脯氨酸羥化酶抑制劑FG-4592抑制脂多糖誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)

阮倩倩，趙 名，耿亞楠，胡 月，史子畢，朱玲玲，侯筱宇

（1.徐州醫(yī)科大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)研究中心，江蘇 徐州 221004；2.軍事科學(xué)院軍事醫(yī)學(xué)研究院軍事認知與腦科學(xué)研究所，北京 100850；3.中國藥科大學(xué)天然藥物活性組分與藥效國家重點實驗室，江蘇 南京 211198）

神經(jīng)炎癥是指以中樞神經(jīng)系統(tǒng)為主的炎癥反應(yīng)，參與多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展，如缺血性卒中、細菌感染、創(chuàng)傷性腦損傷和神經(jīng)退行性疾病等［1-2］。星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中數(shù)量最多的一類細胞。生理狀態(tài)下，星形膠質(zhì)細胞與神經(jīng)元之間密切聯(lián)系，在調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育、突觸傳遞、信息處理與信號傳遞及神經(jīng)和突觸的可塑性等方面發(fā)揮重要作用；病理狀態(tài)下，星形膠質(zhì)細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榉磻?yīng)性星形膠質(zhì)細胞，不但喪失對神經(jīng)元的保護功能，而且會加劇損傷［3-5］。因此，抑制星形膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥的發(fā)生和發(fā)展對治療相關(guān)疾病具有重要意義。

低氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia-inducible factor-1，HIF-1）是細胞感知低氧信號的關(guān)鍵蛋白，其表達水平受脯氨酸羥化酶（proline hydroxylase，PHD）調(diào)控，小分子PHD抑制劑可通過PHD/HIF-1通路參與血管發(fā)生、能量代謝和細胞存活等，如促進紅細胞和血管的發(fā)生及抗低氧性組織損傷等。FG-4592屬于喹啉及其衍生物類PHD抑制劑，目前已被琺博進/安斯泰來/阿斯利康（FibroGen/Astellas/AstraZeneca）3家公司聯(lián)合開發(fā)成口服藥物羅沙司他（roxadustat），用于治療慢性腎病引起的貧血［6］。本研究利用脂多糖（lipopolysaccharides，LPS）誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞系C8-D1A細胞和小鼠原代星形膠質(zhì)細胞建立炎癥模型，評價FG-4592對神經(jīng)炎癥的影響，并對其分子機制進行初步探討。

1 材料與方法

1.1 藥物、試劑和主要儀器

FG-4592，純度為99.95%，美國MedChemEx?press公司，以DMSO配制成濃度20 mmol·L-1的母液備用。CCK-8試劑盒，日本同仁化學(xué)研究所；Trizol，美國Thermo-Fisher公司；實時定量多聚酶鏈反應(yīng)（quantitative real-time polymerase chain reaction，RT-qPCR）反應(yīng)預(yù)混液ChamQ TM SYBR qPCR Master Mix和逆轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScriptⅢRT SuperMix for qPCR，南京諾唯贊生物科技股份有限公司；Laemmli樣品緩沖液，美國Bio-Rad公司；BCA蛋白定量試劑盒，北京普利萊基因技術(shù)有限公司；Hank′s液、DMEM和LPS，美國Sigma-Adrich公司；胎牛血清，中國ExCell Bio公司；兔抗小鼠磷酸化NF-κB抑制因子α（phosphorylated inhibitor of NF-κB α，p-IκBα）單克隆抗體（2859S）、兔抗小鼠p-P65單克隆抗體（3033S）、辣根過氧化酶標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG抗體（7076S）和山羊抗兔IgG抗體（7074S），美國Cell Signaling Technology公司。

細胞培養(yǎng)箱和酶標(biāo)儀（MULTISKAN GO），美國Thermo Fisher Scientific公司；超凈工作臺，北京亞太科隆儀器技術(shù)有限公司；倒置熒光顯微鏡（IX70），日本Olympus公司；電泳儀（Mini-protean）、電轉(zhuǎn)儀（Mini-protean）和熒光qPCR儀（CFX96），美國Bio-Rad公司；化學(xué)成像發(fā)光儀（Tanon4600），上海天能科技有限公司；超微量分光光度計（UV5），美國METTLER TOLEDO公司。

