廣西三種真紅樹植物可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性及其生物活性初篩

黎芳婷， 李 蜜， 徐淑芬， 王慧敏， 劉永宏， 高程海

( 廣西中醫(yī)藥大學(xué) 海洋藥物研究院/藥學(xué)院， 南寧 530200 )

紅樹林生境同時兼?zhèn)浜ｊ懱刭|(zhì)，具有高濕度、高鹽、缺氧、強(qiáng)輻射及潮汐等環(huán)境特征。為了獲得生存必需的營養(yǎng)，紅樹林生境中的微生物被迫與紅樹植物共生，導(dǎo)致微生物易產(chǎn)生遺傳變異從而使其物種多樣性豐富，代謝產(chǎn)物活性獨(dú)特。真紅樹植物作為紅樹林生境中的優(yōu)勢種(姜舒等，2020)，是挖掘新菌種和活性菌株的理想載體。廣西紅樹林資源豐富，其面積為全國紅樹林面積的三分之一，其中真紅樹植物有12種(廖寶文和張喬民，2014)，是巨大的微生物資源寶庫。長期以來關(guān)于廣西海域微生物活性物質(zhì)的研究主要集中在紅樹林生境的放線菌，關(guān)于紅樹植物內(nèi)生細(xì)菌的報(bào)道相對較少。姜明國課題組(吳家法等，2017；石松標(biāo)等，2018；王聰?shù)龋?019)和黃大林課題組(黃大林，2013；陳建宏等，2018；鄭紅蕓等，2019)主要致力于對廣西紅樹林生境中放線菌多樣性及其生物活性研究。Jiang等(2018)從廣西北侖河口多種真紅樹植物中分離到101株內(nèi)生放線菌中，一株被鑒定為新種，35株具有顯著的抑菌活性。近年來研究發(fā)現(xiàn)，紅樹植物及其根際淤泥中可培養(yǎng)細(xì)菌也可產(chǎn)生抑菌、抗腫瘤(Gong et al., 2018)和延緩衰老等生物活性的代謝產(chǎn)物。李菲等(2016)從茅尾海無瓣海桑中分離得到38株內(nèi)生細(xì)菌，其中5株為潛在新物種，5株具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性。李家怡等(2017)從廣西山口分離得到17株紅海欖內(nèi)生細(xì)菌，發(fā)現(xiàn)3株潛在新菌，2株對副溶血弧菌具有較強(qiáng)抑菌活性。李蜜等(2020)從徐聞分離到33株真紅樹植物內(nèi)生細(xì)菌，其中10株為潛在新種或新屬，2株有顯著殺線蟲活性。李蜜等(2020)從海南西海岸的14份真紅樹樣品中分離到內(nèi)生細(xì)菌38株，3株對秀麗隱桿線蟲有顯著延緩衰老活性。由此可見，真紅樹植物可培養(yǎng)細(xì)菌物種多樣性豐富，代謝產(chǎn)物活性獨(dú)特，值得我們深入挖掘。研究廣西沿海真紅樹可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性，挖掘新型活性菌株，對完善該海域微生物多樣性及新型活性化合物開發(fā)具有重要意義。

