lncRNA TUG1對人牙髓干細胞成骨/成牙本質分化的影響

人牙髓干細胞（human dental pulp stem cells，hDPSCs）源自于遷移的神經(jīng)嵴細胞，于2000 年首次從人牙髓中分離和鑒定，具有高度增殖、自我更新和多向分化等間充質干細胞的特性

。其取材方便、易于擴增保存、活性高，能在特定條件下分化為多種組織細胞，是干細胞治療中極有潛力的細胞來源

，在再生醫(yī)學領域中具有廣闊的應用前景。?；撬嵘险{基因1（taurine upregulated 1，TUG1）是一種長鏈非編碼RNA，位于第22 號染色體上，最早由學者Young 等

從小鼠視網(wǎng)膜細胞中發(fā)現(xiàn)，被認為是視網(wǎng)膜細胞發(fā)育和光感受器形成的重要參與者。有學者發(fā)現(xiàn)TUG1 可促進骨髓間充質干細胞

以及牙周膜細胞

成骨向分化。但TUG1在hDPSCs的增殖及成骨/成牙本質向分化過程中的表達水平和功能作用尚未見報道。本研究旨在通過感染慢病毒構建沉默TUG1 的hDPSCs，探究TUG1對hDPSCs 的增殖及成骨/成牙本質分化的影響。

1 材料和方法

1.1 主要材料和儀器

α-MEM 培養(yǎng)基（Procell，中國），青霉素-鏈霉素、胰酶細胞消化液、堿性磷酸酶（alkaline phospha-tase，ALP）顯色試劑盒（Beyotime，中國），胎牛血清（vivacell，意大利），地塞米松、維生素C、茜素紅染色液（Solarbio，中國），β-甘油磷酸鈉（Macklin，中國），Ⅰ型膠原酶（Biofroxx，德國），CD44、CD45、CD73、CD90、CD133、STRO-1 抗體（Ebioscience，美國），甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phos-phate dehydrogenase，GAPDH）抗體（Abcam，英國），兔抗人DPSS 抗體（Abcam，英國），兔抗人DMP-1抗體（Abcam，英國），兔抗人Runx2 抗體（Abcam，英國），兔抗人OCN 抗體（Abcam，英國），兔抗人OPN抗體（Abcam，英國），山羊抗兔二抗（Proteintech，美國），4%多聚甲醛（Biosharp，中國），CCK-8 試劑盒（Dojindo，日本），氯化十六烷吡啶（Sloarbio，中國），BCA 蛋白濃度測定試劑盒（Beyotime，中國），ALP測定試劑盒（南京建成，中國），SteadyPure 快速RNA 提取試劑盒、Evo M-MLV 反轉錄預混型試劑盒、SYBR Green Pro Taq HS 預 混 型qPCR 試 劑 盒（Accurate，中國）。

1.2 hDPSCs 的分離培養(yǎng)和鑒定

本研究已取得西南醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院倫理委員會批準（批號：20220531002）。牙髓組織來源于西南醫(yī)科大學附屬口腔醫(yī)院頜面外科，采用酶消化組織塊法提取hDPSCs。患者及家屬知情同意后，拔除因正畸要求拔除的前磨牙，于無菌條件下劈開牙齒，取出牙髓，立即用含青霉素-鏈霉素的PBS 梯度沖洗，剪碎牙髓組織，加入Ⅰ型膠原酶（3 g/L），15 min 后加入完全培養(yǎng)基，低速離心后棄上清液，將消化后的組織塊接種于培養(yǎng)瓶底后倒置培養(yǎng)瓶，加入完全培養(yǎng)基，于37 ℃、體積分數(shù)5% CO

條件下培養(yǎng)，4 h 組織塊貼壁后翻轉培養(yǎng)瓶，每隔3 d 換液，細胞長至瓶底80%后傳代。取第3 代hDPSCs 流式細胞儀檢測表面標志物CD44、CD45、CD73、CD90、CD133、STRO-1。取 第3 代hDPSCs 于6 孔板，成骨誘導7 d 進行ALP 染色，成骨誘導21 d 進行茜素紅染色觀察。

