基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討絡(luò)風(fēng)寧3號方治療心律失常的作用機(jī)制

馬梁，王保福，王顯,2

心律失常屬于中醫(yī)“心悸”的范疇，指心臟電生理沖動在產(chǎn)生或傳導(dǎo)過程中發(fā)生異常，以心慌、胸悶、乏力，甚至?xí)炟蕿榕R床表現(xiàn)的心律、心率異常的疾病。長期心律失?？梢鹦牧λソ?、心肌梗死、腦卒中等疾病，嚴(yán)重危害個人生存質(zhì)量[1]。因此，如何發(fā)揮中醫(yī)藥對心律失常的防治作用一直是中醫(yī)藥研究亟待解決的問題。王顯教授結(jié)合絡(luò)病學(xué)理論[2]認(rèn)為，“絡(luò)風(fēng)內(nèi)動”為心律失常重要發(fā)病機(jī)制之一，多因內(nèi)外風(fēng)邪擾動心之絡(luò)脈，進(jìn)而氣血紊亂，導(dǎo)致心悸發(fā)作；且心悸起病急驟、發(fā)病時間不定、病情變化迅速等臨床表現(xiàn)與中醫(yī)“風(fēng)邪”的致病特征類似，故創(chuàng)立絡(luò)風(fēng)寧3號方從風(fēng)論治心律失常。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，絡(luò)風(fēng)寧3號方可顯著降低心律失常發(fā)生率[3,4]，其中治療房顫總體有效率達(dá)81%[4]，治療室早總體有效率達(dá)77.5%[3]，但其作用機(jī)制尚未闡明。本文通過“網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)”，分析絡(luò)風(fēng)寧3號方治療心律失常的有效成分和相關(guān)靶點(diǎn)通路，為絡(luò)風(fēng)寧3號方的臨床應(yīng)用和后續(xù)基礎(chǔ)研究提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 絡(luò)風(fēng)寧3號方化學(xué)成分的篩選在中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析平臺（TCMSP）數(shù)據(jù)庫（http://tcmspw.com/tcmsp.php）中搜索絡(luò)風(fēng)寧3號方部分中藥的有效成分（徐長卿、柴胡、黃芩、半夏、人參、五味子、三七、茯苓）。TCMSP數(shù)據(jù)庫未收錄的藥物，則在ETCM數(shù)據(jù)庫（http://www.tcmip.cn/ETCM/）（麥冬、石菖蒲）和DrugBank數(shù)據(jù)庫（https://go.drugbank.com/）（生龍齒）進(jìn)行檢索。以上三種數(shù)據(jù)庫均未收集茯神，查閱文獻(xiàn)[5]發(fā)現(xiàn)茯神與茯苓在相關(guān)成分上并無明顯差異，兩者之間存在的差異主要為有效成分含量不同，故在TCMSP數(shù)據(jù)庫中以“茯苓”代替“茯神”進(jìn)行檢索。參照藥代動力學(xué)（ADME），以口服生物利用度（OB）≥30%，類藥性（DL）≥0.18為篩選標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行篩選。將得到的有效成分統(tǒng)一在TCMSP數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行靶點(diǎn)基因預(yù)測，并通過UniProt數(shù)據(jù)庫（https://www.uniprot.org/）對獲得的靶點(diǎn)名稱進(jìn)行規(guī)范校正。將“藥物”、“化合物”、“靶點(diǎn)”相關(guān)信息導(dǎo)入Excel，整合重復(fù)的有效成分。

1.2 心律失常潛在靶點(diǎn)預(yù)測以“Arrhythmia”作為關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫（https://www.genecards.org/）中對“心律失?！卑l(fā)病相關(guān)的靶基因進(jìn)行檢索并根據(jù)相關(guān)性進(jìn)行篩選。用 R語言獲取疾病靶點(diǎn)基因與絡(luò)風(fēng)寧3號方作用靶點(diǎn)的交集，并繪制韋恩圖。