由于抗生素的濫用，導(dǎo)致多種超級細(xì)菌產(chǎn)生，出現(xiàn)越來越多的難治性感染。細(xì)菌耐藥性已經(jīng)成為一場國際性的公共衛(wèi)生危機(jī)，是亟須解決的全球性問題(劉丹華等，2019)，研發(fā)新型抗耐藥菌抗生素迫在眉睫。細(xì)菌是產(chǎn)生抗生素及生物活性物質(zhì)重要微生物資源。蛋白酶、纖維素酶和淀粉酶是高效的生物活性酶，影響生物體的生理活動，在食品、醫(yī)藥和化工等生物技術(shù)方面有巨大的應(yīng)用價值(馬軍等，2016)。紅樹植物共生細(xì)菌多樣性豐富，能產(chǎn)生多種酶活性類物質(zhì)和抗生素類化合物(Ntabo et al., 2018)，是潛在酶活性物質(zhì)及新型抗生素的重要來源。因此，本實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)合適的分離培養(yǎng)基，以期從廣西三種真紅樹植物及其根際淤泥中分離獲得更多未培養(yǎng)細(xì)菌，并分析其可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性。通過篩選可培養(yǎng)細(xì)菌的抑菌和酶活性，為新型抗生素和酶活性物質(zhì)提供菌株資源，并為后續(xù)廣西真紅樹植物資源開發(fā)利用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 為了探究不同地點(diǎn)及植物部位對真紅樹植物可培養(yǎng)細(xì)菌的影響，課題組于2019 年 12月21日在廣西沿海區(qū)域采集三種真紅樹植物的根、莖、葉、花、果實(shí)和泥土，按照不同地點(diǎn)分成22份樣品。具體信息見表1，根部位樣品4份，莖部分6份，葉部分6份，花部分1份，果實(shí)2份，泥土3份。經(jīng)北侖河口紅樹林自然保護(hù)區(qū)吳志鶴鑒定，3種真紅樹分別為秋茄()、木欖()和紅海欖()。

表 1 樣品采樣信息Table 1 Information of collected samples

1.1.2 試劑 16S rRNA基因擴(kuò)增引物對27F(5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′)和1492R(5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′) 購于全式金生物技術(shù)有限公司(中國，北京)；Chelex-100 樹脂，2×Easy Taq Supermix BioRad 購于BioRad公司(美國)；5%的次氯酸鈉溶液購于朗索醫(yī)用消毒劑有限公司(中國，杭州)；其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 培養(yǎng)基 分離培養(yǎng)基：參考李蜜等(2020)方法配制培養(yǎng)基P3、P7、AGG、M5、M7、M9、M10、M11。發(fā)酵培養(yǎng)基：改良 ISP2 液體培養(yǎng)基。酶活性篩選培養(yǎng)基：參考趙雅慧等(2018)方法制作。纖維素酶篩選培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基中加入1%的羧甲基纖維素鈉和1.5%的瓊脂。淀粉酶篩選培養(yǎng)基：LB培養(yǎng)基中加入1%淀粉和1.5%瓊脂。蛋白酶篩選培養(yǎng)基：脫脂奶粉1%，葡萄糖1%，瓊脂1.5%。

1.1.4 指示菌 無乳鏈球菌()NCTC 8181、海豚鏈球菌()CAIM 527、沙門氏菌()。以上指示菌均由華南農(nóng)業(yè)大學(xué)張曉勇課題組提供。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 樣品的處理 參考李蜜等(2020)的方法，真紅樹植物樣品用5%次氯酸鈉溶液浸泡8 min，無菌水沖洗干凈， 75%乙醇中浸泡5 min，無菌水沖洗至無乙醇味。取以上樣品約2 g于無菌研缽中，加入2 mL無菌海水研勻即得原液。參考李菲等(2018)的方法，泥土樣品除去雜質(zhì)，取約2.0 g于裝有20 mL無菌水(內(nèi)有玻璃珠)的錐形瓶中，放入搖床搖勻，充分均質(zhì)即得原液。所有樣品原液置于4 ℃冰箱保存。選取M7、P7、M11、M10、M5、AGG、P3、M9 8種分離培養(yǎng)基，取樣品的10懸液100 μL涂布(李蜜等，2020)。

1.2.2 可培養(yǎng)細(xì)菌的分離純化、鑒定、保藏 參考吳家法等(2017)的方法，將分離培養(yǎng)平板置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)2～8周。長出細(xì)菌后，挑取質(zhì)地光滑的單菌落，三線法在ISP2純化培養(yǎng)基分離純化，直至獲得純凈菌株，記錄菌株數(shù)量及其形態(tài)特征。參考 Chelex-100 法(周雙清等，2010)提取已純化細(xì)菌的基因組 DNA，參照Walsh等(1991)的方法對細(xì)菌基因組DNA進(jìn)行PCR梯度擴(kuò)增。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測陽性擴(kuò)增產(chǎn)物委托上海美吉生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司廣州分公司進(jìn)行測序。經(jīng)DNA Star 軟件整理16S rRNA基因測序結(jié)果，用數(shù)據(jù)庫EzBioCloud(http://www.eztaxon.org/)(2009)及 Blast 網(wǎng)站進(jìn)行相似性比對。純化的菌株保藏于 20%(V/V)甘油管中，置于-80 ℃超低溫冰箱中保存。