1.3 qRT-PCR 檢測hDPSCs 中TUG1 的表達

取第3 代hDPSCs 于6 孔板，分別于成骨誘導0、7、14 d 提取細胞總RNA，測得RNA 濃度，逆轉錄獲得cDNA，實時定量擴增，檢測成骨過程中TUG1的表達變化，實驗重復3 次。

1.4 慢病毒轉染

慢病毒sh- TUG1 載體pSLenti-U6-shRNA（TUG1）-CMV-EGFP-F2A-Puro-WPRE 由上海和元技術股份有限公司提供，sh-TUG1 序列為：5′-GCTTGGCTTCTATTCTGAATCCTTT-3′；取第3 代的hDPSCs 接種至6 孔板中，待細胞長至50%時進行轉染，根據(jù)轉染說明書，慢病毒滴度為3.78×10

TU/mL，通過轉染預實驗測定其感染復數(shù)為40；加入5 mg/L 聚凝胺提高轉染效率，12 h 后換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。48 h 后使用熒光顯微鏡觀察綠色熒光蛋白的表達，確認感染成功后加入4 mg/L嘌呤霉素篩選穩(wěn)定轉染株。根據(jù)病毒轉染情況將細胞分為3 組：①空白對照組（NC 組）：未轉染處理的hDPSCs；②陰性對照組（sh-NC 組）：感染無序列質粒載體慢病毒的hDPSCs；③實驗組（sh-TUG1組）：感染sh-TUG1 慢病毒的hDPSCs。

1.5 CCK-8 檢測細胞增殖活性

按試劑盒步驟分別提取成骨誘導7 d 時3 組細胞總RNA，測得RNA 濃度，去除基因組DNA，逆轉錄獲得cDNA，實時定量擴增，檢測成牙本質及成骨分化相關的基因牙本質涎磷蛋白（dentin sialoph-osphoprotein，DSPP），牙本質基質蛋白-1（dentine matrix protein 1，DMP-1），Runt 相關轉錄因子2（runt-related transcription factor 2，Runx2），骨鈣素（osteo-calcin，OCN）、骨橋蛋白（osteopontin，OPN）的基因表達，實驗重復3 次。目的基因的相對表達量使用2

方法計算得出。引物序列見表1。

式中：Q為加熱器加熱功率，W；M1為熱箱外壁熱流系數(shù)，W/K；M2為試件框熱流系數(shù)，W/K；Δθ1為熱箱外壁內外表面面積加權溫度平均溫度之差，K；Δθ2為試件框熱側冷測表面面積加權平均溫度之差，K；S1為填充用絕熱板的面積，m2；Δ1為填充用絕熱板的熱導率,W/(m2·K)；Δθ3為填充用絕熱板表面的平均溫差，K；A為試件面積，m2；Δt為熱箱與冷箱空氣平均溫度之差，K.

1.6 ALP 染色及定量檢測

MRI的T2像雖較CT敏感，但在LA的早期單純依靠肉眼觀察尚無法分辨出明顯信號改變，近年來新的磁共振成像技術開始用于LA的早期診斷。

將NC 組、sh-NC 組和sh-TUG1 組細胞分別接種于6 孔板中，待細胞貼壁后更換為成骨誘導培養(yǎng)基。成骨誘導7 d，按ALP 顯色試劑說明書配置染液，染色15 min，在倒置顯微鏡下觀察。將成骨誘導7 d 的細胞裂解，BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定總蛋白質濃度，ALP 定量試劑盒檢測樣本內細胞ALP 活性，實驗重復3 次。

1.7 茜素紅染色及定量檢測

hDPSCs 具有多向分化潛能，可以在特定條件下分化為牙本質

、牙周組織

、骨

、神經(jīng)組織

和皮膚組織

等多種組織細胞，可用于牙本質及骨組織再生等研究領域，目前已成為組織再生與工程領域的研究熱點。

1.8 qRT-PCR 檢測成牙本質及成骨分化相關基因mRNA 水平

將NC 組、sh-NC 組和sh-TUG1 組細胞分別接種于96 孔板，每孔2×10

個。在1、3、5、7 d 進行CCK-8檢測。去除原培養(yǎng)基，添加CCK-8 混合工作液，在避光條件下孵育1 h，酶標儀在450 nm 處測定吸光度值，實驗重復3 次。

