林下栽培的大球蓋菇多酚提取工藝條件優(yōu)化*

胡德勝，李 健**，張 巖，鐘丹苗，方雪飛，廖營(yíng)忠，蘇干光

（1．桐廬縣林業(yè)技術(shù)推廣中心，浙江 桐廬 311500；2．桐廬縣森林病蟲害防治站，浙江 桐廬311500；3．桐廬康源菜竹專業(yè)合作社，浙江 桐廬 311512；4．開化縣山禾食用菌專業(yè)合作社，浙江 開化 324399）

大球蓋菇（Stropharia rugosoannulata） 又名皺環(huán)球蓋菇、皺球蓋菇、酒紅球蓋菇、赤松茸，屬于擔(dān)子菌門（Basidiomycota） 擔(dān)子菌綱（Basidiomycetes）傘菌目（Agaricales） 球蓋菇科 （Strophariaceae） 球蓋菇屬（Stropharia），是一種草腐食用菌。大球蓋菇營(yíng)養(yǎng)豐富、口味絕佳，被稱為“素中之葷”，作為一種特色農(nóng)業(yè)產(chǎn)品，受到聯(lián)合國(guó)糧食及農(nóng)業(yè)組織（FAO） 的青睞[1]。大球蓋菇富含蛋白質(zhì)、多糖、礦質(zhì)元素、維生素等生物活性物質(zhì)，還含有17種氨基酸，其中人體必需氨基酸種類齊全[2]。

大球蓋菇的菌絲有很強(qiáng)的生理活性和抗逆性，可直接利用稻草、竹屑、茭白葉等農(nóng)作物秸稈進(jìn)行生料栽培，具有取材方便、價(jià)格低廉和操作簡(jiǎn)便的優(yōu)點(diǎn)[3]。栽培過程中不需要菇棚，也無需裝袋、滅菌和接種設(shè)備。冬季閑置田地、林地、桑果園等都可作為栽培場(chǎng)地[4]。特別是林下套種大球蓋菇的栽培模式，可在不占用農(nóng)田的前提下實(shí)現(xiàn)對(duì)林間資源的充分利用。該模式可在短期獲得較高經(jīng)濟(jì)效益的同時(shí)，維持農(nóng)業(yè)生態(tài)環(huán)境的健康、持續(xù)發(fā)展。

多酚類物質(zhì)主要包括酚酸、類黃酮、花色苷類等，廣泛存在于植物、食用菌中[5]。多酚結(jié)構(gòu)多樣，具有抗氧化、抗病毒、抗菌等藥理活性[6]。乙醇作為一種常用的綠色溶劑，已廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物中多酚的提取[7-8]。超聲處理常用于食品加工領(lǐng)域，是一種綠色無污染的輔助提取技術(shù)，具有耗時(shí)短和效率高的優(yōu)點(diǎn)[9-11]。采用超聲處理輔助乙醇提取大球蓋菇多酚的方法具有良好的應(yīng)用潛力。

目前對(duì)林下栽培的大球蓋菇中多酚提取工藝的研究較少，因此以林下人工栽培的大球蓋菇為原料，采用超聲處理輔助乙醇提取多酚的方法，設(shè)計(jì)單因素試驗(yàn)，利用響應(yīng)面優(yōu)化法考察不同的乙醇體積分?jǐn)?shù)、超聲溫度和超聲時(shí)間對(duì)大球蓋菇子實(shí)體多酚提取量的影響，對(duì)提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，以期為深入開發(fā)和利用林下栽培的大球蓋菇資源提供依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

大球蓋菇子實(shí)體樣品為杭州市桐廬縣林下栽培所得。

福林酚（BR），上海源葉生物科技有限公司；沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)品，北京索萊寶科技有限公司；乙醇、碳酸鈉等（國(guó)產(chǎn)分析純），國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器

KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆山超聲儀器有限公司；RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海亞榮生化儀器廠；HH-1數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；可見分光光度計(jì)，上海精密科學(xué)儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1．3．1 標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制

