯著差異，給藥后4 h內(nèi)每小時覺醒期延長（P<0.05，圖2A1），NREM期及REM期縮短（P<0.05，圖2A2和3），給藥后4 h內(nèi)總覺醒期延長（P<0.01，圖2B），總NREM期及總REM期均縮短（P<0.01，圖2B）。

Fig.2 Effect of CAF on sleep phase of SD rats.See Fig.1 for the rat treatment.A1，A2 and A3：the average duration of wake，non-rapid eye movement sleep（NREM）and rapid eye movement sleep（REM）per hour；B：duration of wake，NREM and REM within 4 h of treatment.x± s，n=10. ＊P<0.05，＊＊P<0.01，compared with normal control group；#P<0.05，##P<0.01，compared with SD group.

2.2 CAF對SD模型大鼠γ振蕩功率譜密度的影響

EEG檢測結(jié)果（圖3）顯示，與正常對照組相比，SD組大鼠覺醒期γ振蕩功率譜密度在43～62 Hz頻段降低（P<0.05）；與SD組相比，SD+CAF組大鼠覺醒期γ振蕩功率譜密度在35～80 Hz頻段均明顯增高（P<0.05）。

Fig.3 Effect of CAF on γ oscillations（wake）of SD rats.See Fig.1 for the rat treatment.γ Oscillation relative power（%）= γ oscillation frequency power/γ oscillation corresponding frequency power in baseline×100%.±s，n=10.＊P<0.05，compared with normal control group；#P<0.05，compared with SD group.

2.3 CAF對SD模型大鼠脾、海馬和PFC組織炎癥因子IL-1 β，IL-10和TNF- α含量的影響

ELISA結(jié)果（圖4）顯示，與正常對照組相比，SD組大鼠脾和海馬組織中IL-1β（P<0.01）和TNF-α（P<0.05）含量顯著增高，IL-10含量降低（P<0.01），PFC組織中IL-1β含量升高（P<0.01），IL-10含量降低（P<0.05），TNF-α含量有升高趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義。與SD組相比，SD+CAF組大鼠脾和海馬中IL-1β和TNF-α含量顯著降低（P<0.05），IL-10含量升高（P<0.05，P<0.01）；PFC組織中IL-1β含量降低（P<0.05），IL-10含量升高（P<0.05），TNF-α含量有降低趨勢，但無統(tǒng)計學(xué)意義。

Fig.4 Effect of CAF on contents of inflammatory factors in spleen（A），hippocampus（B）and prefrontal cortex（PFC，C）tissues of SD rats by ELISA.See Fig.1 for the rat treatment.IL-1β：interleukin-1β；TNF-α：tumor neerosis factor-α.±s，n=6-8.＊P<0.05，＊＊P<0.01，compared with normal control group；#P<0.05，compared with SD group.

2.4 CAF對SD模型大鼠脾組織TLR4和NF- κB蛋白表達水平的影響

Western印跡結(jié)果（圖5）顯示，與正常對照組相比，SD組大鼠脾組織TLR4和NF-κB蛋白表達水平增高（P<0.05，P<0.01）；與SD組相比，SD+CAF組TLR4和NF-κB蛋白表達水平降低（P<0.01）。

Fig.5 Effect of CAF on expressions of Toll-like receptors 4（TLR4,A）and NF- κB（B）in spleens of SD model rats by Western boltting.See Fig.1 for the rat treatment.A2 and B2 were the semi-quantitative results of A1 and B1，respectively.±s，n=4-5.＊P<0.05，＊＊P<0.01，compared with normal control group；##P<0.01，compared with SD group.