1.2 原代小鼠星形膠質(zhì)細胞的分離和處理

新生1 d的C57BL/6小鼠，購自維通利華公司，動物許可證號：SCXK（京）2016-0006，經(jīng)75%乙醇消毒后移至超凈臺內(nèi)，眼科剪剪開頭皮和頭骨，小心取出全腦，解剖鏡下去除腦膜，剝離出雙側(cè)大腦皮質(zhì)放置于預(yù)冷的Hank′s液中，用眼科剪剪成小塊，加0.25%胰蛋白酶置于37℃孵箱消化15 min，而后加入完全培養(yǎng)液（95%DMEM+10%胎牛血清）終止消化，1379×g離心5 min，棄上清，用完全培養(yǎng)液重懸，靜置3 min，吸去上層已經(jīng)離散的細胞懸液，用300目篩網(wǎng)過篩。下層尚未離散的組織團塊再次加入完全培養(yǎng)液吹打重懸和過篩，如此重復(fù)3～4次后將細胞懸液移入培養(yǎng)瓶，置37℃，5%CO2飽和濕度培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)。24 h后換全液，而后根據(jù)細胞生長狀態(tài)和培養(yǎng)液顏色變化程度，每2～3 d半量換液1次。待星形膠質(zhì)細胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部，置37℃搖床振搖30 min，棄上層培養(yǎng)液（內(nèi)含小膠質(zhì)細胞），以此獲得星形膠質(zhì)細胞。

將原代小鼠星形膠質(zhì)細胞分為細胞對照組、FG-4592組、LPS模型組和LPS+FG-4592組。LPS+FG-4592 組 先加入 FG-4592 40 μmol·L-1處理 1 h，再加入 LPS 100 μg·L-1共同處理 6 h；FG-4592組加入FG-4592 40 μmol·L-1處理7 h；LPS模型組加入LPS 100 μg·L-1處理6 h。

1.3 C8-D1A細胞培養(yǎng)

C8-D1A細胞為來源于小鼠腦組織、高度純化的具有星形膠質(zhì)細胞特性的克隆細胞系，購自武漢大學(xué)中國典型培養(yǎng)物保藏中心。細胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液中，在37℃，5%CO2培養(yǎng)箱中飽和濕度條件下常規(guī)培養(yǎng)，每2～3 d傳代或換液1次。

1.4 CCK-8法檢測C8-D1A細胞存活率

將生長良好的C8-D1A細胞用胰酶消化、計數(shù)，以每孔5000個細胞接種于96孔板，置37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，將細胞分為細胞對照組和FG-4592組，每組設(shè)3復(fù)孔，分別加入FG-4592 0（細胞對照組），10，20和40 μmol·L-1處理細胞6 h。另設(shè)空白對照組，只加細胞培養(yǎng)基和CCK-8試劑，不接種細胞。根據(jù)CCK-8試劑盒說明書，每孔加入10 μL CCK-8試劑，置細胞培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)孵育1 h后，用酶標(biāo)儀測450 nm吸光度（A450nm）值，計算各組細胞存活率。細胞存活率（%）=（實驗組A450nm-空白組A450nm）/（細胞對照組A450nm-空白組A450nm）×100%。實驗重復(fù)3次。

1.5 RT-qPCR檢測C8-D1A細胞HIF-1 α蛋白靶基因和炎癥因子相關(guān)基因mRNA表達水平

C8-D1A細胞按1.4分組處理，檢測細胞HIF-1α蛋白靶基因葡萄糖轉(zhuǎn)運蛋白1（glucose transporter type 1，Glut 1）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endo?thelial growth factor，VEGF）和促紅細胞生成素（erythropoietin，EPO）mRNA表達水平；C8-D1A細胞除LPS+FG-4592組FG-4592劑量為10，20和 40 μmol·L-1外，其他組藥物處理同 1.2，檢測C8-D1A細胞炎癥因子白細胞介素6（interleukin-6，IL-6），IL-1β和腫瘤壞死因子 α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）mRNA表達水平；原代小鼠星形膠質(zhì)細胞按1.2分組處理，檢測細胞HIF-1α，IL-1β，IL-6和TNF-αmRNA表達水平。