用福林酚法[12]測(cè)定多酚含量。選擇沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品，精確量取沒食子酸0．04 g，加入10 mL乙醇，攪拌溶解，加水定容至100 mL，從而配制出400 mg·L-1的沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液 1 mL、2 mL、3 mL、4 mL、5 mL、6 mL定容至 10 mL，即得到 40 mg·L-1、80 mg·L-1、120 mg·L-1、160 mg·L-1、200 mg·L-1、240 mg·L-1的沒食子酸稀釋液。向各質(zhì)量濃度沒食子酸稀釋液中各加入福林酚試劑1 mL，振蕩均勻，靜置3 min～4 min；分別加入 7．5%碳酸鈉溶液 5 mL，加水定容至25 mL；40℃水浴加熱30 min；用分光光度計(jì)在765 nm處測(cè)定吸光度值，縱坐標(biāo)為吸光度值，橫坐標(biāo)為沒食子酸質(zhì)量濃度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1．3．2 林下栽培的大球蓋菇的多酚提取及測(cè)定

將林下栽培的大球蓋菇樣品進(jìn)行冷凍干燥、粉碎，稱取2．0 g試樣于具塞錐形瓶中。加入60 mL的一定濃度的乙醇溶液，按照設(shè)定的超聲溫度和超聲時(shí)間進(jìn)行萃取。然后在3 000 r·min-1下離心10 min，上清液定容至100 mL，從中吸取1 mL提取液，按照1．3．1沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液測(cè)定方法測(cè)定其多酚含量。

林下栽培的大球蓋菇中多酚提取量（Y，mg·g-1）的計(jì)算公式為：

式中：C為待測(cè)液質(zhì)量濃度（mg·mL-1）；N為稀釋倍數(shù)；V為提取液體積（mL）；M為樣品質(zhì)量（g）。

1．3．3 提取條件的單因素試驗(yàn)

參照1．3．2中的提取方法提取大球蓋菇多酚，設(shè)計(jì)3組單因素試驗(yàn)，每組進(jìn)行3個(gè)平行試驗(yàn)。

1） 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%以及超聲溫度為40℃，在提取時(shí)間分別為20 min、30 min、40 min、50 min、60 min、70 min的條件下進(jìn)行超聲提取，分析超聲時(shí)間對(duì)大球蓋菇子實(shí)體多酚提取量的影響。

2） 固定超聲溫度為40℃以及液料比為30∶1，分別在乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%、40%、50%、60%、70%的條件下，進(jìn)行30 min的超聲提取，分析不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)大球蓋菇子實(shí)體多酚提取量的影響。

3） 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)為70%以及液料比為30∶1，分別在超聲溫度為30℃、40℃、50℃、60℃、70℃的條件下，進(jìn)行30 min超聲提取，分析超聲溫度對(duì)大球蓋菇子實(shí)體多酚提取量的影響。

1．3．4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

利用Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素試驗(yàn)所確定的范圍內(nèi)，采用3因素3水平設(shè)計(jì)響應(yīng)面，試驗(yàn)數(shù)據(jù)用Design Expert 8．05軟件進(jìn)行分析。以-1，0，1依次對(duì)自變量的試驗(yàn)水平進(jìn)行編號(hào)，試驗(yàn)因素及水平設(shè)計(jì)見表1。

表1 響應(yīng)面分析因子及水平Tab．1 Factors and levels of response surface analysis

2 結(jié)果與分析

2.1 大球蓋菇多酚提取的單因素試驗(yàn)結(jié)果

不同超聲時(shí)間對(duì)林下栽培的大球蓋菇子實(shí)體多酚提取量的影響見圖1。

圖1 不同超聲時(shí)間對(duì)大球蓋菇多酚提取量的影響Fig．1 Effect of different ultrasonic times on polyphenol yeild of Stropharia rugosoannulata

由圖1可知，隨著超聲時(shí)間的增加，多酚提取量先迅速上升，后呈逐漸下降的趨勢(shì)。當(dāng)超聲時(shí)間為20 min～40 min時(shí)，多酚提取量隨超聲時(shí)間的增加而增加。當(dāng)超聲時(shí)間為40 min時(shí)大球蓋菇子實(shí)體多酚提取量達(dá)到最大值。當(dāng)超聲時(shí)間超過40 min后，多酚提取量開始降低。據(jù)此，選擇30 min、40 min和50 min作為超聲時(shí)間響應(yīng)面分析的3個(gè)水平。

不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)林下栽培的大球蓋菇子實(shí)體多酚提取量的影響見圖2。

圖2 不同乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)大球蓋菇多酚提取量的影響Fig．2 Effects of different ethanol volume fractions on polyphenol yield of Stropharia rugosoannulata

