Pnpla3 I148M和Tm6sf2 E167K雙突變純合小鼠模型的構(gòu)建

王孟軻， 劉守勝， 褚雪汝， 王藝奮， 辛永寧

1 青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院 a.感染性疾病科， b.臨床研究中心， 山東 青島 266071；2 中國海洋大學(xué) 醫(yī)藥學(xué)院， 山東 青島 266071

非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)是指除酒精和其他明確的損肝因素所致的、以彌漫性肝細(xì)胞大泡性脂肪變性為主要特征的臨床病理綜合征[1-3]。有研究[4-6]發(fā)現(xiàn)NAFLD與胰島素抵抗和遺傳易感性顯著相關(guān)。含patatin樣磷脂酶域3(patatin-like phospholipase domain containing 3, Pnpla3)位于22號(hào)染色體上[7], 主要表達(dá)于脂肪組織和肝臟[8]?？缒さ鞍?超家族成員2基因(transmembrane 6 superfamily member 2，Tm6sf2)位于第19號(hào)染色體上，TM6SF2主要定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜，主要表達(dá)于肝臟和小腸[9]，這兩個(gè)器官參與全身脂質(zhì)穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)[10]。全基因組關(guān)聯(lián)和外顯子組測序結(jié)果顯示Pnpla3 I148M和Tm6sf2 E167K基因的遺傳變異與NAFLD的易感性和進(jìn)展相關(guān)，Pnpla3 I148M是指該蛋白第148位異亮氨酸被蛋氨酸取代，Tm6sf2 E167K是指該蛋白第167位谷氨酸被賴氨酸取代，Pnpla3和Tm6sf2基因的遺傳變異與肝脂肪含量增加、進(jìn)展為非酒精性脂肪型肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌密切相關(guān)[11-13]。人群研究[14-15]發(fā)現(xiàn)Pnpla3 I148M和Tm6sf2 E167K雙突變對(duì)NAFLD的發(fā)展產(chǎn)生疊加效應(yīng)，協(xié)同參與肝臟脂肪變性的發(fā)展。但是Pnpla3 I148M聯(lián)合Tm6sf2 E167K對(duì)NAFLD的共同作用及機(jī)理尚不明確，因此本研究旨在構(gòu)建Pnpla3 I148M和Tm6sf2 E167K雙突變小鼠模型，探究其在常規(guī)飲食條件下體內(nèi)脂質(zhì)代謝的變化，為探究Pnpla3 I148M和Tm6sf2 E167K雙突變?cè)贜AFLD發(fā)病中的聯(lián)合作用及相關(guān)機(jī)制提供良好的動(dòng)物模型。

1 材料與方法

1.1 材料 Tm6sf2 E167K小鼠與Pnpla3 I148M小鼠均為本課題組所有(青島大學(xué)附屬青島市市立醫(yī)院肝病研究室)，所有小鼠均飼養(yǎng)于SPF級(jí)動(dòng)物房。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證:SCXK(蘇)2018-0008，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證: SYXK(魯)20200009。TC、TG、AST和ALT檢測試劑盒購買自南京建成生物工程研究所；血糖儀和血糖試紙購買自日本OMRON公司；胰島素檢測試劑盒購買自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。

1.2 Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K小鼠的繁育策略 Pnpla3148I/M和Tm6sf2167E/K雜合小鼠通過各自自交，分別得到Pnpla3148M/M和Tm6sf2167K/K單突變純合小鼠，通過Pnpla3148M/M單突變純合小鼠與Tm6sf2167K/K單突變純合小鼠交配，得到Pnpla3148I/MTm6sf2167E/K雙突變雜合小鼠，最后通過Pnpla3148I/MTm6sf2167E/K雙突變雜合小鼠自交，得到Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K雙突變純合小鼠(圖1)。統(tǒng)計(jì)Pnpla3148I/MTm6sf2167E/K雙突變雜合小鼠自交后的子代中Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K小鼠、Pnpla3148M/M單突變純合小鼠、Tm6sf2167K/K單突變純合小鼠、雜合小鼠(包括Pnpla3 I148M或Tm6sf2 E167K單突變雜合小鼠及雙突變雜合小鼠)和Wt小鼠的數(shù)量，計(jì)算各種基因型小鼠數(shù)量占總體的比例，檢驗(yàn)是否符合孟德爾遺傳分離定律。

