基底外側(cè)杏仁核至伏隔核環(huán)路在大鼠丙泊酚依賴中的作用

黃炳武，陳依爾，崔燕華，連慶泉，蘇 穎，林 函，

（1.溫州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院育英兒童醫(yī)院麻醉與圍術(shù)期醫(yī)學(xué)科，浙江溫州 325027；2.浙江省麻醉學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江溫州 325035）

藥物濫用和藥物依賴是嚴(yán)重的公共安全和個(gè)人健康問(wèn)題，給整個(gè)社會(huì)和個(gè)人造成了不可估量的損失。目前，藥物濫用以大麻類、鴉片類和可卡因最為常見(jiàn)，而這些藥物都屬于麻醉藥品范疇。丙泊酚（propofol）又名異丙酚，是一種起效快、蘇醒迅速的靜脈麻醉用藥，自1986年問(wèn)世以來(lái)，已廣泛應(yīng)用于臨床麻醉的誘導(dǎo)和維持［1］。近年來(lái)，國(guó)外相繼報(bào)道多起與丙泊酚相關(guān)的死亡事件，引起了廣大社會(huì)群體和醫(yī)務(wù)人員的關(guān)注和擔(dān)憂，越來(lái)越多的證據(jù)表明，丙泊酚可能存在一定的成癮性［2-3］。本課題組前期已成功建立大鼠丙泊酚自身給藥行為模型，并驗(yàn)證了大腦伏隔核（nucleus accumbens，NAc）多巴胺受體1、細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶（extracellular signalregulated kinases，ERK）和糖皮質(zhì)激素受體（gluco?corticoid receptor，GR）參與調(diào)控大鼠丙泊酚自身給藥行為［4-6］。目前，關(guān)于谷氨酸（glutarnate，Glu）能受體在藥物成癮中發(fā)揮重要調(diào)控作用的研究報(bào)道日益增多，而最近本課題組也發(fā)現(xiàn)，ip給予Glu受體拮抗劑可減少大鼠丙泊酚自身給藥行為［7］，但在NAc區(qū)給藥對(duì)大鼠丙泊酚覓藥行為的影響，迄今尚無(wú)文獻(xiàn)報(bào)道。

基底外側(cè)杏仁核（basolateral amygdala，BLA）是中腦邊緣系統(tǒng)的組成部位，以Glu能神經(jīng)元為主，主要參與調(diào)控線索誘發(fā)的成癮行為［8-9］。NAc是邊緣獎(jiǎng)賞系統(tǒng)的關(guān)鍵部分，可與邊緣系統(tǒng)內(nèi)其他腦區(qū)相互作用，參與調(diào)控多種成癮藥物的獎(jiǎng)賞機(jī)制［10］。研究表明，BLA向NAc有Glu能神經(jīng)投射，形成BLA-NAc環(huán)路并參與自然獎(jiǎng)賞行為的調(diào)控［11］。最近，Puaud等［12］發(fā)現(xiàn)，抑制BLA-NAc環(huán)路可減少可卡因誘導(dǎo)的大鼠自身給藥行為，提示BLA-NAc環(huán)路有可能參與藥物成癮的調(diào)控機(jī)制，但此環(huán)路對(duì)大鼠丙泊酚自身給藥行為的影響及機(jī)制目前未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道。本研究采用大鼠自身給藥行為方法建立丙泊酚依賴模型，用Western印跡法檢測(cè)丙泊酚依賴大鼠NAc內(nèi)Glu能α-氨基-3-羥基-5-甲基-4-異唑丙酸受體（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxa?zole-propionic acid receptor，AMPAR）的 亞 基GluA1和GluA2蛋白表達(dá)水平，然后在NAc內(nèi)注射NBQX（AMPAR拮抗劑），觀察其對(duì)大鼠丙泊酚自身給藥行為的影響，最后通過(guò)藍(lán)光刺激和NAc區(qū)給藥探索BLA-NAc環(huán)路對(duì)大鼠丙泊酚依賴行為的調(diào)控作用及其機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF級(jí)雄性SD大鼠60只，7～8周齡，體重240～290 g，購(gòu)自北京維通利華生物科技有限公司，動(dòng)物許可證編號(hào)：SCXK（浙）2019-0001。大鼠用獨(dú)立代謝籠適應(yīng)性飼養(yǎng)，保持環(huán)境溫度22～24℃，相對(duì)濕度50%～70%，每日限制進(jìn)食30 g鼠飼料，飲水自由，保證 12 h燈光照明（2∶00～14∶00開(kāi)燈，14∶00～次日2∶00關(guān)燈）。本實(shí)驗(yàn)過(guò)程符合溫州醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物中心動(dòng)物倫理管理?xiàng)l例規(guī)定。