由圖2可知，當(dāng)乙醇體積分?jǐn)?shù)為30%～60%時(shí)，隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的上升，大球蓋菇多酚提取量也隨之增加，當(dāng)體積分?jǐn)?shù)為60%時(shí)，子實(shí)體多酚提取量達(dá)到最大值。在乙醇體積分?jǐn)?shù)超過60%時(shí)，子實(shí)體多酚提取量有所下降。原因可能是多酚的存在形式有結(jié)合態(tài)、游離態(tài)及酯化態(tài)等，部分多酚與蛋白質(zhì)結(jié)合在一起形成結(jié)合態(tài)，乙醇體積分?jǐn)?shù)過高導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性，從而影響結(jié)合態(tài)多酚的溶出。綜合以上因素，乙醇體積分?jǐn)?shù)響應(yīng)面分析的3個(gè)水平選擇50%、60%和70%。

不同超聲溫度對(duì)林下栽培的大球蓋菇多酚提取量的影響見圖3。

圖3 不同超聲溫度對(duì)大球蓋菇多酚提取量的影響Fig．3 Effect of different ultrasound temperatures on the polyphenol yeild of Stropharia rugoso annulata

由圖3可知，當(dāng)超聲溫度為30℃～50℃時(shí)，子實(shí)體多酚提取量隨超聲溫度的升高而升高；當(dāng)超聲溫度為50℃時(shí)，子實(shí)體多酚提取量達(dá)到最大值。原因可能是超聲溫度越高溶液中分子運(yùn)動(dòng)越強(qiáng)，大球蓋菇樣品充分溶解，多酚溶出量增加。而后隨著超聲溫度繼續(xù)上升，多酚提取量逐漸下降。原因可能是高溫導(dǎo)致部分多酚類物質(zhì)結(jié)構(gòu)發(fā)生變化，或溶液中的雜質(zhì)增多，使得多酚類物質(zhì)的提取量下降[13]。由此，超聲溫度響應(yīng)面分析的3個(gè)水平選擇40℃、50℃和60℃。

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)結(jié)果及分析

2．2．1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果

根據(jù)Box-Behnken中心組合試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，以林下栽培的大球蓋菇子實(shí)體多酚提取量作為響應(yīng)值，設(shè)計(jì)3因素3水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)，試驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面設(shè)計(jì)及試驗(yàn)結(jié)果Tab．2 Response surface design and experimental results

用Design Expert 8．05軟件對(duì)表2試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得出多酚提取量對(duì)超聲溫度、超聲時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)的多元二次回歸方程為：

該回歸方程的相關(guān)系數(shù)R2為0．9853。

對(duì)上述方程進(jìn)行方差分析，結(jié)果見表3。

表3 方差分析Tab．3 Analysis of variance model

由表3可知，目標(biāo)函數(shù)為多酚提取量的多元二次方程回歸效果均達(dá)到極顯著水平（P＜0．01）；決定系數(shù)R2達(dá)到0．985 3，證明模型與實(shí)際試驗(yàn)?zāi)軌蜉^好地?cái)M合；校正決定系數(shù)R2adj達(dá)到0．966 8，證明該模型能解釋96．68%響應(yīng)值的變化；模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際值不擬合的概率表示為模型的失擬項(xiàng)，表3中模型失擬項(xiàng) P=0．677 2＞0．050 0，證明模型失擬項(xiàng)不顯著。此外，乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）、超聲溫度（C）對(duì)響應(yīng)值影響顯著 （P＜0．05），AA、BB、CC 以及 AC 和BC的交互項(xiàng)對(duì)多酚提取量的影響極顯著（P＜0．01）。3個(gè)因素對(duì)林下栽培的大球蓋菇子實(shí)體多酚提取量影響大小的順序依次為：超聲溫度（C） ＞乙醇體積分?jǐn)?shù)（B） ＞超聲時(shí)間（A）。

2．2．2 響應(yīng)面圖形分析

依據(jù)以回歸方程制作的響應(yīng)曲面圖與擬合的響應(yīng)曲面形狀，研究不同超聲時(shí)間、超聲溫度及乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)林下栽培的大球蓋菇子實(shí)體多酚提取量的影響。使模型中的超聲溫度、超聲時(shí)間及乙醇體積分?jǐn)?shù)皆固定在水平0，進(jìn)而獲得另外2個(gè)因素的交互影響結(jié)果，二次回歸方程的響應(yīng)面及其等高線圖見圖4～圖6。