1.3 絡(luò)風(fēng)寧3號方中核心成分與核心靶點(diǎn)篩選通過Cytoscape3.7.2[6]軟件繪制“藥物-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，將篩選出來的中藥化合物所對應(yīng)靶點(diǎn)與心律失常相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行映射；使用Network Analyze插件分析網(wǎng)絡(luò)圖，比較網(wǎng)絡(luò)中各節(jié)點(diǎn)度值（Degree Centrality）、緊密中心性（Closeness Centrality），篩選出核心成分與靶點(diǎn)基因。

1.4 蛋白互作（PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析以絡(luò)風(fēng)寧3號方與心律失常的交集靶點(diǎn)為輸入內(nèi)容，在STRING11.0數(shù)據(jù)庫（https://www.string-db.org/）中進(jìn)行蛋白互作分析，選擇“種屬”為“Homo Sapiens”，設(shè)定相互作用評分（minimum required interaction score）為0.4，得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖，并導(dǎo)入Cytoscape3.7.2軟件中，利用Network Analyze進(jìn)行分析，篩選出核心靶點(diǎn)蛋白。

1.5 基因功能富集（GO）分析及生物通路（KEGG）分析利用DAVID數(shù)據(jù)庫（https://david.ncifcrf.gov/）將1.2得到的交集靶點(diǎn)進(jìn)行GO和KEGG富集分析，分別從細(xì)胞組分（cellular component，CC）、分子功能（molecular function，MF）、生物過程（biological process，BP）對這些交集靶點(diǎn)的功能進(jìn)行GO富集分析并利用R語言ggplot2繪制柱狀圖。KEGG富集分析結(jié)果根據(jù)P（Pvalue）值與基因比例（GeneRatio）值，利用R語言ggplot2繪制前20位柱狀圖及氣泡圖，進(jìn)行可視化研究。

2 結(jié)果

2.1 絡(luò)風(fēng)寧3號方中化學(xué)成分的篩選共獲得絡(luò)風(fēng)寧3號方有效活性成分1257種。其中，TCMSP數(shù)據(jù)庫中檢索到徐長卿有效成分68種、石菖蒲17種、柴胡349種、黃芩143種、半夏116種、人參190種、五味子130種、三七119種、茯神34種。在ETCM數(shù)據(jù)庫中檢索到石菖蒲有效成分17種、麥冬52種。在DrugBank數(shù)據(jù)庫中檢索到生龍齒有效成分22種。將這些化學(xué)成分進(jìn)行整合分析，按照OB和DL值進(jìn)行篩選，刪除重復(fù)值，共得到120種有效成分，其中徐長卿6種，石菖蒲4種，柴胡17種，黃芩36種，半夏13種，人參17種，麥冬4種，五味子8種，三七8種，茯神6種，生龍齒1種。部分有效成分的基本信息見表1。

表1 絡(luò)風(fēng)寧3號方中部分有效成分的基本信息

2.2 預(yù)測絡(luò)風(fēng)寧3號方治療心律失常的核心作用靶點(diǎn)在TCMSP數(shù)據(jù)庫中獲得絡(luò)風(fēng)寧3號方共239個靶點(diǎn)基因。GeneCard數(shù)據(jù)庫獲得“心律失?！睗撛诎悬c(diǎn)4035個，根據(jù)相關(guān)性（Relevance score），兩次取中位數(shù)后共篩選出1091個潛在靶點(diǎn)。如圖1所示，共獲得“絡(luò)風(fēng)寧3號方”和“心律失常”交集靶點(diǎn)82個。