1.2.3 細(xì)菌發(fā)酵粗提物的活性篩選

1.2.3.1 細(xì)菌發(fā)酵及粗提物提取 參考李蜜等(2020)的方法發(fā)酵可培養(yǎng)細(xì)菌，離心收集的發(fā)酵液用等體積的乙酸乙酯萃取，減壓蒸干乙酸乙酯層，用甲醇溶解收集，揮干甲醇即得細(xì)菌發(fā)酵粗提物，置于4 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3.2 細(xì)菌抑菌實(shí)驗(yàn) 檢定板的制備：參考許敏等(2016)的方法，將生長良好的指示菌接種于裝有50 mL已滅菌LB液體培養(yǎng)基的三角瓶中，180 r·min搖床培養(yǎng)9 h得到對數(shù)生長期的指示菌混懸液，取混懸液加入滅菌后低于55 ℃的LB(A)培養(yǎng)基中，稀釋成0.3%的濃度。滅菌的LB固體培養(yǎng)基傾注到培養(yǎng)皿中，凝固后，再傾注一層加有指示菌的培養(yǎng)基，待其凝固即得檢定板。

紙片擴(kuò)散法進(jìn)行抑菌活性檢測：參考曾臻和譚強(qiáng)來(2019)的方法，用甲醇溶解配成20 mg·mL的細(xì)菌發(fā)酵粗提物，吸取5 μL至直徑為6 mm的無菌濾紙片上(加入5 μL甲醇的濾紙片作陰性對照)，揮干甲醇，貼于檢定板表面，于37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察并記錄抑菌圈的大小，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，計(jì)算抑菌圈平均值。

1.2.3.3 細(xì)菌酶活性實(shí)驗(yàn) 酶活性菌株的篩選：參考楊桂柳等(2015)的方法，點(diǎn)植法將對數(shù)生長期的細(xì)菌接種于相應(yīng)的酶活性平板培養(yǎng)基上，28 ℃恒溫培養(yǎng)4～6 d，觀察細(xì)菌生長情況和菌落周圍是否出現(xiàn)透明圈，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果與分析

2.1 三種真紅樹植物可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性分析

經(jīng)菌落形態(tài)排重和16S rRNA基因測序比對分析，共獲得35株可培養(yǎng)細(xì)菌。35株菌株分布在23個科28個屬，35株可培養(yǎng)細(xì)菌物種組成如表2所示。其中，芽孢桿菌屬()占菌株總數(shù)14.3%，屬于優(yōu)勢菌屬，此結(jié)果與其他學(xué)者研究相同(韓敏敏等，2020)，這表明芽孢桿菌屬占紅樹植物微生物統(tǒng)治地位。Kim等(2014)認(rèn)為16S rRNA基因序列相似性小于98.65%的菌株有80%為潛在新物種。對三種真紅樹植物可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行新穎性分析，發(fā)現(xiàn)35株細(xì)菌中有 11株細(xì)菌的16S rRNA基因序列相似性低于98.65%，分別為GXIMD 7462、GXIMD 7066、GXIMD 7477、GXIMD 7064、GXIMD 7063、GXIMD 7115、GXIMD 7761、GXIMD 7498、GXIMD 7121、GXIMD 7463、GXIMD 7518，可能為潛在新物種，圖1為潛在新菌與相似度最高對照菌的N-J系統(tǒng)進(jìn)化樹。11個潛在新物種隸屬于9科11屬，其中GXIMD 7477 和GXIMD 7761分別與纖維單胞菌屬的巴基斯坦纖維單胞菌()和屬的相似度最高，可能為稀有放線菌。說明真紅樹植物可培養(yǎng)細(xì)菌多樣性豐富，可為研究生物活性物質(zhì)提供良好的菌株資源。

