溶酶體跨膜蛋白175鉀通道蛋白質(zhì)與帕金森病

單琳琳， 王小婉， 李超堃

(新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)系，河南 新鄉(xiāng) 453000)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是最常見的神經(jīng)退行性疾病之一，在老年人中發(fā)病率極高。其病理特征為黑質(zhì)紋狀體多巴胺神經(jīng)元丟失、神經(jīng)路易小體出現(xiàn)、不溶性α-突觸核蛋白(α-synuclein, SNCA)以及其他可能導(dǎo)致細(xì)胞毒性和死亡的蛋白質(zhì)沉積。遺傳學(xué)和生化研究表明，溶酶體酶的破壞在帕金森病發(fā)病機(jī)制中發(fā)揮重要作用。因此，與溶酶體功能相關(guān)的基因的罕見變異或功能異常也是PD的危險因素之一。全基因組關(guān)聯(lián)研究(genome wide association studies, GWAS)為我們提供了大量可能與PD相關(guān)的風(fēng)險基因信息，其中不乏溶酶體基因。跨膜蛋白175(transmembrane protein 175，TMEM175)是一種具有新型結(jié)構(gòu)的溶酶體鉀離子通道蛋白質(zhì)，其失調(diào)與帕金森病的發(fā)生有關(guān)[1-4]。本文將就溶酶體TMEM175鉀通道與PD發(fā)病及發(fā)展的相關(guān)性進(jìn)行綜述。

1 跨膜蛋白175鉀通道結(jié)構(gòu)

溶酶體是一種酸性細(xì)胞器，在營養(yǎng)感知、信號傳遞、自噬和大分子降解方面發(fā)揮著重要作用[5-8]，對維持神經(jīng)元的細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)至關(guān)重要。穩(wěn)定的酸性環(huán)境是溶酶體發(fā)揮功能所必需的。溶酶體有豐富的離子通道及轉(zhuǎn)運(yùn)體蛋白質(zhì)，它們與液泡型ATP酶一起，調(diào)節(jié)其他溶質(zhì)的正?？缒まD(zhuǎn)運(yùn)及細(xì)胞器融合過程。反之，溶酶體離子通道蛋白質(zhì)或轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的缺陷會導(dǎo)致各種疾病的發(fā)生[9-11]。

TMEM175是電壓非依賴型K+通道，因此也稱為KEL。溶酶體蛋白質(zhì)組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)，編碼人跨膜蛋白175(hTMEM175)的基因位于GAK和DGKQ位點(diǎn)之間，后兩者也是跨膜蛋白家族的成員。研究發(fā)現(xiàn)，在PD病人腦組織中hTMEM175表現(xiàn)為等位基因特異性表達(dá)(allele-specific expression，ASE)[12]，暗示hTMEM175參與PD的發(fā)生。在細(xì)胞中，hTMEM175蛋白質(zhì)分布于晚期內(nèi)酶體和溶酶體。hTMEM175包含2個同源6-跨膜螺旋(six-transmembrane-helix, 6-TM)結(jié)構(gòu)域[13,14]，該結(jié)構(gòu)域與典型的四聚體K+通道無序列同源性，缺乏標(biāo)準(zhǔn)K+通道所具有的典型過濾性結(jié)構(gòu)——TVGYG，因此其K+選擇性是由孔隙中高度保守的蘇氨酸殘基的側(cè)鏈介導(dǎo)的。hTMEM175孔隙中包含的2個絲氨酸的附加層進(jìn)一步提高了選擇性，并使該通道對抑制劑4-氨基吡啶和Zn2+敏感，對四乙基銨不敏感[15,16]。這些特性預(yù)示著TMEM175獨(dú)特的離子滲透和選擇性機(jī)制。最新的研究表明，生長因子可通過磷脂酰肌醇3-激酶激活A(yù)kt/PKB(protein kinase B，蛋白激酶B)激酶，Akt進(jìn)而結(jié)合TMEM175胞漿環(huán)中靠近其中心孔的底物結(jié)合位點(diǎn)，激活TMEM175通道，且這種激活不依賴Akt的激酶活性，只需Akt與TMEM175結(jié)合誘導(dǎo)其構(gòu)象發(fā)生改變就足以“開啟”TMEM175通道[17]，證實(shí)了TMEM175通道不同于所有已知其他鉀離子通道的獨(dú)特性。