基于靈敏度分析的參數(shù)模型修正基本思路是通過構造理論模型與實際結構之間在相同條件下動態(tài)特性的誤差，然后選擇修正參數(shù)進行修正，以盡量縮小理論模型與實際結構之間的誤差為目的，最終獲得一個較為精確的有限元模型。要實現(xiàn)此目標，首先初始模型需要建立得盡量準確，避免結構上的誤差；其次要設法提高試驗數(shù)據(jù)的精度；同時要開發(fā)穩(wěn)定高效的修正算法。目前，使用較多的算法是二次規(guī)劃優(yōu)化算法，其在仿真算例的應用中，收斂速度快、修正效率高、修正結果準確可信。但在解決工程實際問題時，由于目標函數(shù)的構建問題，無法得到一個較為準確的有限元模型。

1.9 Western blot 檢測hDPSCs 成牙本質及成骨分化相關蛋白含量

成骨誘導培養(yǎng)7 d，ALP 染色及定量檢測結果顯示sh-TUG1 組著色較NC 組（

= 0.002）和sh-NC組（

= 0.006）淺，而NC 組和sh-NC 組間無明顯差異（圖5），說明沉默TUG1 后hDPSCs 早期ALP 活性減弱。

1.10 統(tǒng)計學分析

hDPSCs 成骨誘導0、7、14 d，分別收集細胞提取總RNA 進行qRT-PCR 檢測TUG1 含量相對變化，結果顯示，TUG1 的含量在成骨誘導過程中逐漸增加，相較于0 d，成骨誘導7 d（

= 0.001）、14 d（

＜0.001）時，TUG1 mRNA 表達明顯升高，差異有統(tǒng)計學意義（圖2）。

2 結 果

2.1 hDPSCs 的分離培養(yǎng)和鑒定

組織塊培養(yǎng)5～7 d 后顯微鏡下可見細胞沿組織塊邊緣爬出（圖1a），呈放射狀生長；傳至第3 代時觀察細胞呈長梭形，胞核明顯，呈旋渦狀生長（圖1b）。流式細胞術檢測細胞高表達間充質來源的表面標志物CD44、CD73、CD90、CD133、STRO-1，低表達造血組織來源的表面標志物CD45（圖1c）。ALP 和茜素紅染色顯示成骨誘導后的ALP 活性強（圖1d）且具有礦化結節(jié)生成能力（圖1e）。

2.2 TUG1 在hDPSCs 成骨分化過程中上調

用SPSS 19.0分析數(shù)據(jù)，計量資料的組間比較采用單因素方差分析，

＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

1.2 病例診斷及監(jiān)測 80年代開始，對臨床診斷為瘧疾、疑似瘧疾、疑似感冒及其他原因不明的發(fā)熱病人（稱“四熱病人”）采血涂片鏡檢［2］，以血檢瘧原蟲陽性者統(tǒng)計發(fā)病率。2006年以后診斷依據(jù)根據(jù)中華人民共和國衛(wèi)生行業(yè)標準之瘧疾診斷標準（WS259-2006）。

3)白城站20種天氣模態(tài)下逐日降水量預測模型的MAE為0.08～7.94 mm,RMSE為0.25～11.86 mm。降水量越大,模型的MAE和RMSE也越大。在第4類最不容易發(fā)生降水的天氣模態(tài)下,MAE和RMSE都不超過1 mm。在第1類最容易發(fā)生降水的天氣模態(tài)下,最大逐日降水量都超過60 mm,MAE為7～8 mm,RMSE為11～12 mm。

2.3 構建沉默TUG1 的hDPSCs

熒光顯微鏡觀察慢病毒感染hDPSCs 48 h 后，細胞表達綠色熒光（圖3a、3b），表明慢病毒成功感染hDPSCs，qRT-PCR 證實感染慢病毒后TUG1 沉默效率高于60%（