圖1 絡(luò)風(fēng)寧3號方治療心律失常靶點(diǎn)Venn圖

2.3 絡(luò)風(fēng)寧3號方“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)繪制和分析通過Cytoscape3.7.2軟件繪制“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖，共有157個節(jié)點(diǎn)（82個基因靶點(diǎn)，75個有效成分節(jié)點(diǎn)），495條連線，結(jié)果見圖2。利用Network Analyze工具進(jìn)行拓?fù)浞治?，篩選出核心靶點(diǎn)基因與主要活性成分。網(wǎng)絡(luò)中平均每個活性成分和7個核心靶點(diǎn)相互關(guān)聯(lián)；平均每個核心靶點(diǎn)基因與6個活性化合物相互作用，表明絡(luò)風(fēng)寧3號方中各個有效成分之間存在協(xié)同調(diào)控，相互關(guān)聯(lián)的作用。根據(jù)Closeness Centrality及Degree Centrality值，選取前10位活性成分與靶點(diǎn)基因，結(jié)果見圖3、表2，其中活性成分為MOL000098-槲皮素（quercetin；CAS號：117-39-5）、MOL000422-山奈酚（kaempferol；CAS號：520-18-3）、MOL000173-漢黃芩素（Wogonin；CAS號：632-85-9）、MOL000358 -β-谷甾醇（b e t a-s i t o s t e r o l；C A S 號：83-46-5）、MOL004624 -Longikaurin A（CAS號：75207-67-9）等，這些主要活性成分平均作用于20個靶標(biāo)基因。圖3中靶點(diǎn)基因包含有PTGS2、PTGS1、HSP90AA1、SCN5A等，這些靶點(diǎn)基因平均影響29種活性化合物。

表2 “成分-靶點(diǎn)-靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)拓?fù)鋵W(xué)信息

圖2 絡(luò)風(fēng)寧3號方“成分-靶點(diǎn)-疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

圖3 主要有效成分-核心靶點(diǎn)基因網(wǎng)絡(luò)圖

2.4 絡(luò)風(fēng)寧3號方治療心律失常PPI網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建與分析通過STRING11.0數(shù)據(jù)庫與Cytoscape3.7.2軟件得到PPI網(wǎng)絡(luò)圖（圖4），圖中共有80個節(jié)點(diǎn)，1287條邊，平均度值為47，Degree值≥47的靶點(diǎn)共19個，如IL-6、 VEGFA 、AKT1 、TNF、 MMP9等（表3）。

表3 絡(luò)風(fēng)寧3號方治療心律失常的部分靶點(diǎn)

圖4 絡(luò)風(fēng)寧3號方治療心律失常PPI網(wǎng)絡(luò)

2.5 絡(luò)風(fēng)寧3號方治療心律失常富集分析通過DAVID數(shù)據(jù)庫，對絡(luò)風(fēng)寧3號方治療心律失常的交集靶點(diǎn)進(jìn)行富集分析，輸出富集條目一共489條，其中含有45種CC、424條BP、20類MF。通過R語言將按照富集基因數(shù)目排名前十條目進(jìn)行可視化分析（圖5）。MF方面主要涉及：蛋白結(jié)合（protein binding）、酶結(jié)合（enzyme binding）、細(xì)胞因子活性（cytokine activity）、蛋白質(zhì)激酶結(jié)合（protein kinase binding）等。BP主要涉及從炎癥反應(yīng)（inflammatory response）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)（signal transduction）、抑制細(xì)胞凋亡（negative regulation of apoptotic process）、缺氧反應(yīng)（response to hypoxia）、血管生成（angiogenesis）等。CC方面主要富集于質(zhì)膜（plasma membrane）、細(xì)胞質(zhì)（cytoplasm）、細(xì)胞膜（membrane）、線粒體（mitochondrion）等。KEGG富集分析得到共116條通路，主要包括有：PI3K-Akt信號通路（PI3K-Akt signaling pathway）、TNF信號通路（TNF signaling pathway）、MAPK信號通路（MAPK signaling pathway）、Toll樣受體信號通路（Toll-like receptor signaling pathway），根據(jù)通路包含基因數(shù)及校正后Pvalue值選取前20進(jìn)行可視化分析（圖6）。