2 跨膜蛋白175參與PD的機(jī)制

2.1 TMEM175通過影響溶酶體pH參與PD疾病的發(fā)生

2017年，Jinn等[18]在SH-SY5Y細(xì)胞系中敲除(knock out，KO)TMEM175基因，發(fā)現(xiàn)TMEM175缺失可引起溶酶體pH改變，天冬氨酸蛋白酶、半胱氨酸蛋白酶、組織蛋白酶B等多種溶酶體蛋白質(zhì)的表達(dá)降低。其中，組織蛋白酶D和葡糖腦甘酯酶(glucocerebrosidase，GBA)的活性均大幅度降低20%～30%。溶酶體pH呈酸性，GBA基因可增加正常細(xì)胞中α-突觸核蛋白的聚集，進(jìn)而增加PD發(fā)病率，是PD的易感風(fēng)險基因[19,20]。因此，TMEM175表達(dá)改變會破壞溶酶體PH的穩(wěn)定，影響溶酶體的降解，改變?nèi)苊阁w中各種酶的催化活性，干擾溶酶體酶的正常功能發(fā)揮，參與PD的發(fā)生發(fā)展。

2.2 TMEM175通過影響自噬體-溶酶體的融合，干擾自噬體清除，進(jìn)而參與PD疾病的發(fā)生

溶酶體作為細(xì)胞催化機(jī)制，其主要功能是在自噬的最后階段通過與自噬體融合來降解自噬物質(zhì)，這對機(jī)體內(nèi)氨基酸的循環(huán)、防止蛋白質(zhì)聚集及老化細(xì)胞器的積累是非常重要的[21,22]。在TMEM175 KO SH-SY5Y細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)，溶酶體對自噬體的清除率降低，自噬溶酶體數(shù)量多于自噬體，提示TMEM175缺乏加速了自噬體-溶酶體融合[18]。在神經(jīng)元中敲除TMEM175基因同樣發(fā)現(xiàn)溶酶體與自噬體的融合加速，表明TMEM175通過調(diào)節(jié)自噬體-溶酶體的融合，參與了PD疾病的發(fā)生[17]。

2.3 TMEM175可通過影響溶酶體膜完整性，參與PD的發(fā)生

α-突觸核蛋白是路易小體的主要組成部分，是PD的主要組織病理學(xué)標(biāo)志物[23]。磷酸化α-突觸核蛋白的累積會極大的損傷TMEM175 KO 神經(jīng)元中溶酶體膜完整性。研究發(fā)現(xiàn)，用α-突觸核蛋白原纖維誘導(dǎo)TMEM175 KO小鼠，發(fā)現(xiàn)TMEM175 KO神經(jīng)元中磷酸化的α-突觸核蛋白沉積增加[17,18]。反之，TMEM175過表達(dá)使小鼠神經(jīng)元中磷酸化的α-突觸核蛋白聚集減少[24]。敲低TMEM175神經(jīng)元也有類似的結(jié)果，表明降低TMEM175的表達(dá)，能夠加速病理性α-突觸核蛋白的異常聚集，改變?nèi)苊阁w膜完整性，促進(jìn)PD發(fā)生。研究還發(fā)現(xiàn)，在腦缺血再灌注后，外源性增加TMEM175蛋白質(zhì)的表達(dá)量可逆轉(zhuǎn)缺血再灌注后神經(jīng)元溶酶體的功能障礙，提示TMEM175對于神經(jīng)元溶酶體的功能和神經(jīng)元損傷具有一定的神經(jīng)保護(hù)作用[25]。