1.2 藥品、試劑和儀器

丙泊酚，德國(guó)Fresenius Kabi公司；NBQX，美國(guó)Sigma-Aldrich公司；蔗糖，德國(guó)BioFroxx公司；多聚甲醛，上海凌峰化學(xué)試劑有限公司；兔抗鼠GluA1和GluA2單克隆抗體，美國(guó)Cell Signaling Technology公司；兔抗鼠GAPDH單克隆抗體和HRP標(biāo)記山羊抗兔IgG抗體，碧云天生物技術(shù)研究所；生理鹽水，河北天成藥業(yè)股份有限公司。

腦立體定位儀（68025）、微注射系統(tǒng)（KDS310）、導(dǎo)管、導(dǎo)管帽和注射內(nèi)管，深圳瑞沃德生命科技有限公司；微量注射器，德國(guó)Hamilton公司；4℃孵育搖床（DLHR-Q200）和冰凍切片機(jī)（HI1210），美國(guó)Thermo公司；蛋白電泳儀，美國(guó)Bio-rad公司；凝膠成像系統(tǒng)，美國(guó)GE公司；熒光正置顯微鏡（DM5500B），德國(guó)Leica公司；智能激光光源（Aurora-220-473），杭州紐頓科技有限公司；光纖和跳線，杭州熒博科技有限公司。AES-SYS16大鼠自身給藥行為訓(xùn)練籠，寧波安來(lái)科學(xué)儀器有限公司。整個(gè)行為實(shí)驗(yàn)裝置由大鼠操作行為箱和計(jì)算機(jī)控制系統(tǒng)組成。大鼠操作行為箱中配有左、右各1套鼻觸鍵和鼻觸燈及1個(gè)籠燈，若大鼠鼻觸反應(yīng)正確，則籠燈滅，鼻觸燈亮，此時(shí)大鼠可通過(guò)置入體內(nèi)的靜脈導(dǎo)管獲得1次丙泊酚（1.7 mg·kg-1）的泵入。實(shí)驗(yàn)過(guò)程由計(jì)算機(jī)自動(dòng)控制完成。

1.3 重組腺相關(guān)病毒構(gòu)建

腺相關(guān)病毒載體（adeno-associated virus，AAV）-鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱα（calmodulindependent protein kinaseⅡα，CaMKⅡα）-黃綠色熒光蛋白（enhanced yellow fluorescent protein，eYFP）和AAV-CaMKⅡα-光敏感通道蛋白（chan?nelrhodopsin-2，ChR2）-eYFP（每管20 μL，滴度為5.3E+12 μg·mL-1），武漢樞密腦科學(xué)技術(shù)有限公司。AAV-CaMKⅡα-eYFP含有CaMKⅡα基因啟動(dòng)子序列，可精確感染Glu能神經(jīng)元，但不含ChR2基因，光照后不能激活Glu能神經(jīng)元。AAV-CaMKⅡα-ChR2-eYFP含有CaMKⅡα基因啟動(dòng)子序列和ChR2基因，可以精確感染Glu能神經(jīng)元并使其被相應(yīng)的藍(lán)光激活，從而使Na+和Ca2+通過(guò)激活的ChR2通道內(nèi)流，導(dǎo)致神經(jīng)元去極化。