1.3 Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K小鼠的基因鑒定 剪取1～2周齡小鼠0.3 cm小鼠尾尖于1.5 mL EP管中，加入60 μL堿性裂解液A(A液：25 mmol/L氫氧化鈉；20 μmol/L 乙二胺四乙酸二鈉)，95 ℃金屬浴40 min后加入60 μL裂解液B(B液：40 mmol/L Tris-Cl),機(jī)械研磨3 min，6000 r/min離心6 min得到上清液即為粗提所得DNA,以其作為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增。將PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，根據(jù)條帶大小來鑒定Tm6sf2基因型，利用基因測序方法鑒定Pnpla3基因型。Tm6sf2和Pnpla3的PCR引物見表1，Pnpla3測序引物見表2。

1.4 小鼠口服普通糖耐量試驗(yàn)(oral glucose tolerance test，OGTT) 選擇8周齡同窩別Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K(n=6)、Pnpla3148M/MTm6sf2167E/E(n=6)、Pnpla3148I/ITm6sf2167K/K(n=6)和Wt(n=6)雄性小鼠，提前數(shù)天給小鼠做掐尾訓(xùn)練。

表2 Pnpla3小鼠基因型測序引物序列Table 2 Primer sequences for Pnpla3 mouse genotype sequencing

實(shí)驗(yàn)當(dāng)天于早上8點(diǎn)給予小鼠禁食6 h，禁食結(jié)束后稱量體質(zhì)量并檢測鼠尾靜脈空腹血糖，然后給每只小鼠進(jìn)行葡萄糖灌胃(2 g葡萄糖/kg體質(zhì)量)[16]。分別測量灌胃后30、60、120 min時(shí)的小鼠尾靜脈血糖，記錄血糖值并制作OGTT曲線。

1.5 小鼠生化指標(biāo)檢測 選擇8周齡同窩別Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K(n=6)、Pnpla3148M/MTm6sf2167E/E(n=6)、Pnpla3148I/ITm6sf2167K/K(n=6)和Wt(n=6)雄性小鼠，禁食禁水6 h后，稱量體質(zhì)量，利用4%水合氯醛對(duì)小鼠進(jìn)行麻醉后取血(采用乙二胺四乙酸二鈉抗凝)，2500×g，4 ℃離心20 min，取上層血漿。然后解剖出小鼠的主要組織器官進(jìn)行形態(tài)學(xué)對(duì)比，并計(jì)算肝臟指數(shù)。按照說明書方法測量小鼠血漿TC、TG、AST、ALT和胰島素水平。

1.6 Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K小鼠肝組織學(xué)評(píng)估 取上述8周齡雄性小鼠的肝臟，用0.9%等滲生理鹽水清洗后用4%多聚甲醛固定，脫水后用石蠟包埋并切片，分別做小鼠肝組織的HE染色和油紅O染色，光學(xué)顯微鏡觀察并拍照。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 數(shù)據(jù)使用 GraphPad prism 8軟件處理，多組間比較采用方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K小鼠的基因鑒定 取小鼠鼠尾DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增后將產(chǎn)物進(jìn)行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。Tm6sf2基因型的鑒定結(jié)果為：瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果只有一條203 bp條帶則是Tm6sf2167K/K純合突變小鼠，只有一條147 bp條帶則是Tm6sf2167E/E野生小鼠，同時(shí)擴(kuò)增出上述兩條條帶則是Tm6sf2167E/K雜合小鼠。Pnpla3基因型的鑒定結(jié)果為：瓊脂糖凝膠電泳顯示擴(kuò)增出506 bp條帶后進(jìn)行基因測序，測序結(jié)果證實(shí)第444位密碼子由ATT突變?yōu)锳TG，為Pnpla3148M/M小鼠，若同時(shí)存在ATT和ATG兩種堿基類型，則為Pnpla3148I/M小鼠(圖2)。