圖 1 潛在新菌的16S rRNA基因序列N-J系統(tǒng)發(fā)育樹Fig. 1 N-J phylogenetic tree of 16S rRNA gene sequences of potential new bacteria

表 2 35株可培養(yǎng)細(xì)菌的物種組成Table 2 Species composition of 35 strains of culturable bacteria

2.2 35株細(xì)菌在不同真紅樹植物、植物部位及培養(yǎng)基中的分布

不同植物種類及不同植物生境影響其可培養(yǎng)細(xì)菌的豐富程度。如圖2所示，從不同樣品中分離得到細(xì)菌多樣性依次是木欖3>紅海欖>秋茄2>秋茄1>木欖2>木欖1。3株木欖均采集于防城港，但分離到的菌株種類及數(shù)量不同，可能由于植物采集時的老嫩程度及所取的植物組織部位差異所致。兩株秋茄分別采樣于北海海域兩個采樣點(diǎn)，采集地點(diǎn)不一致，分離到的細(xì)菌種屬數(shù)量和物種完全不同。秋茄1(F1)分離得到的8株細(xì)菌為喜鹽噬冷菌()、、特基拉芽孢桿菌()、越南芽孢桿菌()、海水紀(jì)氏菌()、sp.、植物內(nèi)微球菌()、殺珊瑚橙色單胞菌()，秋茄2(F2)分離獲得的細(xì)菌為拉氏無色桿菌()、、暹羅芽孢桿菌()、枯草芽孢桿菌()、、、、、，兩株秋茄植物共有細(xì)菌屬為芽孢桿菌屬，其余均為各自的特有屬。由此可見，真紅樹植物生長不同階段及植物生境差異可顯著影響其可培養(yǎng)細(xì)菌物種多樣性。

圖 2 不同植物分離得到的可培養(yǎng)細(xì)菌分布情況Fig. 2 Distribution of culturable bacteria isolated from different plants

不同部位的細(xì)菌多樣性不同。由圖3可知：從6份植物組織莖中分離獲得11株可培養(yǎng)細(xì)菌，隸屬于9個屬；4份植物組織根中分離得到的10株細(xì)菌隸屬于9個屬；3份泥土樣品分離得到的10株細(xì)菌隸屬于7個屬；6份植物組織葉中分離得到的8株細(xì)菌隸屬于8個屬；1份植物組織花中分離得到的2株細(xì)菌隸屬于2個屬；2份果實(shí)中分離得到1株細(xì)菌。本研究從植物組織莖中分離得到的細(xì)菌數(shù)量及多樣性均最多，從果實(shí)中分離得到的細(xì)菌最少。

圖 3 不同部位分離得到的可培養(yǎng)細(xì)菌分布情況Fig. 3 Distribution of culturable bacteria isolated from different parts

不同培養(yǎng)基分離得到的細(xì)菌多樣性依次是M10 > M11 = P3 > AGG > M9 > P7 >M5 > M7 (圖4)。由此可見，M10(棉籽糖-L-組氨酸培養(yǎng)基)和M11(葡萄糖-酸水解酪素培養(yǎng)基)培養(yǎng)基分離獲得的細(xì)菌數(shù)量和物種多樣性均有較明顯的優(yōu)勢，可能是L-組氨酸和酸水解酪素等物質(zhì)能滿足細(xì)菌生長的營養(yǎng)需求。此結(jié)果與其他學(xué)者的研究有所區(qū)別，李蜜等(2020)從海南西海岸紅樹林伴生植物分離到的放線菌中，M7培養(yǎng)基得到的放線菌數(shù)量最多，而M11培養(yǎng)基分離到的放線菌最少。可能由于放線菌和細(xì)菌生長所需的必要營養(yǎng)成分不同，今后可選用M7、M10和M11培養(yǎng)基作為分離培養(yǎng)紅樹可培養(yǎng)細(xì)菌的主要參考培養(yǎng)基。

圖 4 不同培養(yǎng)基分離得到的可培養(yǎng)細(xì)菌分布情況Fig. 4 Distribution of culturable bacteria isolated from different media