1.4 大鼠丙泊酚依賴模型的建立

1.4.1 自身給藥訓(xùn)練和分組

大鼠經(jīng)5%水合氯醛麻醉后，將PE-硅膠管置入右側(cè)頸外靜脈，并將導(dǎo)管出口從背后穿出，固定。取12只頸外靜脈置管后的大鼠進(jìn)行丙泊酚自身給藥行為訓(xùn)練。每天14∶00至次日2∶00為行為學(xué)實(shí)驗(yàn)時(shí)間，連續(xù)14 d，每天每只訓(xùn)練3 h。訓(xùn)練時(shí)，將大鼠放入訓(xùn)練籠，將PE-硅膠導(dǎo)管出口與輸液泵連接，運(yùn)行固定比率1（fixed ratio 1，F(xiàn)R1）程序，即當(dāng)大鼠鼻觸1次左側(cè)鼻觸鍵（有效開(kāi)關(guān)），會(huì)得到1次丙泊酚（1.7 mg·kg-1）泵入，并伴隨籠燈熄滅、左側(cè)鼻觸燈亮以及持續(xù)5 s的聲音刺激線索。2個(gè)訓(xùn)練周期間間隔30 s的不應(yīng)期，若大鼠在不應(yīng)期內(nèi)再次鼻觸有效開(kāi)關(guān)不能獲取丙泊酚泵入及相關(guān)線索發(fā)生，但系統(tǒng)會(huì)記錄1次鼻觸次數(shù)；而當(dāng)大鼠鼻觸1次右側(cè)鼻觸鍵（無(wú)效開(kāi)關(guān)）不會(huì)得到丙泊酚泵入及相關(guān)線索的發(fā)生［4］。訓(xùn)練結(jié)束后，程序停止并記錄有效和無(wú)效鼻觸次數(shù)。根據(jù)訓(xùn)練第12～14天有效鼻觸次數(shù)將大鼠分為丙泊酸依賴大鼠（有效鼻觸次數(shù)均>40次，且波動(dòng)≤10%）和丙泊酚非依賴大鼠（有效鼻觸次數(shù)均<20次）。

1.4.2 Western印跡法檢測(cè)NAc區(qū)GluA1和GluA2蛋白表達(dá)水平

在第15天訓(xùn)練結(jié)束后，立即將大鼠處死，取腦并分離NAc區(qū)，加入裂解液和蛋白酶抑制劑，搗碎、碾磨、靜置后超聲勻漿，4℃，12 000×g離心30 min，收取上清液。用BCA試劑盒測(cè)定勻漿液蛋白濃度。在勻漿液中加入上樣緩沖液，100℃煮沸10 min變性。每條泳道蛋白上樣量30 μg，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜后用5%脫脂牛奶封閉2 h，加入抗GluA1，GluA2和GAPDH一抗（稀釋比例均為1∶1000），4℃搖床孵育16～20 h。TBST洗膜，加入HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗（稀釋比例為1∶2000），室溫孵育2 h，TBST充分洗膜，曝光后顯示條帶。ImageJ 1.51軟件分析蛋白條帶的積分吸光度（integrated absor?bance，IA），以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白IA值的比值表示目標(biāo)蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.5 NAc區(qū)注射NBQX對(duì)丙泊酚依賴大鼠覓藥行為的影響

1.5.1 NAc區(qū)套管置入手術(shù)

正常大鼠ip給予5%水合氯醛（7 mL·kg-1）麻醉后固定在腦立體定位儀上，切開(kāi)顱頂皮膚暴露前、后囟，調(diào)整至同一平面。根據(jù)前囟的位置，在NAc區(qū)（A/P：+1.8 mm；M/L：-1.5 mm；D/V：-8 mm）鉆孔，將套管經(jīng)孔緩慢下降至目標(biāo)腦區(qū)，用凝膠海綿填塞套管與孔間的縫隙。在鉆孔位置旁開(kāi)5 mm處鉆2個(gè)淺孔，各擰入1枚螺絲釘，用牙托粉將套管和螺絲釘包裹并固定。

1.5.2 大鼠分組、給藥和丙泊酚覓藥行為檢測(cè)

大鼠NAc區(qū)埋置套管（同1.5.1）和靜脈埋置給藥管（同1.4.1），手術(shù)后恢復(fù)7 d，而后進(jìn)行丙泊酚自身給藥訓(xùn)練，訓(xùn)練方法同1.4.1，訓(xùn)練結(jié)束后次日（第15天）進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試開(kāi)始前30 min，將24只丙泊酚依賴模型大鼠隨機(jī)分為4組（n=6）：對(duì)照組及NBQX 0.25，0.5和1 μg組，在套管內(nèi)置入給藥管，通過(guò)微量注射泵在NAc區(qū)分別泵入生理鹽水或NBQX（泵入體積為 0.3 μL，流速為 0.2 μL·min-1），在FR1程序下觀察NBQX對(duì)大鼠丙泊酚覓藥行為的影響。實(shí)驗(yàn)流程見(jiàn)圖1。