Trizol法提取細胞總RNA，采用紫外可見分光光度計進行定量。取1 μg總RNA，采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒HiScriptⅢRT SuperMix for qPCR進行cDNA合成反應(yīng)，然后在熒光qPCR儀上采用ChamQ TM SYBR qPCR Master Mix反應(yīng)體系進行qPCR反應(yīng)。目的基因引物序列如表1所示。PCR程序參照試劑盒提供的兩步法進行：95℃30 s，95℃5 s，60℃30 s共40個循環(huán)。各組實驗重復(fù)3次。以β肌動蛋白作為內(nèi)參基因，采用2-ΔΔCt法計算目的基因的相對表達水平。

1.6 Western印跡法檢測C8-D1A細胞HIF-1 α，TLR4，p--I κB α和p--P65蛋白表達水平

C8-D1A細胞分組和藥物處理同1.4，原代小鼠星形膠質(zhì)細胞分組和藥物處理同1.2，檢測HIF-1α蛋白表達水平；C8-D1A細胞分組和藥物處理同1.2，檢測 Toll樣受體 4（Toll like receptor 4，TLR4）、p-IκBα和p-P65蛋白表達水平。收取各組C8-D1A細胞，用Laemmli樣品緩沖液充分裂解后煮沸變性10 min；然后16 543×g、4℃離心10 min，取上清，即為全細胞裂解液。BCA法進行蛋白定量。取20 μg蛋白進行SDS-PAGE電泳。PVDF膜濕轉(zhuǎn)印后，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h。TBST洗滌3次，每次10 min。分別加入抗HIF-1α，TLR4，p-IκBα，p-P65和β肌動蛋白抗體（一抗）（均1∶1000稀釋）4℃孵育過夜。TBST洗滌3次后加入相應(yīng)二抗（1∶2000）室溫孵育1 h，TBST再次洗滌3次后進行ECL顯影。用Image J軟件分析蛋白條帶的積分吸光度，以目標(biāo)蛋白與內(nèi)參蛋白積分吸光度值的比值反映目標(biāo)蛋白相對表達水平。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

用GraphPad Prism 8.0軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果數(shù)據(jù)均用±s表示，組間差異使用單因素方差分析及Dunnettt檢驗。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 FG-4592對C8-D1A細胞存活率的影響

CCK-8檢測結(jié)果（圖1）顯示，與細胞對照組比較，F(xiàn)G-4592 10，20和40 μmol·L-1組C8-D1A細胞存活率均無統(tǒng)計學(xué)差異，提示FG-4592 10，20和40 μmol·L-1不影響C8-D1A細胞存活。

Fig.1 Effect of FG-4592 on C8-D1A cell viability by CCK-8 assay.C8-D1A cells were treated with FG-4592 for 6 h.±s，n=3.

2.2 FG-4592對C8-D1A細胞HIF-1 α蛋白表達水平的影響

Western印跡結(jié)果（圖2）顯示，與細胞對照組比較，F(xiàn)G-4592 10，20 和 40 μmol·L-1組 C8-D1A細胞HIF-1α蛋白水平均顯著上升（P<0.01）。

Tab.1 Sequences of primers for qPCR

Fig.2 Effect of FG-4592 on expression of HIF-1 α protein in C8-D1A cells by Western blotting.See Fig.1 for the cell treatment.B was the quantitative result of A.IA：integrated absorbance.±s，n=3. ＊＊P<0.01，compared with cell control group.

2.3 FG-4592對C8-D1A細胞HIF-1 α蛋白靶基因Glut1，VEGF和EPO mRNA表達水平的影響

RT-qPCR結(jié)果（圖3）顯示，與細胞對照組相比 ，除 FG-4592 10 μmol·L-1組 C8-D1A 細 胞 中EPO mRNA表達水平無顯著變化外，F(xiàn)G-4592 10，20和40 μmol·L-1組C8-D1A細胞中Glut1，VEGF和EPO mRNA表達水平均顯著升高（P<0.01），表明FG-4592能激活HIF-1α蛋白靶基因的表達。

Fig.3Effect of FG-4592 on mRNA levels of Glut1，VEGF and EPO in C8-D1A cells by RT-qPCR.See Fig.1 for the cell treatment.±s，n=3.＊＊P<0.01，compared with cell con?trol group.