表 3 4株有抑菌活性細(xì)菌的抑菌檢測結(jié)果Table 3 Results of antibacterial test of four antibacterial active bacteria

2.3 三種真紅樹植物可培養(yǎng)細(xì)菌粗提物生物活性分析

2.3.1 可培養(yǎng)細(xì)菌的抑菌活性分析 無乳鏈球菌和海豚鏈球菌是人畜共患的致病菌，可給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成巨大損失，感染人體可導(dǎo)致腦膜炎等疾病，病死率較高。由于抗生素的濫用，無乳鏈球菌對青霉素、磺胺二甲基嘧啶和鏈霉素等普遍耐藥，這一問題亟須解決。用濾紙片擴(kuò)散法對細(xì)菌發(fā)酵粗提物，進(jìn)行抑菌活性篩選，共篩選獲得4株可培養(yǎng)細(xì)菌的發(fā)酵粗提物，其中至少對一種指示菌有抑制活性，陽性率為11.4%。如表3所示，菌株GXIMD 7747、GXIMD 7027和GXIMD 7518同時對無乳鏈球菌和海豚鏈球菌有抑制作用，GXIMD 7498同時對沙門氏菌和海豚鏈球菌有抑制作用?；钚跃闓XIMD 7498與菌株最高相似度分別為97.91%，來源于木欖3(F5)的莖；GXIMD 7518與菌株鞘氨醇單胞菌() 最高相似度為98.31%，來源于木欖2(F4)的葉子。這兩株活性菌株可能為潛在新物種，說明新型菌株在挖掘新化合物領(lǐng)域具有重要的開發(fā)價值。

2.3.2 可培養(yǎng)細(xì)菌的酶活性分析 蛋白酶、淀粉酶和纖維素酶是生物活性物質(zhì)，與人類生活密切相關(guān)，在醫(yī)藥食品及化工業(yè)等領(lǐng)域具有巨大的市場潛力。通過選育酶活性的細(xì)菌，可大規(guī)模發(fā)酵制備蛋白酶、纖維素酶和淀粉酶活性物質(zhì)。真紅樹植物可培養(yǎng)細(xì)菌酶活性結(jié)果如表4所示，共獲得16株至少有一種酶活性的可培養(yǎng)細(xì)菌，陽性率為45.7%，芽孢桿菌屬對酶活性比較敏感。菌株暹羅芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、特基拉芽孢桿菌和微桿菌()同時具有淀粉酶、蛋白酶和纖維素酶活性，占酶活性總菌株數(shù)的25%。16株酶活性菌株中，2株同時具有蛋白酶和淀粉酶活性，占酶活性菌株的12.5%(圖5)。1株同時具有淀粉酶和纖維素酶活性，占酶活性菌株的6.25%；有2種以上酶活性的菌株有7株，占酶活性菌株的43.75%；具有纖維素酶活性的菌株最多，有13株，占酶活性菌株的81.25%；具有蛋白酶和淀粉酶活性的菌株均為7株，占酶活性菌株43.75%。以上結(jié)果表明真紅樹植物可培養(yǎng)細(xì)菌具有顯著的酶活性，以纖維素酶活性尤為突出。后續(xù)通過優(yōu)化發(fā)酵條件，可以生產(chǎn)酶活性物質(zhì)應(yīng)用于醫(yī)藥、食品及化工領(lǐng)域。

表 4 紅樹植物可培養(yǎng)細(xì)菌酶活性結(jié)果Table 4 Results of enzyme activities of culturable bacteria in mangrove plants