Fig.1 Flow chart of propofol self-administration training coupled with NAc administration in rats.The test was performed the day after 14 days of continuous propofol self-administration training.The propofol addicted rats were randomly divided into control group and NBQX〔α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazolepropionic acid receptors（AMPAR）antagonist，0.25，0.5 and 1 μg〕group（n=6），and were given saline or NBQX via guide cannulae to the nucleus accumbens（NAc）（injection volume：0.3 μL；flow rate：0.2 μL·min-1）30 min before testing.The effect of NBQX on the number of active nasal contacts in propofol addicted rats was observed under the fixed ratio 1（FR1）procedure.

1.6 藍(lán)光激活BLA-NAc環(huán)路對(duì)大鼠丙泊酚覓藥行為的影響

1.6.1 重組腺相關(guān)病毒注射

正常大鼠麻醉后固定在腦立體定位儀上，在BLA區(qū)（A/P：-2.5mm；M/L：-4.9mm；D/V：-8.5mm）鉆孔，然后將微量進(jìn)樣針緩慢插入至目標(biāo)腦區(qū)，使用微量注射泵以0.1 μL·min-1的速度緩慢注入0.5 μL病毒，注射完畢后停針10 min，緩慢退出微量進(jìn)樣針，并縫合皮膚和消毒。

1.6.2 大鼠分組、光刺激和丙泊酚覓藥行為檢測(cè)

將正常大鼠隨機(jī)分為2組，分別在BLA區(qū)注射AAV-CaMKⅡα-eYFP和AAV-CaMKⅡα-ChR2-eYFP（同1.6.1），注射3周后，手術(shù)植入套管（同1.5.1）和靜脈給藥管（同1.4.1）?；謴?fù)1周后進(jìn)行丙泊酚自身給藥訓(xùn)練，訓(xùn)練方法同1.4.1。選取丙泊酚依賴大鼠分為eYFP組、eYFP+NBQX組、ChR2-eYFP組和 ChR2-eYFP+NBQX組（n=6），在第15天進(jìn)行測(cè)試。測(cè)試開(kāi)始前30 min，eYFP組和ChR2-eYFP組在NAc區(qū)給予生理鹽水，eYFP+NBQX組和ChR2-eYFP+NBQX組給予NBQX 0.5 μg（同1.5.2）。測(cè)試時(shí)將套管內(nèi)置入光纖并與470 nm激光發(fā)生器和訓(xùn)練籠相連接。根據(jù)ChR2通道蛋白的光電特性［13］，采用持續(xù)時(shí)間4 s、頻率10 Hz、脈沖寬度20 ms、輸出功率40 mW的激光方波（藍(lán)光），并控制輸出至光纖尖端的功率穩(wěn)定在4～10 mW。在FR1程序下（即當(dāng)大鼠鼻觸1次有效開(kāi)關(guān)，可獲得1次藥物泵入，同時(shí)伴隨相關(guān)線索的發(fā)生和一串藍(lán)光刺激）觀察藍(lán)光刺激對(duì)大鼠丙泊酚覓藥行為的影響。實(shí)驗(yàn)流程見(jiàn)圖2。

Fig.2 Flow chart of propofol self-administration training coupled with optogenetics test in rats.Four weeks before propofol self-administration training，the virus was injected into the basolateral amygdala（BLA）.One week before propofol self-admin?istration training，the venous catheter was placed and the guide cannulae was embedded into the NAc.The optogenetics test was performed the day after 14 days of continuous propofol self-administration training.The propofol addicted rats were randomly divided into enhanced yellow fluorescentprotein（eYFP）group，eYFP+NBQX group，channelrhodopsin-2（ChR2）-eYFP group and ChR2-eYFP+NBQX group（n=6），and were given saline or NBQX 0.5 μg via guide cannulae to the NAc（injection volume：0.3 μL；flow rate：0.2 μL·min-1）30 min before testing.During the test，optogenetic stimulation was delivered via guide cannulae to BLA-NAc circuit of propofol addicted rats and the number of active nasal contacts was observed under the FR1 procedure.