2.4 FG-4592對LPS誘導(dǎo)C8-D1A細胞炎癥因子IL-6，IL-1 β和TNF- α mRNA表達水平的影響

如圖4顯示，與細胞對照組比較，LPS 100 μg·L-1組C8-D1A細胞炎癥因子IL-6，IL-1β和TNF-α mRNA表達水平顯著上升（P<0.01）。與LPS模型組相比，LPS+FG-4592 10，20和40 μmol·L-1組的IL-6和IL-1β mRNA表達水平顯著下降（P<0.01），10和40 μmol·L-1組TNF-α mRNA表達水平顯著下降（P<0.05，P<0.01）。提示FG-4592對LPS誘導(dǎo)的C8-D1A細胞炎癥具有抑制作用。

Fig.4 Effect of FG-4592 on mRNA levels of IL-6，IL-1 β and TNF- α in C8-D1A cells induced by lipopolysac?charides（LPS）by RT-qPCR.C8-D1A cells in FG-4592 group were treated with FG-4592 40 μmol·L-1for 7 h；C8-D1A cells in LPS model group were treated with LPS 100 μg·L-1for 6 h；C8-D1A cells in LPS+FG-4592 group were treated with FG-4592 10，20 and 40 μmol·L-1for 1 h，before co-incubation with LPS 100 μg·L-1 for 6 h.x ± s，n=3. ＊＊P<0.01，compared with cell control group；#P<0.05，##P<0.01，compared with LPS group.

2.5 FG-4592對LPS誘導(dǎo)的原代小鼠星形膠質(zhì)細胞HIF-1 α蛋白和mRNA水平及炎癥因子IL-6，IL-1 β和TNF- α mRNA水平的影響

與細胞對照組相比，F(xiàn)G-4592組原代小鼠星形膠質(zhì)細胞HIF-1α蛋白水平顯著上升（P<0.01，圖5A），而mRNA水平變化無顯著變化（圖5B），提示FG-4592主要在蛋白水平上激活HIF-1信號通路。

與細胞對照組相比，LPS模型組原代小鼠星形膠質(zhì)細胞炎癥細胞因子IL-6，IL-1β和TNF-α mRNA表達水平顯著上升（P<0.01，圖5C-E）。與LPS模型組相比，LPS+FG-4592組的IL-6，IL-1β和TNF-α mRNA表達水平顯著下降（P<0.01，圖5C-E）。提示FG-4592對LPS誘導(dǎo)的原代小鼠星形膠質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)具有抑制作用。

Fig.5 Effect of FG-4592 on expression of HIF-1 α protein（A）and mRNA levels of HIF-1 α（B），IL-6（C），IL-1 β（D）and TNF- α（E）in primary astrocytes induced by LPS.See Fig.4 for the cell treatment，except that the concentration of FG-4592 was 40 μmol·L-1.A was detected by Western blotting.A2 was the quantitative result of A1.B-E were detected by RT-qPCR.±s，n=3.＊＊P<0.01，compared with cell control group；##P<0.01，compared with LPS group.

2.6 FG-4592對LPS誘導(dǎo)的C8-D1A細胞中TLR4，p-I κB α和p-P65蛋白表達水平的影響

Western印跡結(jié)果（圖6）顯示，與細胞對照組相比，LPS模型組C8-D1A細胞TLR4，p-IκBα和p-P65蛋白表達水平顯著上升（P<0.05，P<0.01）。相對于LPS模型組，LPS+FG-4592組C8-D1A細胞TLR4，p-IκBα和p-P65蛋白表達水平顯著下降（P<0.05，P<0.01）。

Fig.6Effect of FG-4592 on protein expressions of TLR4，phosphorylated inhibitor of NF- κB α（p-I κB α）and p-P65 in C8-D1A cells induced by LPS by Western blotting.See Fig.5 for the cell treatment.B was the quantita?tive result of A1 and A2.±s，n=3.＊P<0.05，＊＊P<0.01，compared with cell control group；#P<0.05，##P<0.01，compared with LPS group.