圖 5 酶活性結(jié)果分析維恩圖Fig. 5 Venn diagram of enzyme activity result analysis

3 討論與結(jié)論

隨著陸地資源的不斷開發(fā)，普通環(huán)境下篩選具有獨(dú)特活性的新菌種越來越困難。因此，紅樹林特殊生境中的微生物資源逐漸引起研究者的關(guān)注。本研究利用8 種不同營養(yǎng)成分的分離培養(yǎng)基對22份真紅樹植物組織及根際淤泥可培養(yǎng)細(xì)菌進(jìn)行分離純化， 盡可能豐富未培養(yǎng)和難培養(yǎng)紅樹微生物資源，共獲得35株菌株，分布在23個科28個屬。兩株秋茄分別采樣于北海海域兩個采樣點(diǎn)，分離到的細(xì)菌種屬數(shù)量和物種完全不同。原因是紅樹林特殊的環(huán)境迫使細(xì)菌與紅樹植物共生，地點(diǎn)不同，紅樹林生境會有所差別，因此不同地點(diǎn)的同一種紅樹植物可培養(yǎng)細(xì)菌具有地點(diǎn)特異性。本研究中從植物組織莖中分離得到的細(xì)菌數(shù)量及多樣性均最多，從果實(shí)中分離得到的細(xì)菌最少，此結(jié)果與魏玉珍等(2010)、李家怡等(2017)及李蜜等(2020)研究結(jié)果有所差別，可能是由于樣品采集地點(diǎn)和季節(jié)影響不同植物組織細(xì)菌的多樣性(解修超，2007)，也可能與選取的植物組織數(shù)量差異及樣品處理方式有關(guān)。針對廣西沿海同一種真紅樹植物組織對其可培養(yǎng)細(xì)菌的分布及生物學(xué)特征是否有特異性影響，還需進(jìn)一步探索。就物種新穎性分析，分離獲得11株細(xì)菌16S rRNA基因序列相似性低于98.65%的潛在新菌種，分布于秋茄的根和莖、木欖的葉以及紅海欖的根部位，分別在M7、P7、M11、M10、M5、AGG、P3、M9培養(yǎng)基上培養(yǎng)出來，其中有5株從寡營養(yǎng)的燕麥粉瓊脂培養(yǎng)基P3上培養(yǎng)獲得，說明紅樹林特殊生境中，共生較多寡營養(yǎng)細(xì)菌，P3培養(yǎng)基可以作為發(fā)現(xiàn)真紅樹植物潛在新菌的主要參考培養(yǎng)基。后續(xù)對潛在新菌進(jìn)行多項(xiàng)分類鑒定，可為挖掘新的活性化合物提供菌源。

菌株GXIMD 7477、GXIMD 7027和GXIMD 7518發(fā)酵粗提物同時對無乳鏈球菌和海豚鏈球菌有抑制作用，GXIMD 7518同時具有抑菌和酶活性，這說明細(xì)菌的代謝產(chǎn)物中可能同時存在具有多種活性化合物，也可能是一種化合物有多種活性，后續(xù)可以進(jìn)一步探究?；钚跃闓XIMD 7498與菌株最高相似度為97.91%，從木欖3(F5)莖組織的M9培養(yǎng)基中分離得到，抑菌活性菌株GXIMD 7518與菌株鞘氨醇單胞菌()最高相似度為98.31%，從木欖2(F4)葉組織的M5培養(yǎng)基中分離到，這兩株活性菌株可能為潛在新物種。說明針對細(xì)菌生長所必需養(yǎng)分，通過設(shè)計(jì)多種不同成分的培養(yǎng)基分離純化不同樣品的可培養(yǎng)細(xì)菌，更容易分離得到未培養(yǎng)的潛在活性新菌種。前人研究發(fā)現(xiàn)，酶活性菌株GXIMD 7132暹羅芽孢桿菌能產(chǎn)生促進(jìn)植物生長的吲哚乙酸(Suliasih & Widawati, 2020)，可用作消毒劑，對抗浮游細(xì)菌和生物膜駐留細(xì)菌(Awan et al., 2020)。由此可見，本研究分離得到的活性菌株有開發(fā)成藥物和生物技術(shù)產(chǎn)品的潛力。廣西真紅樹植物可培養(yǎng)細(xì)菌的物種多樣性豐富，后續(xù)通過優(yōu)化活性菌株發(fā)酵條件，運(yùn)用化學(xué)分離方法，分離粗提物中類抗生素和酶活性物質(zhì)，可為研究新型抗生素及開發(fā)水產(chǎn)養(yǎng)殖藥物提供新的藥效基礎(chǔ)物質(zhì)，在食品、醫(yī)藥以及化工業(yè)等方面有一定開發(fā)潛能。