1.6.3 免疫熒光法檢測(cè)大鼠BLA和NAc區(qū)病毒表達(dá)

行為學(xué)測(cè)試結(jié)束后，將大鼠麻醉后心臟灌流，取腦固定、脫水、包埋。然后冰凍切片機(jī)切片，厚度200 μm，固定漂洗后滴加抗熒光淬滅劑封片。在熒光正置顯微鏡下拍片，觀察大鼠腦BLA和NAc區(qū)熒光表達(dá)并拍照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有結(jié)果數(shù)據(jù)符合正態(tài)分布，用±s表示。丙泊酚依賴與丙泊酚非依賴大鼠行為學(xué)結(jié)果采用重復(fù)測(cè)量方差分析和Tukey t檢驗(yàn)，Western印跡結(jié)果采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)；藍(lán)光刺激和NAc區(qū)注射給藥后各組大鼠行為學(xué)結(jié)果采用單因素方差分析和Tukey t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丙泊酚依賴大鼠覓藥行為及NAc區(qū)GluA1和GluA2蛋白表達(dá)

行為學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果（圖3A）顯示，與丙泊酚非依賴大鼠相比，丙泊酚依賴大鼠有效鼻觸次數(shù)明顯增加（P<0.05），即覓藥行為增加。Western印跡檢測(cè)結(jié)果（圖3B-3D）顯示，與非依賴大鼠相比，丙泊酚依賴大鼠NAc內(nèi)GluA1和GluA2蛋白表達(dá)水平升高（P<0.05）。

Fig.3 Propofol self-administration behavior（A）and expressions of GluA1 and GluA2（B）in NAc of propofol addicted rats.Rats were trained under a FR1 schedule to discrimi?nate propofol addicted from non-addicted.After 14-day training，rats whose number of active nasal contacts was 40 or larger in the last three days of the training and whose fluctuation was 10%or less were considered propofol addicted，while rats whose number of active nasal contacts was 20 or less were considered non-addicted.B3 was the semi-quantitative result of B1 and B2 by Western blotting.IA：integrated absorbance.±s，n=6.＊P<0.05，compared with non-addicted rats.

2.2 NAc區(qū)注射NBQX對(duì)丙泊酚依賴大鼠覓藥行為的影響

與對(duì)照組相比，NBQX 0.5和1 μg組大鼠有效鼻觸次數(shù)顯著減少（P<0.01）（圖4）。提示阻斷NAc區(qū)AMPAR可以抑制大鼠丙泊酚覓藥行為。

Fig.4 Effect of NBQX on propofol seeking behavior in propofol addicted rats.See Fig.1 for the rat treatment.±s，n=6.＊＊P＜0.01，compared with control group.

2.3 藍(lán)光刺激BLA-NAc環(huán)路對(duì)丙泊酚依賴大鼠覓藥行為的影響

與eYFP組相比，ChR2-eYFP組大鼠有效鼻觸次數(shù)增加（P<0.01），而eYFP+NBQX組大鼠有效鼻觸次數(shù)減少（P<0.01）。與eYFP+NBQX組相比，ChR2-eYFP+NBQX組大鼠有效鼻觸次數(shù)增加（P<0.01）。與ChR2-eYFP組相比，ChR2-eYFP+NBQX組大鼠有效鼻觸次數(shù)減少（P<0.01）。與eYFP組相比，ChR2-eYFP+NBQX組大鼠有效鼻觸次數(shù)無(wú)明顯變化（圖5）。

Fig.5 Effect of blue optogenetic stimulation to BLANAc circuit on propofol seeking behavior in propofol addicted rats.See Fig.2 for the rat treatment.±s，n=6.＊＊P<0.01，compared with eYFP group；##P<0.01，compared with eYFP+NBQX group；△△P<0.01，compared with ChR2-eYFP group.

2.4 BLA和NAc區(qū)病毒表達(dá)鑒定

免疫熒光檢測(cè)結(jié)果（圖6）表明，BLA區(qū)病毒正確表達(dá)（圖6A），且可以成功轉(zhuǎn)染到NAc區(qū)（圖6B）。

Fig.6 eYFP expressions in BLA（A）and NAc（B）of rats after virus injection by immunofluorescence assay.See Fig.2 for the rat treatment.The arrows show the regions of virus expression.

