超聲診斷對木瓜蛋白酶致早期兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型可行性研究

陸瑞娜，梁子聰

(1.黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校附屬醫(yī)院，貴州 都勻 558000；2.黔南民族醫(yī)學(xué)高等?？茖W(xué)校，貴州 都勻 558013)

膝骨關(guān)節(jié)炎(knee osteoarthritis，KOA)是臨床常見的骨關(guān)節(jié)疾病，其疾病機理是炎癥所致膝關(guān)節(jié)滑膜、軟骨及其周圍組織的退行性變[1]。炎性因子在膝關(guān)節(jié)軟組織和軟骨中的表達是本病的主要特征，例如炎性因子IL-1、IL-6、TNF-α、金屬蛋白酶等[2-5]。超聲作為一種無創(chuàng)、無輻射的診斷手段在臨床腹腔臟器疾病、體表腫物等應(yīng)用廣泛。但超聲在動物骨關(guān)節(jié)實驗的應(yīng)用報道較少，本實驗比較炎性因子、關(guān)節(jié)病理變化以探討超聲診斷在KOA早期病變中的診斷效能。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器 木瓜蛋白酶(北京索萊寶)；MMP-3試劑盒(北京誠林)；JA10002型電子天平(上海精天)；MR-96A型酶標儀(深圳邁瑞)；IU22型超聲(荷蘭飛利浦)；ASP300 S型全封閉式組織脫水機、RM2265型全自動輪轉(zhuǎn)式切片機、HI1210型攤片機、DM750型光學(xué)顯微鏡(德國Leica)。

1.2 動物分組與造模 普通級六月齡日本長耳白兔32只，♀，體質(zhì)量(3.0±0.5)kg，由長沙天勤生物技術(shù)有限公司提供，許可證號：SCXK(湘)2014-0010。按隨機法將實驗動物分成2組，分別為對照組、造模組，每組16只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，普通飲食。除正常組外，采用木瓜蛋白酶關(guān)節(jié)腔內(nèi)注射法建立兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型。

1.3 觀察指標

1.3.1 血清MMP-3含量的檢測 兩組兔分別于造模后第2、4周于兔耳緣靜脈取血。血清標本采集：所得血液注入無菌EP管中離心(3 000 r/min，4℃)10 min，吸取上清液后置于-20℃冰箱中待測。嚴格按照說明書操作，用酶標儀檢測兩組兔血清MMP-3含量。

1.3.2 病理學(xué)評分 兩組兔分別于造模后2、4周處死，每組各8只，取下各組兔右側(cè)膝關(guān)節(jié)關(guān)節(jié)軟骨及滑膜軟組織標本，以4%多聚甲醛溶液中固定，10%EDTA脫鈣2周，石蠟包埋，切片，HE染色，封片，采用光學(xué)顯微鏡觀察，并按改良Mankin's評分標準[6]進行評分。

1.3.3 超聲檢查 造模后第2、4周按3.5 ml/kg劑量腹腔注射10%水合氯醛溶液麻醉對實驗兔進行麻醉。實驗兔以平臥位固定于操作臺，膝關(guān)節(jié)采取自然半屈曲位，剔除膝關(guān)節(jié)毛發(fā)。超聲觀察膝關(guān)節(jié)滑膜、關(guān)節(jié)間隙、軟骨等情況，在彩色多普勒血流顯像(CDFI)模式，觀察滑膜內(nèi)血流信號分布。參照文獻方法[7]，對滑膜血流灌注進行分級評價。具體分級標準如下：0級，滑膜內(nèi)無血流信號；1級，增生的滑膜內(nèi)見點狀彩色血流信號；2級，增生的滑膜內(nèi)見條狀彩色血流信號，充盈面積不到滑膜面積的50%；3級，增生的滑膜內(nèi)見條狀豐富彩色血流信號，充盈面積為滑膜面積50%以上。

1.3.4 免疫組化觀察膝關(guān)節(jié)軟骨II型膠原、骨形態(tài)發(fā)生蛋白的表達的比較 切片脫水后，檸檬酸修復(fù)抗原；滴加阻斷劑孵育10～30 min；滴加一抗，4℃孵育過夜，滴加二抗，37℃孵育30 min，滴加DAB顯色，脫水、透明、中性樹膠封片。置于40倍顯微鏡下，每例取軟骨退變區(qū)隨機選取8個視野，測定陽性顆粒平均灰度值?

2 結(jié)果

2.1 兩組兔血清MMP-3含量及改良Mankin's評分結(jié)果的比較 由表1可知，與正常組比較，模型組兔在造模2、4周時血清MMP-3的含量及改良Mankin's評分明顯增高(P<0.05)。

表1 兩組兔不同造模時間節(jié)點血清MMP-3含量、改良Mankin's評分(分)結(jié)果的比較

2.2 兩組兔超聲檢查的比較 由表2可知，與正常組比較，模型組兔在造模2、4周時超聲SZKUDLAREK評分明顯增高(P<0.05)。

表2 兩組兔不同造模時間節(jié)點超聲檢測結(jié)果的比較

2.3 免疫組化觀察膝關(guān)節(jié)軟骨II型膠原、骨形態(tài)發(fā)生蛋白的表達的比較 由表3可知，與正常組比較，模型組兔在造模2、4周時膝關(guān)節(jié)軟骨II型膠原相對表達量明顯下降、而骨形態(tài)發(fā)生蛋白的相對表達量明顯增高(P<0.05)。