3 討論

星形膠質(zhì)細胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中功能最多樣化的膠質(zhì)細胞，其在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用受到越來越多的關(guān)注。其中，作為大腦中的免疫細胞，星形膠質(zhì)細胞在調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)方面發(fā)揮著重要作用［7］。例如，星形膠質(zhì)細胞可通過多巴胺D2受體調(diào)控神經(jīng)炎癥，進而調(diào)控帕金森病進展［8］。在缺血性卒中疾病模型中，星形膠質(zhì)細胞釋放多種促炎因子（如TNF-α和IL-1β），參與腦缺血-再灌注損傷；而白藜蘆醇（pterostilbene）可通過抑制星形膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥改善缺血性腦損傷［9］。趙晶晶等［10］研究發(fā)現(xiàn)，白藜蘆醇可通過下調(diào)星形膠質(zhì)細胞炎癥因子TNF-α和IL-6的水平，對小鼠腦缺血損傷產(chǎn)生神經(jīng)保護作用。星形膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥也與抑郁癥的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，IL-1β受體拮抗劑可顯著改善小鼠的抑郁樣行為［11］。因此，抑制星形膠質(zhì)細胞介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)對多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的防治具有重要意義。

在臨床上，F(xiàn)G-4592已用于治療慢性腎病性貧血，其分子機制是通過抑制PHD活性激活HIF-1通路，促進EPO生成，增加血紅蛋白含量，從而發(fā)揮抗貧血作用［12］。此外，F(xiàn)G-4592在其他方面的作用也受到了廣泛關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，在順鉑誘導(dǎo)的小鼠急性腎損傷模型中，提前48 h每天ip給予FG-4592 10 mg·kg-1可緩解模型小鼠腎組織 IL-6、IL-1β、TNF-α、單核細胞趨化蛋白1和環(huán)氧合酶2等炎癥因子水平的升高，抑制炎癥反應(yīng)，從而改善急性腎損傷［13］。在LPS誘導(dǎo)的MH-S細胞和MLE-12細胞炎癥模型中，采用 FG-4592 25 μmol·L-1處理細胞可顯著降低LPS誘導(dǎo)的促炎細胞因子IL-6，IL-1β和TNF-α的升高，從而減輕細胞損傷［14］。此外，F(xiàn)G-4592可通過抑制炎癥預(yù)防缺血/再灌注引起的腎損傷［15］。已有研究表明，LPS可誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)［16-17］。本研究結(jié)果顯示，F(xiàn)G-4592對LPS誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)具有明顯的抑制作用，提示FG-4592在抑制炎癥方面也具有潛在的應(yīng)用價值。

Glut1，VEGF和EPO是HIF-1信號通路經(jīng)典的下游靶基因［18］，HIF-1信號通路激活時可誘導(dǎo)這些基因的轉(zhuǎn)錄表達，因此其mRNA可作為HIF-1信號通路激活的標(biāo)志物。本研究結(jié)果表明，F(xiàn)G-4592處理后，C8-D1A細胞HIF-1α蛋白水平以及Glut1，VEGF和EPO mRNA水平均顯著升高，提示FG-4592可抑制C8-D1A細胞內(nèi)PHD活性，并激活HIF-1信號通路。LPS是常用的體內(nèi)外炎癥反應(yīng)激活劑，其與細胞膜上的TLR4結(jié)合后激活胞漿中的IκB 激酶（IκB kinase，IKK）復(fù)合體［19-20］。IKK 復(fù)合體分別磷酸化激活下游IκBα和P65/P50蛋白，p-IκBα經(jīng)蛋白酶體通路降解，且p-IκBα對P65/P50蛋白復(fù)合體的抑制效應(yīng)被阻斷［21-23］。p-P65/P50蛋白復(fù)合體隨后轉(zhuǎn)移入核，與靶基因（如TNF-α，IL-6和IL-1β）相應(yīng)的啟動子結(jié)合，促進其轉(zhuǎn)錄表達［24］。因此，本研究對LPS誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)后的TLR4蛋白水平及FG-4592預(yù)處理后TNF-α，IL-6和IL-1β mRNA水平進行檢測。實驗結(jié)果顯示，LPS可誘導(dǎo)C8-D1A細胞TLR4蛋白水平上升；且在C8-D1A細胞和原代小鼠星形膠質(zhì)細胞內(nèi)，F(xiàn)G-4592預(yù)處理均能抑制LPS誘導(dǎo)的細胞炎癥反應(yīng)，表現(xiàn)為逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的炎癥因子IL-6，IL-1β和TNF-α mRNA水平及p-IκBα和p-P65蛋白表達水平的升高，表明FG-4592能通過激活HIF-1通路抑制星形膠質(zhì)細胞炎癥反應(yīng)。