• <tr id="yyy80"></tr>
  • <sup id="yyy80"></sup>
  • <tfoot id="yyy80"><noscript id="yyy80"></noscript></tfoot>
  • 99热精品在线国产_美女午夜性视频免费_国产精品国产高清国产av_av欧美777_自拍偷自拍亚洲精品老妇_亚洲熟女精品中文字幕_www日本黄色视频网_国产精品野战在线观看 ?

    金鐵鎖三萜皂苷生物合成及分子機理分析

    2022-09-06 11:40江舟
    現代園藝 2022年16期
    關鍵詞:皂苷五環(huán)酵母

    江舟

    (云南中醫(yī)藥大學,云南昆明 650500)

    金鐵鎖(Psammosilenetunicoides W.C.Wu et C.Y.W u)為石竹科金鐵鎖屬多年生單種屬植物,生產地主要集中在云南、四川等西南地區(qū),是當地一種特有藥用植物?!兜崮媳静荨返谝淮斡涗浟私痂F鎖,其根入藥,可以起到散瘀、止痛以及消炎之效,是云南白藥的一個重要組成部分。之前針對金鐵鎖研究中,主要是對其有效成分開展研究,結果發(fā)現,成分主要為齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷類物質。金鐵鎖在開采中完全依靠的是野生植物,同時這一植物生長非常緩慢,資源較少,長期開采進一步降低了野生資源,產量更低。當前,金鐵鎖已被納入到《中國植物紅皮書》中。金鐵鎖天然資源有限,同時三萜皂苷結構非常復雜,在應用中無法有效滿足市場需求,急需尋找和擴大新的資源途徑。

    隨著深入三萜合成途徑研究,大量研究表明,三萜類的生物合成可以分為3 個階段,分別為前體的形成、骨架構建以及后期修飾,合成前體主要為乙酰輔酶A,再將其通過甲羥戊酸途徑(MVA),實施一系列合成酶催化后可以合成三萜類骨架,進一步對其實施萜類后期修飾酶,在繼續(xù)對骨架實施結構修飾后,可以得到三萜類皂苷化合物。其中在萜類生物合成途徑中,主要依靠關鍵酶的催化作用,直接影響萜類次生代謝的最終產物[1]。首次植物萜類關鍵酶基因克隆報道出現在20 世紀末,已經實現對多種藥用植物萜類化合物關鍵酶基因的鑒定,并完成了克隆。啟動子(promoter)是特定的DNA 序列,常位于基因5'端上游,是重要的基因調控元件,RNA 聚合酶(RNA polymerase,RNA poly)能夠準確識別啟動子,并結合在啟動子特定位點上進行啟動轉錄。啟動子一般情況下采用的是GCN4-motif、G-box、TATA-box、CGTCA-motif 等順式作用調控元件,不但可以在種子中實現特異表達,也可以實現對MeJA 或脫落酸等激素的響應,所以不管是在種子萌發(fā)、衰老,還是在產物合成等生物過程中,都可以起到重要的基因表達調控作用。如使用不同濃度的茉莉酸甲酯(methyljas monate,MeJA)誘導調控刺五加啟動子(Eleutherococcus senticosus L.MDD mevalonate diphosphate decarboxylase)從而實現調控相應皂苷類化合物的含量。其中在調控萜類合成酶基因啟動子表達過程中,也會直接影響植物萜類產物合成,在分析過程中針對藥用植物次生代謝相關功能基因啟動子實施克隆,并進一步實施藥物分析,更有助于了解藥用植物的萜類合成機制[2]。目前,對金鐵鎖三萜皂苷生物合成途徑中鯊烯環(huán)氧酶基因的克隆與調控已有一定的研究和報道,但金鐵鎖鯊烯環(huán)氧酶(squalene epoxidase,SE)基因上游啟動子對鯊烯環(huán)氧酶基因表達和轉錄的調控作用機理仍是未知領域[3]。本次在針對金鐵鎖三萜皂苷分子機理分析基礎上,探討其生物合成技術,以此揭示SE 啟動子在金鐵鎖齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷合成過程中所具備的生物機理,為利用生物合成手段獲得中藥有效成分,提高瀕危藥用植物重要藥用次生代謝化合物的含量提供研究基礎。