2.4 TMEM175基因多態(tài)性在PD疾病發(fā)生中有協(xié)同、累加或減少作用

GWAS對單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphisms, SNP)的研究推動了對PD易感基因的認(rèn)識[26]。這些SNP位點(diǎn)通常會導(dǎo)致疾病風(fēng)險的增加或減少[27]。研究發(fā)現(xiàn)，TMEM175 rs34311866位點(diǎn)的錯義突變(p.M393T)，是SNP中為數(shù)不多的編碼變異之一，也是PD風(fēng)險位點(diǎn)中最重要的變異[28,29]。研究發(fā)現(xiàn)，TMEM175 p.M393T突變體的敲入可導(dǎo)致溶酶體pH值改變，GBA活性降低，磷酸化的α-突觸核蛋白增加并積聚[28]。此外，相對于過表達(dá)的TMEM175降低磷酸化的α-突觸核蛋白含量，TMEM175 p.M393T的過表達(dá)對于磷酸化α-突觸核蛋白的含量無影響[28]?？焖傺蹌铀咝袨檎系K(rapid eye movement(REM)-sleep behavior disorder，RBD)是PD相關(guān)癡呆的獨(dú)立危險因素，大約1/3的PD病人伴隨RBD發(fā)生[30]。研究發(fā)現(xiàn)，TMEM175 p.M393 T與快速RBD(OR=1.59，P=0.001)有關(guān)。而攜帶TMEM175 p.M393 T變異的PD病人，其認(rèn)知能力和運(yùn)動能力亦下降更快，明顯低于無此突變位點(diǎn)的對照人群[30]。而另一種TMEM175 p.Q65P(rs34884217)變異似乎具有保護(hù)作用，在細(xì)胞饑餓時可產(chǎn)生更強(qiáng)的K+通道電流，能夠使神經(jīng)元抵抗損傷，提供神經(jīng)保護(hù)機(jī)制，降低PD發(fā)病風(fēng)險[15]。rs6599389(NC_000004.12:g.945325 G>A，T)是存在于TMEM175內(nèi)含子1中的PD相關(guān)SNP[31]。我們前期對于河南北方帕金森病人群的研究也證實(shí)，該位點(diǎn)與PD發(fā)生的相關(guān)性[32]。c.526A > G(p.176K > E)是一個新確認(rèn)的存在于TMEM175基因組的PD相關(guān) SNP位點(diǎn)。研究顯示，該位點(diǎn)似乎具有亞洲人特異性[33]。因此，作為一種既可能具有保護(hù)性(p.Q65P)又具有風(fēng)險增加(p.M393 T)遺傳意義的K+離子通道，TMEM175可能是PD治療的一個有力靶點(diǎn)。

3 基于跨膜蛋白175靶點(diǎn)的帕金森病治療前景

目前，臨床上 PD 治療有藥物和手術(shù)兩種方式。藥物治療通過增加紋狀體內(nèi)多巴胺(dopamine，DA)濃度進(jìn)行，例如左旋多巴等。但這一方法并非對所有患者有效。此外，大多數(shù)藥物無神經(jīng)保護(hù)活性，不僅無法阻止帕金森病的進(jìn)展[34]，還可能引起患者出現(xiàn)視覺幻覺、運(yùn)動障礙的副效應(yīng)等[35,36]。手術(shù)治療PD 主要采用深部腦刺激(deep brain stimulation，DBS)手段。例如，通過刺激丘腦底核緩解 PD病人的運(yùn)動癥狀。但手術(shù)也可能破壞認(rèn)知和平衡等腦功能[35,36]。因此，治療反應(yīng)和藥物副作用的多樣性促使科學(xué)家們著眼于在分子和細(xì)胞水平上治療PD的探索。以PD風(fēng)險基因?yàn)榘悬c(diǎn)，尋求有效的藥物無疑具有一定的治療前景。