2.2 孟德爾遺傳分離定律檢測 將Pnpla3148I/MTm6sf2167E/K小鼠進(jìn)行自交，統(tǒng)計(jì)子代Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K、Pnpla3148M/MTm6sf2167E/E、Pnpla3148I/ITm6sf2167K/K、雜合(Pnpla3148I/MTm6sf2167E/K、Pnpla3148I/MTm6sf2167E/E、Pnpla3148I/ITm6sf2167E/K、Pnpla3148M/MTm6sf2167E/K和 Pnpla3148I/MTm6sf2167K/K)和Wt小鼠的數(shù)量，結(jié)果見表3，各種基因型小鼠數(shù)量總體比例大致為1∶1∶1∶12∶1，符合孟德爾遺傳分離定律，并且子代小鼠生長狀況正常，無死亡。這些結(jié)果說明Pnpla3148I/MTm6sf2167E/K雙突變小鼠能夠進(jìn)行正常繁育后代，并且后代可以正常存活。

2.3 不同基因型小鼠體質(zhì)量和肝指數(shù)的差異檢測 Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K、Pnpla3148M/MTm6sf2167E/E、Pnpla3148I/ITm6sf2167K/K和Wt小鼠以普通飲食喂養(yǎng)8周，檢測不同基因型小鼠的體質(zhì)量變化。結(jié)果顯示，Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K基因型小鼠與其他三種基因型小鼠體質(zhì)量無明顯差異(P值均>0.05)，檢測小鼠肝濕重發(fā)現(xiàn)Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K小鼠高于Wt小鼠的肝濕重(P<0.05)，但通過計(jì)算各組小鼠的肝指數(shù)發(fā)現(xiàn)，Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K基因型小鼠的肝指數(shù)與其他三種基因型小鼠的肝指數(shù)比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(圖3)。

注：a，Tm6sf2 E167K突變小鼠基因型鑒定電泳結(jié)果；b，Pnpla3 I148M突變小鼠基因型鑒定電泳結(jié)果；c、d和e為Pnpla3 I148M突變小鼠 基因型鑒定測序結(jié)果(c，Pnpla3148M/M；d，Pnpla3148I/M；e，Pnpla3148I/I)。圖2 Pnpla3 I148M和Tm6sf2 E167K突變小鼠基因型鑒定和測序結(jié)果Figure 2 Genotype identification and sequencing results of Pnpla3 I148M and Tm6sf2 E167K mutant mice

表3 Pnpla3148I/M Tm6sf2167E/K小鼠自交后子代各基因型數(shù)量Table 3 Number of progenies with each genotype afterPnpla3148I/ MTM6SF2167E/K mice self-breeding

圖3 四種基因型小鼠在8周齡時(shí)的體質(zhì)量、肝濕重和肝指數(shù)比較

2.4 不同基因型小鼠各組織的表型比較 分別解剖8周齡的Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K、Pnpla3148M/MTm6sf2167E/E、Pnpla3148I/ITm6sf2167K/K和Wt小鼠的腦、甲狀腺、心臟、肺、肝臟、脾臟、胃、腸、腎和睪丸，對(duì)比四組小鼠各個(gè)器官的大小和形態(tài)，發(fā)現(xiàn)四組小鼠之間的器官形態(tài)無明顯差異(圖4)。