＜0.001）（圖3c）。

2.4 沉默TUG1 抑制hDPSCs 的增殖

通過CCK-8 法檢測細胞的增殖能力（圖4），與NC 組相比，sh-NC 組hDPSCs 的增殖能力未發(fā)生明顯變化（

＞0.05），在5 d（

= 0.001 0）、7 d（

=0.001 1）、9 d（

= 0.004 0）時，sh-TUG1 組hDPSCs的增殖能力減弱（

＜0.05）。

2.5 沉默TUG1 后抑制hDPSCs 的ALP 活性及礦化結節(jié)的形成

在成骨誘導7 d 時，提取3 組細胞蛋白并測定其濃度，SDS- PAGE 凝膠電泳，轉膜90 min，5%脫脂奶粉室溫封閉1 h，加一抗，（DSPP，1∶500；DMP-1，1∶1 000；RUNX2，1∶2 000；OCN，1∶1 000；OPN，1∶1 000；GAPDH，1∶10 000），4 ℃振蕩過夜。TBST 潤洗3 遍后加入二抗（1∶10 000），37 ℃孵育1 h，顯影成像，Image J（National Institute of Mental Health，美國）軟件分析結果，實驗重復3 次。

成骨誘導培養(yǎng)21 d，茜素紅染色及定量檢測結果顯示NC 組（

= 0.005）和sh-NC 組（

= 0.005）礦化結節(jié)形成能力明顯高于sh-TUG1 組，而NC 組和sh-NC 組間無明顯差異（圖6）。說明沉默TUG1 后hDPSCs 晚期礦化結節(jié)形成能力減弱。

2.6 沉默TUG1 后hDPSCs 成骨/成牙本質相關基因和蛋白表達水平下調

成骨誘導7 d，qRT-PCR 和Western blot 技術檢測各組細胞中成牙本質分化相關基因（DSPP、DMP-1）以及成骨分化相關基因（Runx2、OCN、OPN）的mRNA 和蛋白含量變化（圖7），和NC 組相比，sh-NC 組細胞內成牙本質及成骨分化相關基因的mRNA 和蛋白含量未發(fā)生明顯變化（

＞0.05）；相較NC 組和sh-NC 組，sh-TUG1 組成牙本質及成骨分化相關基因的mRNA 和蛋白表達降低（

＜0.05）。

3 討 論

將NC 組、sh-NC 組和sh-TUG1 組細胞分別接種于6 孔板中，待細胞貼壁后更換為成骨誘導培養(yǎng)基。成骨誘導21 d，用0.2%茜素紅染液染色30 min，倒置顯微鏡下觀察。超純水清洗3 次，加入氯化十六烷基吡啶溶液，避光30 min，將上清液置于96 孔板中，酶標儀在562 nm 處測定吸光度值，實驗重復3 次。

lncRNA 是一類長度超過200 bp、不編碼蛋白質的RNA

。近年來，高通量測序技術的進步提高了對細胞中l(wèi)ncRNA 及其復雜信號網(wǎng)絡的認識。lncRNA 可參與多種生物學過程，如染色質調控和基因表達

。在胚胎干細胞中l(wèi)ncRNA 具有調節(jié)細胞周期、維持細胞的多向分化潛能的作用，也可能參與細胞的更新和分化

。此外，大量研究已證明lncRNA 在間充質干細胞骨形成調控中的不同作用，例如，lncRNA XIXT 通過miRNA-30a-5p 上調RUNX2，從而誘導hBMSCs 成骨緩解骨質疏松。lncRNA HOTAIRM1 通過調節(jié)JNK/AP-1 信號介導的RUNX2 表達來促進成骨分化

。

TUG1 是一個7.1 kb 的lncRNA，首次在發(fā)育中的小鼠視網(wǎng)膜細胞中發(fā)現(xiàn)，對牛磺酸處理反應上調

。研究發(fā)現(xiàn)TUG1 在人類多種癌癥中表達上調，促進癌細胞增殖、遷移和侵襲，抑制細胞凋亡，是一個新發(fā)現(xiàn)的致癌基因。近年來研究發(fā)現(xiàn)沉默TUG1 會顯著抑制主動脈瓣鈣化疾病下破骨細胞的形成，且TUG1 通過miR-204-5p 上調RUNX2 基因表達，促進主動脈瓣鈣化疾病中的成骨細胞分化