    1 金鐵鎖三萜皂苷分子機理

    在金鐵鎖中通過分離鑒定,可以得到的三萜皂苷主要為五環(huán)三萜類成分,通過分析金鐵鎖皂苷母核結構,發(fā)現其分布為齊墩果酸型,經過調控可以轉化為3 位(R1)以及28 位(R2)接長度不同的糖鏈。一般情況下,金鐵鎖苷元為絲石竹酸或皂角酸,之間不會出現太大改變。在對其實施分離后所得產物為3—0—6'-0 一甲基一13 一D 葡萄糖醛酸絲石竹苷,測定發(fā)現在原藥材中的含量為3.75%。通過金鐵鎖根也可以實現對兩個齊墩果烷五環(huán)三萜皂苷的分離鑒定,最終分離產物為齊墩果烷-3α,16α-二羥基-12 烯-23-酸-28-O-β-D-葡萄吡喃糖基(1—3)-β-D-葡萄吡喃糖基(1—6)-β-D-葡萄吡喃糖甙(Ⅰ)和齊墩果烷-3α,16α-二羥基-12 烯-23-酸-28-O-β-D-葡萄吡喃糖基1—6[-β-D-葡萄吡喃糖基(1—3)-β-D-葡萄吡喃糖甙(Ⅱ)。進一步針對金鐵鎖根部的三萜皂苷成分實施,鑒定后所得產物為9 個齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷(見圖1)。

    圖1 三萜皂苷類化舍榜1-9 的母核結構

    三萜類化合物的組成為6 個異戊二烯結構單元聯(lián)結所得,大部分為五環(huán)三萜形式,同時也存在有30 個碳原子。五環(huán)三萜皂苷元碳架存在有以下類型,分別為:齊墩果烷型、木栓烷型、羽扇豆烷型等。在中草藥中,三萜類化合物是重要組成成分之一,相應的生物合成途徑即為甲羥戊酸(MVA)途徑。

    2 金鐵鎖三萜皂苷生物合成

    2.1 金鐵鎖皂苷合成途徑

    MVA 途徑是植物體內皂苷實施生物合成的主要途徑,在合成過程中將乙酰輔酶A 作為主要供體,乙酰輔酶A 通過一系列步驟,比如縮合、還原后也會合成MVA,之后繼續(xù)對其實施焦磷酸化、脫水等處理會生成異戊二烯焦磷酸(IPP),所生成物質能夠構成為二甲丙烯焦磷酸(DMAPP),通過香葉二磷酸合成酶(GPS)的作用,可以促進IPP 及DMAPP 合成新物質櫳牛兒基焦磷酸(GPP),進而在基焦磷酸合酶(FPS)影響下,可以促進IPP 與GPP 頭尾連接下的轉化,生成法尼基焦磷酸(FPP),在鯊烯合成酶(SQS)的作用下能夠轉變?yōu)橄⊿Q),繼續(xù)實施氧化處理能夠獲取2,3-氧化鯊烯,通過氧鯊烯環(huán)化酶(OSC)的影響,且對其實施相應的處理,其中包括質子化、重排以及去質子化等,可以將其轉變?yōu)椴煌娜乒羌埽M而受到糖基轉移酶(GT)、細胞色素P450 單加氧酶(CYP450)以及B 一糖苷酶等共同修飾影響,最終形成特定三萜皂苷[4]。在金鐵鎖中所分離的皂苷,大部分是為齊墩果烷型五環(huán)三萜皂,隨其實施SQS 處理可以轉變?yōu)槿魄绑wSQ,將其合成2,3-氧化鯊烯,最后在β-香樹素合成酶(-AS)作用下能夠合成五環(huán)三萜皂苷的骨架-香樹素。

    在合成途徑中,SQS 對兩分子FPP 起催化作用,在頭對頭方式下合成SQ;SQE 對鯊烯具有催化作用,可以在C=C 雙鍵間增添氧原子,進而將其轉化為環(huán)氧化物,合成2,3-氧化鯊烯;2,3-氧化鯊烯在受到OSC 家族催化作用下,可以將其轉變?yōu)榻Y構功能不同的植物甾醇以及三萜類骨架,在三萜皂苷生物合成過程中為關鍵酶;植物三萜合成途徑中,CYP450 的作用即為后修飾,能夠對其合成發(fā)揮羥基化及氧化等作用,可實現對不同種類底物的催化,但在此過程中也需要有多個CYP450s參與,才能夠合成最后產物;GT 在對皂苷元與糖產生催化作用中,可以實現和糖苷鍵的相連,與之同時也具備高度轉移性,實現對不同糖基或糖基受體的轉移,在此過程中相應的糖基轉移酶也存在差異。在生物合成途徑中,SQS、SQE、OSC 后修飾酶都是非常重要的酶,然而在三萜、甾醇、膽固醇等萜烯類物合成過程中SQ 為共同前體,在這些物質形成過程中SQ 為重要步驟之一,同時SQS 含量以及活性直接影響之后產物生成量[5]。2,3-氧化鯊烯在-AS 催化作用下,能夠形成母核-香樹素,是以上物質形成中的重要分支步驟之一。通過以上分析可知,兩個酶都在重要分支步驟上,同時對催化物質前后結構存在較大影響。當前,在針對SQS 以及-AS 研究過程中,重點是關于基因克隆以及表達展開分析,在基因工程手段應用下實現對SQS 以及-AS 表達的調控,以此獲得產物,截至目前甘草、人參以及青蒿等植物SQS 以及-AS 都已經成功被克隆和表達。在本次研究前期已進行了金鐵鎖的轉錄組測序工作,并已克隆鑒定了金鐵鎖齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷生物合成途徑中的鯊烯環(huán)氧酶(SE)關鍵酶基因長的全長cDNA。