圖4 超聲時(shí)間和乙醇體積分?jǐn)?shù)交互作用對(duì)多酚提取量影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig．4 Response surface and contour of the interaction between ultrasonic time and ethanol volume fraction on polyphenol yeild

圖5 乙醇體積分?jǐn)?shù)和超聲溫度交互作用對(duì)多酚提取量影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig．5 Response surface and contour of the interaction between ethanol vdrume fraction and ultrasonic temperature on pdyphenol yeild

圖6 超聲時(shí)間和超聲溫度交互作用對(duì)多酚提取量影響的響應(yīng)面及等高線圖Fig．6 Response surface and contour of the interaction between ultrasonic time and ultrasonic temperature on pdyphenol yeild

由圖4～圖6可知，超聲溫度（C） 是影響大球蓋菇子實(shí)體多酚提取量最顯著的因素，在等高線圓心處出現(xiàn)極值條件，響應(yīng)面弧度出現(xiàn)較大變化；其次是乙醇體積分?jǐn)?shù)（B）；超聲時(shí)間（C） 對(duì)響應(yīng)值影響較小，表現(xiàn)為響應(yīng)面變化弧度較為平緩。交互效應(yīng)的強(qiáng)弱可用等高線趨勢(shì)的變化來表示，兩因素交互作用顯著用橢圓形展現(xiàn)，相反則呈圓形。因此，超聲溫度（C） 與乙醇體積分?jǐn)?shù)（B） 的交互作用對(duì)多酚提取量有顯著影響。

2.3 驗(yàn)證試驗(yàn)

依據(jù)Box-Behnken試驗(yàn)得出的結(jié)果以及回歸方程，使用Design-Expert 8．05對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，得到多酚提取優(yōu)化條件：超聲時(shí)間為39．3 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為64．68%，超聲溫度為53．1℃。在此優(yōu)化條件下計(jì)算得到林下栽培的大球蓋菇子實(shí)體多酚提取量理論值為 16．97 mg·g-1。

為驗(yàn)證模型預(yù)測(cè)值與實(shí)際值的相關(guān)性（即對(duì)響應(yīng)面優(yōu)化模型可靠性進(jìn)行驗(yàn)證），以及實(shí)際生產(chǎn)中大球蓋菇子實(shí)體中多酚提取量情況，依據(jù)軟件計(jì)算出的最佳提取條件進(jìn)行3次平行重復(fù)試驗(yàn)。得到多酚提取量分別為 16．56 mg·g-1、16．58 mg·g-1、16．63 mg·g-1，多酚實(shí)際提取量的平均值為 16．59 mg·g-1，達(dá)到了理論預(yù)測(cè)值的97．76%。試驗(yàn)結(jié)果與模型較好擬合，說明該模型可對(duì)林下栽培的大球蓋菇子實(shí)體多酚提取量較好地進(jìn)行模擬和預(yù)測(cè)。

3 結(jié)論

林下栽培的食用菌具有原生態(tài)的特質(zhì)，與大棚栽培的子實(shí)體相比，其生長(zhǎng)環(huán)境更加接近自然狀況，生產(chǎn)的大球蓋菇等食用菌營(yíng)養(yǎng)豐富、品質(zhì)好。

通過響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)，利用超聲處理輔助乙醇萃取，優(yōu)化得出林下栽培的大球蓋菇子實(shí)體多酚的工藝提取條件：超聲時(shí)間為39.3 min，乙醇體積分?jǐn)?shù)為64.68%，超聲溫度為53.1℃。在該條件下，林下栽培的大球蓋菇子實(shí)體多酚提取量達(dá)16.59 mg·g-1。同時(shí)，依據(jù)最佳提取條件進(jìn)行的3次平行試驗(yàn)，結(jié)果證明了該模型可靠，可用于大球蓋菇子實(shí)體多酚提取量的預(yù)測(cè)。

此外，林業(yè)與食用菌產(chǎn)業(yè)的交叉優(yōu)勢(shì)，可較大幅度提高竹林地的生產(chǎn)力和經(jīng)濟(jì)效益，實(shí)現(xiàn)資源的合理循環(huán)利用，構(gòu)成一個(gè)良性的原生態(tài)食用菌栽培模式，值得推廣。