目前，基于帕金森病的研究及藥物大多以溶酶體GBA和α-突觸核蛋白為靶點(diǎn)開展。ibiglustat是一種靶向葡糖神經(jīng)酰胺合成酶(glucosylceramide synthase，GCS)抑制劑，在臨床上已應(yīng)用于攜帶GBA酶缺陷的Gaucher病3型II期病人和攜帶GBA突變的II期PD病人的治療。ibiglustat通過抑制病人體內(nèi)GBA的產(chǎn)生，減少α-突觸核蛋白的累積，緩解疾病的進(jìn)展[37]。另外一種GCS抑制劑NCGC607用于帕金森患者PD病人的臨床治療資料顯示，該藥物降低了來自46 250帕金森氏病患者的誘導(dǎo)多能干細(xì)胞來源的多巴胺能神經(jīng)元的溶酶體內(nèi)底物貯積和α-突觸核蛋白水平[38]。此外，一些小分子化合物，例如亞氨基糖、氨溴索以及GBA其他競爭性抑制劑、非抑制性分子伴侶或非競爭性激活劑等也在不同的疾病模型中被證明能改變GBA的活性，成為治療PD病的潛在藥物[39]。Basu等[40]通過CRISPR技術(shù)建立了一種基于α-突觸核蛋白轉(zhuǎn)錄的內(nèi)源性監(jiān)測報告系統(tǒng)。該系統(tǒng)采用熒光素酶基因標(biāo)記細(xì)胞，使細(xì)胞中α-突觸核蛋白的表達(dá)變化通過熒光素酶活性以發(fā)光形式靈敏呈現(xiàn)，可用于篩選具有帕金森病治療潛能有效藥物。既然TMEM175的缺乏能夠直接影響溶酶體GBA活性以及α-突觸核蛋白的沉積，因此，有理由推測，TMEM175可能作為更重要的靶點(diǎn)，在GBA及α-突觸核蛋白上游發(fā)揮著關(guān)鍵作用。在今后的研究中，建立基于TMEM175靶點(diǎn)的藥物篩選系統(tǒng)，用于帕金森病治療可能具有更加令人期待的治療前景。

4 問題與展望

溶酶體作為細(xì)胞代謝活動的“垃圾回收站”，不僅承擔(dān)著處理細(xì)胞新陳代謝產(chǎn)生的多余或有害物質(zhì)的重要功能，而且發(fā)揮著維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵作用。溶酶體的功能又取決于溶酶體的離子通道和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白質(zhì)的活性，它們通過維持管腔內(nèi)離子動態(tài)平衡影響著溶酶體的功能。TMEM175是一種位于晚期內(nèi)體和溶酶體的K+通道蛋白。已有的遺傳和生理證據(jù)表明，TMEM175異常是PD的潛在風(fēng)險因素。其可能的機(jī)制如Fig.1所示：敲除TMEM175會消除K+電導(dǎo)，導(dǎo)致自噬過程中溶酶體pH穩(wěn)定性下降，使溶酶體中GBA等酶失去活性，溶酶體的功能發(fā)生障礙，繼而影響其對細(xì)胞自噬體的清除，進(jìn)一步造成線粒體耗氧率降低，ATP生產(chǎn)減少，病理性α-突觸核蛋白顯著增加。

Fig.1 The role of TMEM175 in PD TMEM175 deficiency results in unstable lysosomal pH, which led to decreased lysosomal catalytic activity, decreased glucocerebrosidase activity, impaired autophagosome clearance by the lysosome, induced the pathological aggregation of α-synuclein.TMEM175 overexpression could reverse the neuronal lysosomal dysfunction and the pathogenesis of PD

長期以來，離子通道一直是諸多疾病的治療靶標(biāo)，因?yàn)樗鼈儙缀跎婕八兄饕膊〉囊幌盗胁±磉^程[41]。TMEM175既在溶酶體和線粒體功能以及帕金森病的發(fā)病機(jī)制中有關(guān)鍵作用，又在結(jié)構(gòu)上不同于所有已知的通道，具有獨(dú)特的離子選擇性和門控機(jī)制[13-18,28-33]，因此成為帕金森病的一個潛在治療靶點(diǎn)。然而，藥物等一些外在刺激物如何影響TMEM175通道開放和閉合狀態(tài)之間的平衡來調(diào)節(jié)溶酶體的離子穩(wěn)態(tài)，具體機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究探討。此外，考慮到鐵蓄積、氧化應(yīng)激升高和脂質(zhì)過氧化損傷均是PD病理生理的顯著特征，TMEM175表達(dá)的缺乏是否誘導(dǎo)細(xì)胞的炎癥反應(yīng)，或受到α-突觸核蛋白聚集體誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡？在PD病人中，TMEM175是否表達(dá)水平降低，反之，篩選靶向激活TMEM175的激活劑，能否緩解PD的發(fā)生并干預(yù)PD的治療？目前對TMEM175的了解仍然十分缺乏。因此，進(jìn)一步研究該基因的表達(dá)譜及該跨膜蛋白質(zhì)的功能是必要的，未來對該離子通道蛋白質(zhì)的進(jìn)一步研究將為 靶向PD的治療帶來新的策略和思路。