圖5 絡(luò)風(fēng)寧3號方主要活性成分的GO富集分析

圖6 絡(luò)風(fēng)寧3號方治療心律失常KEGG富集分析氣泡圖

3 討論

現(xiàn)代醫(yī)學(xué)視角下，炎癥、氧化應(yīng)激、離子通道異常等通常為心律失常發(fā)生的主要機(jī)制[7]。而在中醫(yī)學(xué)理論體系中，心律失常發(fā)作則與內(nèi)外風(fēng)邪擾動心之絡(luò)脈，繼而絡(luò)脈不寧、氣血紊亂，這一病機(jī)密切相關(guān)[2]。從心律失常發(fā)生機(jī)制來看，炎癥、氧化應(yīng)激、離子通道的致病機(jī)制與中醫(yī)體系中“風(fēng)邪致病”有著內(nèi)在聯(lián)系。各種理化生物刺激均會引起心肌組織炎癥反應(yīng)，炎癥因子被大量釋放，通過促心肌纖維化損傷心肌結(jié)構(gòu)[8]，或引起機(jī)體產(chǎn)熱誘發(fā)心率增快，心肌缺血；或促進(jìn)氧化應(yīng)激引起鈉離子（Na+），鈣離子（Ca2+）等離子通路紊亂[9,10]導(dǎo)致心臟電傳導(dǎo)異常，引起動風(fēng)征象。絡(luò)風(fēng)寧3號方由王顯教授基于絡(luò)風(fēng)內(nèi)動理論并結(jié)合其臨床經(jīng)驗創(chuàng)立，全方以徐長卿為君藥，石菖蒲、柴胡、黃芩、半夏為臣，佐藥選用麥冬、五味子、人參、三七，使藥選用茯神、生龍齒，臨床應(yīng)用療效顯著。而本研究則通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對絡(luò)風(fēng)寧3號治療心律失常的作用機(jī)制進(jìn)行進(jìn)一步探討。

研究發(fā)現(xiàn)，絡(luò)風(fēng)寧3號方治療心律失常的主要活性成分包括槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、漢黃芩素、（E）-11-二十烯酸、5,7,8-三羥基黃酮等。這些活性成分可通過減輕炎癥與氧化應(yīng)激損傷，調(diào)節(jié)離子通道等多種方式來達(dá)到抗心律失常作用。槲皮素可通過降低低密度脂蛋白（LDL）氧化、減少粘附分子（CAMs）和其他炎癥因子產(chǎn)生、保護(hù)內(nèi)皮功能等途徑改善心律失常[11]。山奈酚可以抑制血管細(xì)胞粘附分子1（VCAM-1）、細(xì)胞間粘附分子-1（ICAM-1）、內(nèi)皮細(xì)胞選擇素（E-selectin）、誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）和環(huán)氧合酶-2（COX-2）及核轉(zhuǎn)錄因子κB（NFκB）和轉(zhuǎn)錄激活因子1（AP-1）通路，發(fā)揮抗心律失常的作用[12]。此外，山奈酚、槲皮素、β-谷甾醇等活性成分還對鈉鉀氯轉(zhuǎn)運(yùn)、Ca2+內(nèi)流等離子通道具有調(diào)節(jié)作用[13,14]，其中，山奈酚可抑制L型鈣通道Ca2+內(nèi)流[14]；而槲皮素可以利用鈉鉀ATP酶（Na+/K+ATPase）產(chǎn)生的電化學(xué)勢能，調(diào)節(jié)細(xì)胞質(zhì)攝取氯離子（Cl-），從而刺激1型鈉鉀氯同工轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（NKCC1）的表達(dá)，達(dá)到改善心律失常的作用[15]。

此外，本研究共篩選出82個靶點(diǎn)因子，如IL6、VEGFA、AKT1、TNF、MMP9等，涉及炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和調(diào)節(jié)離子通道等途徑。作為促炎因子，TNF不僅可以降低心肌細(xì)胞的T型Ca2+電流密度，抑制離子通道，下調(diào)離子調(diào)通道蛋白表達(dá)[16]，也可通過激活蛋白激酶Cα（PKCα+），抑制超快速延遲整流鉀通道（Ikur）導(dǎo)致心律失常[17]。此外，TNF可增加內(nèi)皮細(xì)胞通透性和細(xì)胞間粘附分子1（ICAM-1）的表達(dá)，影響正常心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)，誘發(fā)心律失常[18,19]。VEGF、MMP9等作為參與血管生成的重要因素，同樣參與心律失常的病理過程[20,21]。其中VEGF除具有促進(jìn)新生血管的作用外，還能直接調(diào)控心肌細(xì)胞收縮性[20]。Wolfgang Rottbauer等[22]研究發(fā)現(xiàn)VEGF可以通過激活心室心肌細(xì)胞中的磷脂酶C-γ1（PLCγ1），特別是血管內(nèi)皮生長因子受體-1（FLT-1）受體來調(diào)節(jié)大鼠心室心肌細(xì)胞中的鈣循環(huán)，導(dǎo)致心肌收縮異常。Mezach等[23]研究發(fā)現(xiàn)VEGF可破壞NaV1.5-rich ID納米組織并減慢心房傳導(dǎo)，誘發(fā)心律失常。