2.5 CAF對SD模型大鼠海馬DG和mPFC活化的小膠質(zhì)細(xì)胞的影響

免疫熒光結(jié)果（圖6）顯示，在大鼠海馬DG和mPFC中，SD組活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)均較正常對照組明顯增加（P<0.01）；SD+CAF組活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)較SD組明顯減少（P<0.05）。

Fig.6 Effect of CAF on numbers of microglia in hippocampal dentate gyrus（A）and medial prefrontal cortex（mPFC，B）of SD model rats by immunofluorescence.See Fig.1 for the rat treatment.A2 and B2 were the semi-quantitative results of A1 and B1，respectively.±s，n=4-5.＊＊P<0.01，compared with normal control group；#P<0.05，compared with SD group.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，72 h SD可改變大鼠睡眠結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致覺醒時間減少，睡眠時間延長，γ振蕩功率下降。而CAF可逆轉(zhuǎn)SD所致的上述變化，增加覺醒時間，縮短睡眠時間，提高γ振蕩強度。另外，在SD后，大鼠脾、海馬和PFC組織中IL-1β和TNF-α含量升高，IL-10含量降低，并伴隨海馬和mPFC中活化的小膠質(zhì)細(xì)胞數(shù)量增多，而CAF可抑制TLR4/NF-κB通路、炎癥因子釋放及小膠質(zhì)細(xì)胞激活。

腺苷是一種重要的促睡眠神經(jīng)遞質(zhì)，隨覺醒時間延長，腦內(nèi)腺苷水平逐漸增高［16］。有研究表明，激活腺苷A1受體可阻斷突觸前膜鈣釋放，導(dǎo)致谷氨酸釋放減少［17］，影響到PV中間神經(jīng)元及錐體神經(jīng)元［4］，從而導(dǎo)致γ振蕩異常。隨著SD的延長，腦內(nèi)腺苷累積［16］，大腦皮質(zhì)電活動減弱，導(dǎo)致睡眠時間延長［18］及γ振蕩減弱［10］，并伴隨學(xué)習(xí)記憶、警覺性受損［3］。同時，腺苷A1受體可激活鉀離子通道，降低細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷含量，加快神經(jīng)細(xì)胞的超極化速度，從而抑制神經(jīng)元活動及γ振蕩［19］。新近研究表明，通過光遺傳技術(shù)興奮PV中間神經(jīng)元誘發(fā)出40 Hz γ振蕩，可減少阿爾茨海默病模型大鼠腦內(nèi)β-淀粉樣蛋白的產(chǎn)生，改善認(rèn)知功能［20］。先前大量研究已證實，咖啡因通過阻斷腺苷受體減輕SD后學(xué)習(xí)記憶和警覺性的降低［21-22］。本研究發(fā)現(xiàn)，CAF可逆轉(zhuǎn)SD造成的睡眠時相改變及γ振蕩的衰減，尤其在35～55 Hz更為明顯，可能與阻斷腺苷A1受體有關(guān)，這可能是其改善SD后認(rèn)知障礙的重要機制。

SD與中樞炎癥反應(yīng)、細(xì)胞凋亡、鈣穩(wěn)態(tài)失衡及神經(jīng)遞質(zhì)傳遞改變等有關(guān)［23］。有研究表明，SD可激活NF-κB和Toll樣受體，增加外周炎癥因子的釋放［24］，而IL-6及TNF-α可損害血管內(nèi)皮功能并破壞血腦屏障通透性［25］。外周炎癥因子通過血腦屏障進入大腦并激活神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，可引起炎癥因子進一步升高和神經(jīng)損傷，從而導(dǎo)致認(rèn)知、警覺和注意力的下降［26-27］。小膠質(zhì)細(xì)胞在炎癥及缺血缺氧情況下被激活，引起突觸修剪異常，損害神經(jīng)可塑性［28］。多項研究發(fā)現(xiàn)，小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥與焦慮、注意力下降、記憶損害關(guān)系密切［29-30］，而腺苷A2A受體拮抗劑可改善小膠質(zhì)細(xì)胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥，減少炎癥因子的釋放，發(fā)揮神經(jīng)保護作用［31］。本研究發(fā)現(xiàn)，SD可增加激活的小膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)量，而CAF治療可逆轉(zhuǎn)這一現(xiàn)象。進一步研究發(fā)現(xiàn)，CAF可抑制TLR4/NF-κB信號通路，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞激活，減輕神經(jīng)炎癥。

綜上，CAF抗SD后睡眠障礙機制可能與調(diào)節(jié)睡眠結(jié)構(gòu)和γ振蕩、調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞功能和改善神經(jīng)炎癥有關(guān)。