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚依賴大鼠NAc區(qū)GluA1和GluA2蛋白表達(dá)水平增高，拮抗NAc內(nèi)AMPAR可顯著減少大鼠丙泊酚覓藥行為，而興奮BLA-NAc環(huán)路可增加大鼠丙泊酚自身給藥行為，并改善NAc內(nèi)注射AMPAR拮抗劑對(duì)大鼠覓藥行為的抑制作用。

中腦邊緣獎(jiǎng)賞系統(tǒng)在藥物成癮中起重要作用，已知的腦區(qū)主要有中腦腹側(cè)被蓋區(qū)、NAc、杏仁核、背側(cè)紋狀體、黑質(zhì)、海馬、前額葉皮質(zhì)、島葉皮質(zhì)、下丘腦、丘腦底核和腹側(cè)蒼白球等，但這些腦區(qū)在藥物成癮中的調(diào)控機(jī)制尚未完全闡明［14］。BLA是NAc上游腦區(qū)，主要以Glu能神經(jīng)元為主，BLA Glu能神經(jīng)元的異常興奮可能是誘發(fā)和維持藥物成癮的重要原因，而B(niǎo)LA Glu能神經(jīng)元失活可抑制對(duì)成癮藥物的依賴［15-16］。BLA和NAc均可參與調(diào)控線索誘發(fā)的動(dòng)機(jī)行為，二者不僅有解剖關(guān)系還存在功能上的聯(lián)系。在線索誘發(fā)的獎(jiǎng)賞行為中，BLA神經(jīng)元對(duì)線索的應(yīng)答反應(yīng)會(huì)先于NAc神經(jīng)元，并參與對(duì)NAc神經(jīng)元興奮性的調(diào)控。電刺激BLA區(qū)可促進(jìn)大鼠NAc區(qū)Glu能介導(dǎo)的多巴胺釋放，引起NAc神經(jīng)元細(xì)胞興奮，進(jìn)而誘發(fā)藥物的獎(jiǎng)賞效應(yīng)［17-18］。自身給藥行為模型是目前藥物成癮研究中公認(rèn)和普遍采用的實(shí)驗(yàn)方法［19］，本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，BLA和NAc均可參與調(diào)控線索誘導(dǎo)的大鼠丙泊酚自身給藥行為［9］，推測(cè)BLA-NAc環(huán)路可能參與調(diào)控大鼠丙泊酚的自身給藥行為。免疫熒光結(jié)果表明，在BLA區(qū)注射攜帶ChR2的病毒可顯示黃綠色熒光，并能成功轉(zhuǎn)染至NAc區(qū)。光遺傳學(xué)技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)瞬間激活或失活神經(jīng)元上特異性表達(dá)的ChR2，即給光時(shí)通道蛋白打開(kāi)，不給光時(shí)通道蛋白關(guān)閉［20］。本研究中，病毒注射6周后再給予藍(lán)光刺激，以便有足夠的時(shí)間進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染和通道蛋白表達(dá)。在第15天大鼠自身給藥行為測(cè)試期間，通過(guò)光纖在丙泊酚依賴大鼠NAc區(qū)給予藍(lán)光刺激，可使BLA區(qū)和NAc區(qū)攜帶ChR2的神經(jīng)元興奮，從而實(shí)現(xiàn)興奮BLA-NAc環(huán)路的作用。本研究結(jié)果表明，興奮BLA-NAc環(huán)路可顯著增加大鼠丙泊酚覓藥行為。這與文獻(xiàn)［11］報(bào)道的興奮BLA-NAc環(huán)路可促進(jìn)小鼠天然獎(jiǎng)賞行為的結(jié)論相一致。