KEGG富集分析進(jìn)一步獲得絡(luò)風(fēng)寧三號方涉及到的116條通路，主要包括有：PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路、MAPK信號通路、Toll樣受體信號通路、HIF-1信號通路等。ShiXin等[24]研究發(fā)現(xiàn)，與房顫預(yù)測相關(guān)的長鏈非編碼RNA（lncRNA）主要富集于炎癥通路中，且大多與TNF信號通路相關(guān)。TNF信號通路可使內(nèi)皮細(xì)胞通透性的升高，加速Na+、Ca2+等離子內(nèi)流，及炎癥因子的釋放，從而影響正常心肌細(xì)胞結(jié)構(gòu)，改變電生理特點(diǎn)[18]。鄭旭穎等[25]發(fā)現(xiàn)通過調(diào)控PI3K-Akt通路可以降低心律失常發(fā)作時間與發(fā)生率，原因在于PI3K-Akt通路啟動下游靶蛋白哺乳動物雷帕霉素靶蛋白（mTOR），降低Beclin1，微管相關(guān)蛋白輕鏈3（LC3）的表達(dá)，防止心肌細(xì)胞過度自噬，保護(hù)心肌細(xì)胞從而減少心律失常發(fā)生[26]。此外，MAPK、Toll樣受體、HIF1受體等信號通路還涉及對心臟電傳導(dǎo)的調(diào)節(jié)[27-29]。連接蛋白43（Cx43）是心肌細(xì)胞中表達(dá)最豐富的連接蛋白，可在心肌細(xì)胞質(zhì)膜上形成縫隙連接，用以調(diào)節(jié)細(xì)胞間的電生理和代謝耦合，因此對正常的心臟脈沖傳導(dǎo)至關(guān)重要[30]。心肌損傷時升高的MMP9可水解N-鈣粘蛋白（CDH2），降低心肌細(xì)胞Cx43，導(dǎo)致心室傳導(dǎo)速度降低，激發(fā)波長降低發(fā)生心律失常[31]；而MAPK信號通路則可增加Cx43的磷酸化水平來降低心律失常的發(fā)生率[32]。Toll樣受體信號同樣參與調(diào)節(jié)心臟電沖動，其機(jī)制在于抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Kv4.2/4.3，進(jìn)而調(diào)節(jié)QT間期，維持心臟復(fù)極化[28]。

綜上，絡(luò)風(fēng)寧3號方的主要成分有槲皮素、β-谷甾醇、山奈酚、漢黃芩素等。這些活性成分可能作用于IL6、VEGFA、AKT1、TNF、MMP9等靶標(biāo)，調(diào)節(jié)PI3K-Akt信號通路、TNF信號通路、MAPK信號通路、TLR信號通路、HIF-1等信號通路，從而發(fā)抗炎、抗氧化應(yīng)激、調(diào)節(jié)離子通路等作用，降低心律失常的發(fā)生。本研究促進(jìn)了絡(luò)風(fēng)寧3號方從經(jīng)驗醫(yī)學(xué)到循證醫(yī)學(xué)的轉(zhuǎn)化，為進(jìn)一步藥物實驗提供思路。但由于各個數(shù)據(jù)庫計算方法不同，收集到的資料存在一定的偏倚，僅能盡可能接近真實全部的網(wǎng)絡(luò)藥理數(shù)據(jù)。此外藥物之間相互作用情況尚未完全探明，需進(jìn)一步深入的實驗驗證。