    2.2 金鐵鎖皂苷合成生物學

    2.2.1 常用菌株。在合成生物學中,當前可作底盤菌株的微生物種類較多,主要可以將其分為兩大類,分別為具有遺傳背景的微生物以及阿維菌素產出的微生物。前者常用的有鏈霉菌、大腸桿菌;后者常用的有阿維鏈霉菌、惡臭假單胞菌等。

    2.2.2 底盤菌株釀酒酵母。在合成生物學中,釀酒酵母遺傳背景清晰,應用中的優(yōu)點主要為發(fā)酵密度大、遺傳改造,另外,還擁有較為成熟的發(fā)酵方法、具有較高生物安全性等,所以在工業(yè)生產中的應用較為廣泛,尤其是在遺傳學分析、基因工程等中的應用較為廣泛。釀酒酵母體中所含成分,可以提供MVA 途徑,進而促進萜類化合物的合成,也可以進一步完成麥角甾醇為主要產物固醇類物質的代謝合成,所以可在β-香樹素等高修飾型外源天然產物生產中得到應用,所在生產天然產物底盤工程菌株中的應用較為廣泛。當前實施釀酒酵母基因工程菌建構中,研究重點主要集中在細胞工程高產所需有效成分上,同時已經具備較多完成天然產物細胞工程建構的實際案例,比如Keasling 團隊在酵母中,通過合成生物學的應用成功實現了對青蒿素前體物青蒿酸的合成,且產量能夠達到25g/L。在青蒿酸生物合成路線上,釀酒酵母菌的應用路線已經較為清晰,進而提出了相關的基因調控方法,以能夠在酵母代謝工程菌的應用下實現對青蒿酸的合成,產量能夠達到100mg/L,在此基礎上,能夠大量合成青蒿素前體物質,這一物質對抗瘧疾藥物的主要成分。另外,也有學者在研究過程中,通過釀酒酵母底盤細胞中,有效針對原人參二醇生物合成建構了相應途徑。在實驗過程中通過建構釀酒酵母工程菌株,可以實現對藥用有效成分及其中間體的迅速生產,便于促進瀕危藥材的保護以及利用。另外,在釀酒酵母的應用下,也可以有效完成人參中原人參二醇合成酶基因CYP716A47 異源表達鑒定菌株的建構。在此基礎上,真正實現人參中達瑪烯二醇合成酶基因PgDDS 和原人參二醇生物合成酶基因CYP716A47 的異源共表達,可見,在CYP716A47 的應用下實現對目標化合物的生產。

    通過以上分析可知,釀酒酵母的應用也為三萜皂苷異源代謝合成提供了相應的表達系統(tǒng),有助于實現工程中的三萜皂苷異源工業(yè)化生產以及發(fā)展。本次研究中主要分析金鐵鎖三萜皂苷合成下游途徑,也可以將釀酒酵母作為底盤菌株。

    3 結語

    綜上所述,針對金鐵鎖三萜皂苷生成中,可以在合成生物學的應用下在微生物體內完成重建,進而一一解析其藥用有效成分的生物合成途徑,也可以進一步深入挖掘及調控生物合成途徑以及關鍵酶基因,也有助于提升藥用植物的有效成分含量,進一步提升中藥材品質,能夠為重要的良種選育、質量管控等提供相應的技術支持。另外,在直接發(fā)酵法的應用下,將金鐵鎖三萜皂苷人工細胞有效成分實施生產,也是取得新資源的有效方式,進一步補充這一理論研究。

    猜你喜歡
    皂苷五環(huán)酵母
    三七總皂苷腸溶微丸的含量測定及體外釋放度考察
    常吃含酵母的食物會傷胃嗎
    Effects of Different Extract of Pseudostellaria Heterophylla on Immunological Function in Mice based on Meta-analysis and Network Meta-analysis
    安琪酵母:全球第三、亞洲第一、兩市唯一
    安琪酵母:全球第三、亞洲第一、兩市唯一
    為什么奧林匹克以五環(huán)為標志?
    日本原裝進口的健康食品
    在線二維柱切換高效液相色譜法同時測定牙膏中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、Re和Rb1
    五環(huán)數陣
    談生產中的酵母清洗
    义马市| 和林格尔县| 红原县| 台中县| 玉龙| 和林格尔县| 象山县| 刚察县| 那曲县| 铜山县| 射阳县| 龙山县| 和静县| 崇明县| 泽州县| 扎兰屯市| 集贤县| 应用必备| 龙胜| 普格县| 高陵县| 错那县| 陇川县| 潼关县| 西城区| 马山县| 六枝特区| 兴山县| 成安县| 黑水县| 北京市| 潜山县| 广河县| 佛山市| 保德县| 五指山市| 台安县| 南宁市| 耿马| 镇平县| 永平县|