2.5 不同基因型小鼠的葡萄糖代謝差異 對(duì)8周齡的Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K、Pnpla3148M/MTm6sf2167E/E、Pnpla3148I/ITm6sf2167K/K和Wt雄性小鼠的空腹血糖進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K空腹血糖低于Tm6sf2167K/K單突變小鼠和Wt小鼠，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均<0.05)，而與Pnpla3148M/M單突變小鼠無明顯差異(P>0.05)，提示Pnpla3 I148M突變會(huì)導(dǎo)致小鼠空腹血糖下降。OGTT曲線下面積比較結(jié)果顯示，Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K小鼠OGTT曲線下面積較Tm6sf2167K/K單突變小鼠升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，較Pnpla3148M/M單突變小鼠和Wt小鼠無明顯差異(P值均>0.05)，提示Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K雙突變較Tm6sf2167K/K單突變更容易導(dǎo)致小鼠葡萄糖耐受能力的下降；對(duì)四組小鼠的胰島素水平檢測結(jié)果顯示，胰島素水平在不同基因型小鼠中的水平無明顯差異(P值均>0.05)。Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K小鼠的胰島素抵抗指數(shù)(HOMA-IR)較Wt小鼠有所降低，這與兩組小鼠之間的空腹血糖含量趨勢一致(圖5)。

注：a,Pnpla3148M/M Tm6sf2167K/K 基因型小鼠; b,Pnpla3148M/M Tm6sf2167E/E基因型小鼠；c,Pnpla3148I/I Tm6sf2167K/K基因型小鼠; d,Wt小鼠。

2.6 不同基因型小鼠血漿生化指標(biāo)檢測 對(duì)8周齡Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K、Pnpla3148M/MTm6sf2167E/E、Pnpla3148I/ITm6sf2167K/K和Wt雄性小鼠的血漿TG、TC、AST和ALT水平進(jìn)行檢測，結(jié)果顯示Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K小鼠血漿中的TG、TC、ALT和AST水平和另外三種基因型小鼠比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值均>0.05)(圖6)。

2.7 不同基因型小鼠肝臟HE染色和油紅O染色結(jié)果

對(duì)8周齡Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K、Pnpla3148M/MTm6sf2167E/E、Pnpla3148I/ITm6sf2167K/K和Wt雄性小鼠的肝臟進(jìn)行HE染色和油紅O染色，結(jié)果顯示Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K小鼠與Pnpla3 I148M、Tm6sf2 E167K單突變和Wt小鼠肝組織學(xué)之間無明顯差異(圖7)；油紅O染色結(jié)果表明Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K小鼠比Pnpla3148M/M單突變小鼠和Wt小鼠肝臟內(nèi)脂滴水平有所增多，提示Pnpla3 I148M和Tm6sf2 E167K雙突變較Pnpla3 I148M單突變小鼠和Wt小鼠的肝臟更易發(fā)生脂質(zhì)積累，但同Tm6sf2 E167K單突變小鼠相比無明顯差異(圖8)。

注：*P<0.05;**P<0.01。圖5 四種基因型小鼠葡萄糖耐量比較Figure 5 Comparison of glucose tolerance of micewith four genotypes

圖6 四種基因型小鼠血漿生化水平Figure 6 Plasma biochemical levels of mice withfour genotypes

注：a，Wt；b，Pnpla3148M/M Tm6sf2167E/E; c，Pnpla3148I/I Tm6sf2167K/K;d，Pnpla3148M/M Tm6sf2167K/K。圖7 四組基因型小鼠肝臟HE染色(×200)Figure 7 HE staining of liver of mice with fourgenotypes (×200)

注：a，Wt；b，Pnpla3148M/M Tm6sf2167E/E; c，Pnpla3148I/I Tm6sf2167K/K;d，Pnpla3148M/M Tm6sf2167K/K。圖8 四組基因型小鼠肝臟油紅O染色(×200)Figure 8 Oil red O staining of liver of mice with fourgenotypes (×200)

3 討論

NAFLD患病人數(shù)的逐年增加給社會(huì)帶來了沉重的醫(yī)療和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，在全球范圍內(nèi)，NAFLD的平均發(fā)病率為25%[17]。盡管目前關(guān)于NAFLD的研究已經(jīng)取得了顯著進(jìn)展，但是其發(fā)病機(jī)制至今尚未完全闡明。前期筆者的研究發(fā)現(xiàn)，Pnpla3 I148M和Tm6sf2 E167K在細(xì)胞水平上可發(fā)揮聯(lián)合作用從而共同調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的脂質(zhì)代謝過程[18]，但未在動(dòng)物水平進(jìn)行驗(yàn)證。因此本文通過雜交繁育獲得了Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K雙突變小鼠，為進(jìn)一步在動(dòng)物水平探究 PNPLA3 I148M 及 TM6SF2 E167K 雙突變引發(fā)肝臟脂肪變性的作用及分子機(jī)制奠定動(dòng)物模型基礎(chǔ)。