。Teng 等

發(fā)現(xiàn)TUG1 在骨質疏松癥中下調，影響骨髓間充質干細胞的成骨分化。Lu 等

進一步研究發(fā)現(xiàn)TUG1 通過調控AMPK/mTOR/自噬通路促進骨髓間充質干細胞的成骨分化。Hao 等

發(fā)現(xiàn)TUG1 促進了成骨前體細胞的增殖，且通過miR-545-3p 上調CNR2 促進成骨前體細胞的成骨分化。Liu 等

發(fā)現(xiàn)沉默TUG1 后成骨經(jīng)典通路Wnt/β-catenin 通路重要標志物Runx2、Frizzled-2、Axin2和β-catenin 表達下調。以上這些研究表明TUG1在干細胞成骨分化過程中起著重要作用。但TUG1 在hDPSCs 成骨/成牙本質向分化過程中的表達水平和作用尚未見報道。

本研究成功分離并鑒定hDPSCs，發(fā)現(xiàn)TUG1 在hDPSCs 成骨分化中明顯增加。為驗證TUG1 對hDPSCs 增殖和成骨/成牙本質分化的調控作用，利用慢病毒感染技術體外成功構建沉默TUG1 的hDPSCs。發(fā)現(xiàn)沉默TUG1 后hDPSCs 增殖被抑制。通過ALP 和茜素紅染色及定量檢測發(fā)現(xiàn)在成骨誘導條件下，沉默TUG1 抑制hDPSCs 的早期ALP 活性和晚期礦化結節(jié)形成能力。通過qRT-PCR 檢測驗證了TUG1 抑制hDPSCs 內DSPP、DMP-1、Runx2、OCN 和OPN 等基因的表達。DSPP 是牙本質中最豐富的非膠原蛋白

，DMP-1 為成牙本質細胞分化早期的標志

，均在牙本質的形成及礦化中起到重 要 作 用。Runx2 是 成 骨 分 化 早 期 標 志

。Sheng 等

發(fā)現(xiàn)lncRNA TUG1 通過RUNX2 促進骨肉瘤的發(fā)展，Du 等

發(fā)現(xiàn)沉默lncRNA TUG1 通過Runx2/ANPEP 增強氧化低密度脂蛋白處理的人臍靜脈內皮細胞的增殖和遷移，促進動脈粥樣硬化血管損傷的修復。OPN 和OCN 分別是成骨分化中晚期和晚期的標志

。Teng 等

發(fā)現(xiàn)與健康對照組相比，骨質疏松患者血漿中TUG1 表達明顯降低，miR-23b 表達明顯增加。此外，miR-23b 表達增加可抑制RUNX2、骨鈣素和骨橋蛋白的表達。在本實驗中發(fā)現(xiàn)沉默TUG1 抑制了hDPSCs 向成牙本質細胞及成骨細胞的分化。

2.2 中耕除草 應根據(jù)豆苗生育狀況及田間雜草多少而定進行2～3次中耕。第一次中耕以第一片真葉出現(xiàn)時為宜，中耕深度不宜超過3.5厘米；第二次中耕可在出現(xiàn)3～4片復葉，子葉發(fā)黃時進行，深度為4.5厘米；第三次中耕一般在苗高20厘米左右時，開花前進行，宜淺耕，并結全培土，培土高度以略高于子葉節(jié)為準。

本實驗探討了TUG1 在hDPSCs 成骨過程中的表達水平以及對增殖和成骨/成牙本質分化的影響，但TUG1 對hDPSCs 增殖和分化的調控機制及體內實驗仍有待進一步研究。

繪本，顧名思義就是“畫出來的書”，也就是指圖文相互有機結合的書籍?，F(xiàn)在市面上的繪本圖書以兒童閱讀為主，內容涉及也很廣，文學、科學、教育等等。近年來，市場上出現(xiàn)了成人繪本，以臺灣繪本家?guī)酌椎淖顬榛馃?，還有錢海燕、寂地等都是以成人繪本創(chuàng)作為主的。這些成人繪本中有很大一部分屬于治愈系繪本。

【

】 Jiang YX performed the experiments and wrote the article. Sun LH collected the data. Zhang H assisted in the da-ta statistics. Li ST assisted in the experimental design. Feng H designed the experiments and reviewed the article. All authors read and approved the final manuscript as submitted.

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