2.4 Spearman相關(guān)性分析結(jié)果 造模2周時，血清MMP-3、病理學(xué)評分、膝關(guān)節(jié)軟骨II型膠原、骨形態(tài)發(fā)生蛋白的表達與超聲學(xué)評分的Spearman相關(guān)性檢驗rS值分別為0.662、0.685、0.698、0.784(P<0.05)；造模4周時，Spearman相關(guān)性檢驗rS值分別為0.762、0.752、0.717、0.802(P<0.05)。分析結(jié)果顯示：MMP-3、病理學(xué)評分、膝關(guān)節(jié)軟骨II型膠原、骨形態(tài)發(fā)生蛋白的表達、超聲評分均具有相關(guān)性。

表3 兩組兔不同造模時間節(jié)點免疫組化觀察膝關(guān)節(jié)軟骨II型膠原、骨形態(tài)發(fā)生蛋白的表達結(jié)果的比較

3 討論

膝骨關(guān)節(jié)炎是一種膝關(guān)節(jié)常見的以慢性滑膜炎癥、軟骨損傷退化、軟骨下骨硬化及骨贅形成為特征的退行性疾病，其臨床癥狀主要是膝關(guān)節(jié)疼痛及活動功能障礙。根據(jù)研究調(diào)查，在全球范圍內(nèi)超過65歲的人群中至少有50%遭受該疾病的困擾[8-9]。而中國每年在骨關(guān)節(jié)炎的醫(yī)療費用支出在逐年增加[10]。目前對膝骨關(guān)節(jié)炎的研究，該疾病的早期干預(yù)治療有利于減輕關(guān)節(jié)退變，減少后期膝關(guān)節(jié)手術(shù)概率，對減輕患者痛苦，降低醫(yī)療費用具有不可忽視的影響。研究發(fā)現(xiàn)，氧自由基、MMP- 3等多種活性因子使得軟骨細胞老化、凋亡，軟骨基質(zhì)降解，誘導(dǎo)KOA的發(fā)生發(fā)展[11-12]。其中，MMP- 3在KOA軟骨細胞中表達顯著增加，隨著病變加重更加明顯[10]。有研究報道，KOA患者合成保護性因子Ⅱ型膠原、蛋白聚糖等軟骨基質(zhì)顯著減少，導(dǎo)致軟骨細胞形成障礙，而軟骨細胞自我修復(fù)使得BMP的表達上升，所以II型膠原減少，骨形態(tài)發(fā)生蛋白增高是骨關(guān)節(jié)炎發(fā)生的標志[13-15]。

木瓜蛋白酶是已知和被證實的可誘導(dǎo)蛋白多糖分解代謝的介質(zhì)，可造成關(guān)節(jié)滑膜炎癥及關(guān)節(jié)軟骨退變[16]。Shen等[17]研究報道，在兔左側(cè)膝關(guān)節(jié)腔注射0.5 ml濃度為1.6%的木瓜蛋白溶液第1周后，病理學(xué)檢查發(fā)現(xiàn)膝關(guān)節(jié)軟骨內(nèi)蛋白多糖含量測定較健側(cè)有所降低的，達到第4周時蛋白多糖減少最為明顯；并且正常關(guān)節(jié)軟骨細胞明顯減少，細胞外基質(zhì)逐漸出現(xiàn)纖維化，為早期軟骨退變的表現(xiàn)。陳達等[18]同樣使用木瓜蛋白酶注射方法進行造模，第4周后肉眼可見膝關(guān)節(jié)腔滑膜增生變厚，軟骨顏色灰黃、變硬，關(guān)節(jié)面軟骨變薄、粗糙、光澤度降低，脛骨平臺及股骨髁軟骨廣泛磨損，脛骨平臺內(nèi)側(cè)緣見骨贅形成，光學(xué)顯微鏡下組織結(jié)構(gòu)紋理模糊，免疫組化Ⅱ型膠原表達量降低。

炎癥因子在動物造模過程中不利于動態(tài)評價和形態(tài)觀察，而DR、CT等影像學(xué)難以觀察軟骨、滑膜等軟組織。超聲不但可以觀察關(guān)節(jié)腔的滑膜、關(guān)節(jié)腔、軟骨等變化，而且檢查時不額外增加關(guān)節(jié)創(chuàng)傷[19-21]。于靜等[22]研究高頻超聲對類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎早期的敏感程度，以病理為標準，發(fā)現(xiàn)與 MRI 比較，超聲在檢測積液上優(yōu)于MRI，在檢測滑膜上，超聲較 MRI 更敏感、簡便，并且高頻超聲還能清楚觀察類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎大鼠早期滑膜的形態(tài)和位置。因此，超聲可作為觀察滑膜病變一種較靈敏的影像學(xué)檢查方法，且與其他影像學(xué)檢查結(jié)合起來，可以提高對RA 疾病的早期診斷率。本實驗結(jié)果顯示，與正常組比較，模型組兔在造模2、4周時血清MMP-3的含量明顯增高(P<0.05)，改良Mankin's評分標準的含量明顯增高，膝關(guān)節(jié)軟骨II型膠原相對表達量明顯下降、而骨形態(tài)發(fā)生蛋白的相對表達量明顯增高(P<0.05)，證實動物見模成功，而造模2、4周時超聲SZKUDLAREK評分明顯增高。Spearman相關(guān)性檢驗結(jié)果顯示，造模2、4周時，血清MMP-3、病理學(xué)評分、膝關(guān)節(jié)軟骨II型膠原、骨形態(tài)發(fā)生蛋白的表達與超聲學(xué)評分呈相關(guān)性(P<0.05)，說明超聲檢查結(jié)果與血清炎性因子、關(guān)節(jié)軟骨組織因子表達及病理評分結(jié)果呈一致性。綜上所述，超聲檢查可以作為木瓜蛋白酶致早期兔膝骨關(guān)節(jié)炎模型有效的、無創(chuàng)的檢查方式。