在本研究中，完成Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K雙突變小鼠模型構(gòu)建后，對(duì)Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K雙突變小鼠的表型做了初步研究。本研究把PNPLA3 I148M 和 TM6SF2 E167K 雙突變雜合小鼠交配的后代分為Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K、Pnpla3148M/MTm6sf2167E/E、Pnpla3148I/ITm6sf2167K/K和Wt四組。統(tǒng)計(jì)Pnpla3148I/MTm6sf2167E/K小鼠自交后代的存活數(shù)量，發(fā)現(xiàn)PNPLA3I148M和 TM6SF2 E167K 雙突變小鼠能夠正常存活，無胚胎致死情況發(fā)生。 Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K小鼠的體質(zhì)量較其他3種基因型小鼠體質(zhì)量無明顯差異，進(jìn)一步對(duì)小鼠各器官形態(tài)進(jìn)行觀察發(fā)現(xiàn)，Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K小鼠各器官形態(tài)較其他3種基因型小鼠各器官形態(tài)無明顯差異。檢測小鼠葡萄糖代謝指標(biāo)，糖耐量試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K和Pnpla3148M/M單突變小鼠空腹血糖無明顯差異，但Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K小鼠的空腹血糖低于Tm6sf2167K/K單突變小鼠和Wt小鼠，提示Pnpla3 I148M和Tm6sf2 E167K雙突變會(huì)降低小鼠的空腹血糖；OGTT曲線下面積是評(píng)價(jià)葡萄糖耐量的指標(biāo)，結(jié)果顯示Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K小鼠OGTT曲線下面積高于Tm6sf2167K/K單突變小鼠，表明Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K雙突變小鼠的葡萄糖耐受能力較Tm6sf2167K/K單突變小鼠有所下降。

通過對(duì)小鼠血脂和肝功指標(biāo)的檢測發(fā)現(xiàn)，Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K雙突變小鼠血漿中TC、TG、ALT和AST與其余三種基因型小鼠無明顯差異。肝臟油紅O染色提示Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K雙突變較Pnpla3148M/M單突變小鼠和Wt小鼠更容易發(fā)生肝臟的脂質(zhì)積累，但Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K雙突變小鼠同Tm6sf2167K/K單突變小鼠的肝內(nèi)脂滴水平無明顯差異。

本研究成功構(gòu)建了Pnpla3148M/MTm6sf2167K/K雙突變小鼠模型，該模型有利于在動(dòng)物水平探究 Pnpla3 I148M 及 Tm6sf2 E167K 雙突變引發(fā)肝臟脂肪變性的作用及分子機(jī)制，揭示 Pnpla3 I148M 和Tm6sf2 E167K 雙突變?cè)贜AFLD發(fā)病過程中的交互作用。

倫理學(xué)聲明：實(shí)驗(yàn)所用動(dòng)物均按照青島大學(xué)附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)的原則進(jìn)行。倫理審批編號(hào)：AHQU-MAL20180504，倫理通過時(shí)間2018年5月4日。

利益沖突聲明：本研究不存在研究者、倫理委員會(huì)成員以及與公開研究成果有關(guān)的利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：王孟軻進(jìn)行課題設(shè)計(jì)與實(shí)施、撰寫論文；劉守勝進(jìn)行課題設(shè)計(jì)、論文審閱；褚雪汝、王藝奮進(jìn)行課題實(shí)施、數(shù)據(jù)收集；辛永寧進(jìn)行課題設(shè)計(jì)、實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)和提供經(jīng)費(fèi)。