近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)，AMPAR在線索誘導(dǎo)的藥物成癮行為中起重要作用［21-22］。AMPAR是離子型谷氨酸受體的一種，其中GluA1和GluA2蛋白是構(gòu)成AMPAR的重要亞基，并在藥物成癮的調(diào)控機(jī)制中起關(guān)鍵作用［23］。研究表明，嗎啡依賴的大鼠表現(xiàn)為NAc內(nèi)GluA1蛋白表達(dá)水平增高［24］。另外，ip給予糖原合成酶激酶3拮抗劑可促進(jìn)小鼠酒精自身給藥行為，并伴隨NAc內(nèi)GluA2蛋白表達(dá)水平增高［25］。本研究發(fā)現(xiàn)，丙泊酚依賴大鼠GluA1和GluA2蛋白表達(dá)水平顯著增高，表明NAc內(nèi)GluA1和GluA2蛋白可能參與大鼠丙泊酚依賴的調(diào)控機(jī)制，而具體的調(diào)控機(jī)制還需要進(jìn)一步研究。有研究報(bào)道，可卡因依賴大鼠NAc區(qū)GluA1和GluA2蛋白表達(dá)減少［26］，這與本研究中丙泊酚依賴大鼠GluA1和GluA2蛋白表達(dá)增高的實(shí)驗(yàn)結(jié)果似乎是矛盾的。另有研究表明，神經(jīng)元GluA1蛋白增加或GluA2蛋白減少均可誘導(dǎo)NAc內(nèi)神經(jīng)元鈣滲透性AMPAR表達(dá)水平的增高，而鈣滲透性AMPAR具有高電導(dǎo)鈣滲透性，可誘發(fā)長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)形成，進(jìn)而促進(jìn)藥物的濫用和依賴［21］。因此推測(cè)，丙泊酚可能主要通過(guò)增加NAc區(qū)GluA1蛋白表達(dá)誘導(dǎo)鈣滲透性AMPAR表達(dá)水平增高，從而促進(jìn)大鼠覓藥行為；而可卡因可能主要通過(guò)減少NAc區(qū)GluA2蛋白表達(dá)誘導(dǎo)鈣滲透性AMPAR表達(dá)水平增高，從而促進(jìn)藥物依賴，這可能是產(chǎn)生上述矛盾的原因之一。NAc在長(zhǎng)期高頻刺激下可引發(fā)神經(jīng)元Ca2+內(nèi)流增加，激活CaMKⅡ相關(guān)通路促進(jìn)神經(jīng)元細(xì)胞AMPAR表達(dá)增加，進(jìn)而誘發(fā)神經(jīng)元之間長(zhǎng)時(shí)程增強(qiáng)形成，促使藥物濫用和依賴［27-28］。研究表明，在NAc注射AMPAR拮抗劑可減少大鼠線索誘導(dǎo)的可卡因自身給藥行為［29］，這與本研究發(fā)現(xiàn)的NBQX在NAc內(nèi)給藥可顯著減少線索誘導(dǎo)的大鼠丙泊酚覓藥行為相一致，提示NAc區(qū)AMPAR參與丙泊酚精神依賴性的調(diào)控機(jī)制。此外，NAc區(qū)可接收整合來(lái)自皮質(zhì)邊緣系統(tǒng)輸入的信息。研究報(bào)道，這些輸入的信息可通過(guò)調(diào)控NAc內(nèi)AMPAR水平介導(dǎo)大鼠可卡因覓藥行為［28］。本研究結(jié)果表明，興奮BLA-NAc環(huán)路可以加劇丙泊酚依賴大鼠的丙泊酚覓藥行為，并改善NAc區(qū)給予NBQX對(duì)丙泊酚依賴大鼠覓藥行為的抑制作用，而在ChR2缺失的情況下，僅有eYFP表達(dá)不會(huì)影響NBQX對(duì)大鼠丙泊酚覓藥行為的抑制作用。提示BLA-NAc環(huán)路在大鼠丙泊酚依賴中起著重要作用，該作用可能由NAc區(qū)AMPAR介導(dǎo)。

綜上所述，大鼠丙泊酚依賴可能與NAc區(qū)GluA1蛋白表達(dá)增高有關(guān)，并且興奮BLA-NAc環(huán)路可增加大鼠丙泊酚的自身給藥行為，其機(jī)制可能與NAc區(qū)AMPAR的水平有關(guān)。本研究主要聚焦在大鼠丙泊酚成癮的誘發(fā)和維持階段，而丙泊酚復(fù)吸行為的機(jī)制尚待進(jìn)一步研究。